戊型肝炎病毒跨物种侵染遗传进化及持续性感染对宿主细胞的影响

论文摘要

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是一种引起人兽共患病的RNA病毒,HEV跨物种侵染以及持续性感染一直都是研究热点。我国是养猪大国,饲养者与猪群发生近距离接触以及猪肉制品的食用都大大增加了HEV从猪及其肉制品传播给人群的风险几率。我们利用血清学、分子生物学、细胞生物学以及生物信息学分析手段开展了猪源和人源HEV遗传进化特征以及HEV持续性感染对细胞影响的相关研究,为今后进一步开展HEV遗传进化以及宿主抗病毒机制提供参考依据。本研究首先对我国7个省份的猪群进行了HEV血清学调查。结果发现,这7个省份养猪场猪群感染过HEV的比例较高,其中育种猪是HEV传播的高风险因素,饲养猪龄在HEV传播过程中也扮演着重要作用,但是饲养猪群的地理环境不影响HEV的传播。首次从甘肃省猪群中获得genotype（gt）4e亚型HEV毒株基因组序列,这与我国目前报道的HEV在人群和猪群中流行的基因型为gt 4是相符的,这进一步说明猪源HEV对我国公共卫生存在一定威胁。鉴于较高程度HEV在猪群中的流行态势对人类健康带来的现实威胁,我们利用生物信息学方法对比了猪源和人源HEV在分子进化上的异同点,发现在同义密码子使用模式上gt 1、gt 3和gt 4 HEV毒株开放阅读框（open reading frames,ORFs）同义密码子使用模式均存在遗传学差异,但是gt 1 HEV ORF具有的同义密码子使用模式呈现出基因型特异性,这种密码子使用偏嗜性强于无论是人源还是猪源的gt 3和gt 4 HEV毒株。对于gt 3和gt 4 HEV毒株来说,猪源HEV毒株比人源HEV毒株在密码子使用模式上更加适应人和猪的密码子使用模式。这在进化层面上表明HEV在面对宿主施加的选择压力下表现出适应宿主细胞环境的进化倾向。为了进一步分析HEV在适应宿主细胞的过程中对细胞在整体生物学功能方面的影响程度,我们利用HEV持续性感染细胞模型和转录组分析手段分析了HEV持续性感染对宿主细胞的影响后发现,病毒对所侵染细胞代谢通路相关基因转录水平的影响较大,这也说明持续性感染状态下的细胞与病毒在某种程度上进行了“妥协”。然而,被感染细胞也会利用自身免疫反应来抵抗HEV对其造成的持续性感染。在检测的14种免疫基因转录水平变化中,I、II和III型IFN基因的转录水平均显著上调,以及ISG15、ISG56和MX1基因的转录水平显著升高。与此同时,我们还发现IL-6这种与抗病毒和炎症反应相关的白细胞介素在HEV持续性感染中也显著性上调了其转录水平。此外,在病毒性肝炎中具有重要免疫学活性的趋化因子CCL5和CXCL10基因转录水平显著提升,其中CXCL10基因的转录水平上调的幅度最高,说明与CXCL10相关的抗病毒免疫反应在HEV持续性感染过程中发挥着重要作用。基于上述所发现的IL-6、CCL5以及CXCL10在HEV持续性感染中转录水平的显著性变化,这为今后研究人员基于这些细胞因子作为靶点为临床治疗提供一些新的思路。本研究结果拓宽了HEV跨宿主传播过程中分子进化以及持续性感染过程中病毒-细胞互作的认知,为理解猪源HEV侵染人体所具备的遗传特征以及宿主细胞应对HEV持续性感染的各种反应机制提供了可以参考的信息。

论文目录

摘要

summary

第一章戊型肝炎病毒的研究进展

1 国内外研究进展

1.1 HEV结构特征

1.1.1 HEV病毒分子生物学特征

1.1.2 病毒RNA的种类

1.1.3 HEV基因组遗传多样性

1.2 HEV蛋白产物

1.2.1 ORF

1.2.2 甲基化转移酶（Methyltransferase）

1.2.3 蛋白酶

1.2.4 解旋酶

1.2.5 RNA依赖性RNA聚合酶

1.2.6 Macro domain

1.3 ORF2 编码的结构蛋白

1.3.1 基因表达与糖基化修饰

1.3.2 自组装与病毒颗粒

1.3.3 与靶细胞互作

1.4 ORF3 编码的非结构蛋白

1.4.1 蛋白产物亚细胞定位

1.4.2 蛋白结构域与生物功能

1.4.3 病毒体形成与释放过程中的作用

1.5 HEV生命周期与基因组复制

1.6 抗病毒靶点

1.7 HEV的分子流行及遗传特性

1.7.1 HEV的流行特点

1.7.2 导致HEV基因型1和2 流行爆发的因素

1.7.3 导致人源HEV基因型3和4 流行爆发的因素

1.8 HEV侵染机体后的免疫应答

1.8.1 天然免疫抗击HEV感染

1.8.2 适应性免疫对HEV的抵抗作用

1.8.3 HEV疫苗的研发

1.9 展望

第二章 HEV感染猪群血清学调查及基因组序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清以及粪便样品的采集

1.1.2 主要试剂和溶液

1.1.3 仪器设备

1.2 方法

1.2.1 HEV血清学的ELISA检测

1.2.2 HEV感染的风险评估

1.2.3 从粪便样品中扩增HEV基因组序列

1.2.4 建立HEV基因组的遗传进化树

1.2.5 HEV基因组中ORF核酸与密码子使用模式的分析

1.2.6 对应分析解析HEV ORF在密码子与氨基酸使用的遗传特征

2 结果

2.1 HEV在猪群中感染的血清学阳性率

2.2 猪龄和饲养用途与HEV感染猪群相关

2.3 从粪便样品中扩增获得的HEV swCH189 毒株的基因组序列

2.4 HEV swCH189 毒株属于genotype

2.5 HEV swCH189 毒株ORF的核酸与密码子使用模式

2.6 HEV swCH189 毒株ORF密码子与氨基酸的使用模式

3 讨论

本章小结

第三章猪源HEV与人源HEV的密码子模式分析

1 材料与方法

1.1 HEV基因组信息

1.2 方法

1.2.1 密码子使用偏嗜性分析（Parity rule2 analysis）

1.2.2 不同基因型HEV ORF对同义密码子使用模式的分析

1.2.3 HEV ORF同义密码子使用的总体偏嗜性分析

1.2.4 HEV ORF与宿主在密码子使用模式比对分析

2 结果

2.1 HEV ORF的密码子存在核苷酸使用偏嗜性

2.2 HEV ORF在密码子使用方面具有基因型特异性

2.3 HEV ORF密码子使用模式对宿主呈现不同程度的适应性

3 讨论

本章小结

第四章 HEV持续性感染对细胞转录水平的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞

1.1.2 试剂

1.1.3 实验仪器

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

1.2.2 HEV持续性感染Huh7 细胞的转录组分析

1.2.3 文库制备及测序

1.2.4 转录组数据分析

2.结果

2.1 差异表达基因筛选

2.2 差异表达基因聚类分析

2.3 差异基因GO富集分析

2.4 与HEV在 Huh7 细胞中持续性感染相关的KEGG富集分析

3 讨论

本章小结

第五章宿主细胞对HEV持续性感染的抗病毒作用

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒

1.1.2 试剂

1.1.3 仪器与设备

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

1.2.2 qRT-PCR检测所用特异性引物设计

1.2.3 qRT-PCR（SYBR Green法）

1.2.4 Huh7-P6 细胞上清液对病毒持续性感染的影响

1.2.5 Huh7-P6 细胞上清液含有内源IFN的检测

1.2.6 Western Blot检测HEV持续性感染中IRF3及STAT1 磷酸化水平的影响作用

1.2.7 外源IFN对 HEV持续性感染的抗病毒作用

1.2.8 外源IFN对 Huh7-P6 细胞活性的影响

2 结果

2.1 Ⅰ型 IFN对 HEV持续性感染的反应

2.2 Ⅱ型 IFN对 HEV持续性感染的反应

2.3 Ⅲ型 IFN对 HEV持续性感染的反应

2.4 IL-6对HEV持续性感染的反应

2.5 ISG15对HEV持续性感染的反应

2.6 ISG56对HEV持续性感染的反应

2.7 MX1、OASL以及TNF-α对 HEV持续性感染的反应

2.8 趋化因子CCL5及CXCL10对HEV持续性感染的反应

2.9 Huh7-P6 细胞培养液的上清液对HEV持续性感染的影响

2.10 Huh7-P6 细胞上清中IFN的含量测定

2.11 HEV持续性感染对IRF3和STAT1 磷酸化水平的影响

2.12 外源IFN对 HEV持续性感染的抵抗作用

3 讨论

本章小结

全文结论

参考文献

致谢

作者简介

导师简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 周建华

导师: 胡永浩

关键词: 戊型肝炎病毒,跨物种传播,持续性感染,分子进化,免疫反应

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 甘肃农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000015

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