一株非致病性血清1型禽腺病毒生物学特性分析及单克隆抗体的制备

论文摘要

腺病毒是一种常用的研制重组病毒的载体,国内外目前研究比较深入的是人和哺乳动物腺病毒载体,而对于禽腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）作为载体的研究较少。本研究拟分离鉴定血清1型禽腺病毒（FAdV-1）,并对其进行生物学特性研究,为进一步研制以FAdV为载体的重组病毒疫苗奠定基础。此外,还制备针对FAdV-1的单克隆抗体,为建立检测FAdV-1的方法提供基础材料。1.血清1型禽腺病毒的分离鉴定及生物学特性分析本研究从健康鸡群采集泄殖腔拭子,以FAdV通用引物Hex-F1/R1进行PCR检测。阳性样品经绒毛尿囊膜接种鸡胚分离病毒,病毒在鸡肝癌细胞系（LMH）上增殖培养,直至产生稳定细胞病变。在LMH细胞上增殖的病毒经空斑纯化,PCR鉴定并测序,序列经比对分析确定病毒血清型,然后进行生物学特性分析。我们从50份样品中分离到一株FAdV-1,命名为FAdV-1 JS2017。病毒在LMH上可以产生细胞变圆,折光性增强的典型FAdV细胞病变。进一步用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测病毒滴度为6.34×107copies。经电镜观察病毒粒子为球型、无囊膜,直径为70～90 nm。设计34对引物,对JS2017全基因组序列进行扩增、测定及生物信息学分析,JS2017基因组全长为43739 bp,G+C含量为54.29%,包括34个ORF编码区,含有54 nt的末端倒置重复序列（ITR）。JS2017与FAdV-1参考毒株CELO株、61/11Z株、JM1/1株、W-15株同属一个大的进化分支,核苷酸序列同源性分别为99.3%、99.7%、99.3%、99.6%。一周龄SPF鸡通过肌肉注射106.86TCID50 JS2017病毒液进行人工致病性试验,试验鸡未出现任何明显临床症状。感染10d后进行剖检,喉头、气管、心脏、肝脏、肌胃、肾脏等内脏器官未发现肉眼可见病变。组织病理学切片观察发现各脏器组织结构无明显异常。排毒检测结果表明,感染7d达到排毒高峰,并且在肝脏、肾脏中也能够检测到病毒。这些结果表明FAdV-1 JS2017株无致病性,复制能力强。在FAdV-1 JS2017株基因组右末端40000 bp～43620 bp的复制非必需区两端设计引物扩增同源臂,通过带有同源臂序列和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的转移质粒pFAd1-EGFP与FAdV-1 JS2017株在LMH细胞内同源重组,缺失掉同源臂序列之间的复制非必需区而替换为EGFP基因的完整表达盒。FAdV-1 JS2017株感染LMH细胞2h后,转移载体pFAd1-EGFP通过脂质体转染的方法转染LMH细胞,并用空斑纯化的方法纯化重组病毒,成功获得了一株稳定表达EGFP的重组病毒FAd1-EGFP,该结果表明缺失FAdV-1 JS2017株基因组右末端复制非必需区,不影响其在LMH细胞上的稳定复制,为进一步研制以FAdV为载体的重组病毒疫苗奠定基础。2.FAdV-1单克隆抗体的制备在LMH细胞上增殖FAdV-1JS2017,收取病毒液,初步纯化后免疫BALB/c小鼠。抗体效价达到1:25600,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合。JS2017病毒液经超速离心纯化后作为抗原包被酶标板,利用建立的间接ELISA方法进行杂交瘤细胞的筛选及亚克隆后杂交瘤细胞的检测,获得9株针对FAdV-1的杂交瘤细胞株。用原核表达的FAdV-1六邻体蛋白作为抗原包被酶标板,对9株杂交瘤细胞株进行鉴定,得到5株针对FAdV-1六邻体蛋白能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D11、3C7、6G8、9D6、12H7。进一步经纯化的FAdV-4和FAdV-8b分别作为抗原,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验、Westem-blot对上述5株杂交瘤细胞株进行鉴定,结果显示6G8和9D6能够与FAd V-4和FAdV-8b发生特异性反应。本研究获得5株能稳定分泌抗FAdV-1六邻体蛋白的单克隆抗体,其中6G8和9D6同时与FAdV-1、FAdV-4和FAdV-8b发生特异性反应,这些单抗为以后建立检测FAdV-1的方法提供基础材料。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词表

文献综述禽Ⅰ群腺病毒研究进展

1 禽Ⅰ群腺病毒的分类

2 形态学及理化特性

3 禽Ⅰ群腺病毒基因组结构特点

4 禽Ⅰ群腺病毒主要蛋白及功能

5 禽Ⅰ群腺病毒的流行病学与致病性

6 禽Ⅰ群腺病毒载体研究进展

第一章一株非致病性血清1型禽腺病毒生物学特性分析

1. 材料

1.1 样品、细胞、鸡胚、动物

1.2 主要实验试剂

1.3 主要仪器设备

2. 方法

2.1 病毒的分离与鉴定

2.1.1 样品的处理

2.1.2 病毒DNA提取

2.1.3 PCR扩增与检测

2.1.4 PCR产物的克隆及序列测定

2.1.5 鸡胚病毒分离

2.1.6 病毒在LMH细胞上的适应性培养

2.1.7 空斑纯化试验

2.1.8 病毒形态学观察

2.2 分离株全基因组序列的测定及分析

2.2.1 引物的设计与合成

2.2.2 病毒DNA的提取

2.2.3 目的片段的PCR扩增及检测

2.2.4 PCR产物的克隆与鉴定

2.2.5 序列测定与分析

2.3 致病性试验

50测定'> 2.3.1 病毒TCID₅₀测定

2.3.2 动物试验

2.4 表达绿色荧光蛋白（EGFP）的重组FAdV-1的构建

2.4.1 转移载体p-UD的构建

2.4.2 转移载体pFAd1-EGFP的构建及鉴定

2.4.3 重组病毒的制备与纯化

3 结果

3.1 病毒的分离鉴定

3.1.1 PCR产物鉴定及序列测定

3.1.2 鸡胚分离病毒

3.1.3 病毒在LMH细胞上的病变

3.1.4 空斑纯化

3.1.5 病毒形态学观察

3.2 病毒全基因组序列的测定及分析

3.2.1 各片段基因序列的测定

3.2.2 全基因组序列的分析

3.2.3 全基因组序列遗传进化分析

3.3 致病性试验

50测定'> 3.3.1 病毒TCID₅₀测定

3.3.2 临床症状及剖检变化

3.3.3 排毒检测

3.3.4 病理组织学变化

3.4 表达绿色荧光蛋白（EGFP）的重组FAdV-1的构建

3.4.1 转移载体p-UD的构建

3.4.2 转移载体pFAd1-EGFP的鉴定

3.4.3 重组病毒的制备

3.4.4 重组病毒的纯化

4 讨论

第二章血清Ⅰ型禽腺病毒单克隆抗体的制备

1 材料

1.1 病毒、细胞及实验动物

1.2 主要生物试剂

1.3 主要实验仪器

2 方法

2.1 抗原的制备

2.1.1 全病毒抗原的制备

2.1.2 FAdV-1六邻体蛋白的原核表达

2.2 间接ELISA方法的建立

2.3 动物免疫

2.4 细胞融合杂交瘤细胞的筛选

2.5 杂交瘤细胞的扩大培养及冻存

2.6 FAdV-1单克隆抗体的鉴定

2.6.1 间接ELISA鉴定

2.6.2 间接免疫荧光鉴定

2.6.3 Western-blot鉴定

2.6.4 稳定性测定

2.7 腹水的制备与纯化

2.7.1 腹水的制备

2.7.2 腹水的纯化

2.7.3 单克隆抗体效价测定

3. 结果

3.1 抗原的制备

3.1.1 全病毒抗原的制备

3.1.2 FAdV-1六邻体蛋白的原核表达

3.2 间接ELISA方法的建立

3.3 融合前免疫小鼠血清抗体效价的测定

3.4 阳性杂交瘤细胞的筛选

3.5 杂交瘤细胞的亚克隆

3.6 FAdV-1单克隆抗体的鉴定

3.6.1 间接ELISA的鉴定

3.6.2 间接免疫荧光试验

3.6.3 Western-blot鉴定

3.7 单克隆抗体稳定性的测定

3.8 单克隆抗体效价测定

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张梦迪

导师: 吴艳涛,张小荣

关键词: 禽群腺病毒,分离鉴定,生物学特性,重组病毒,单克隆抗体

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家蛋鸡产业技术体系项目(CARS-40-K16),扬州大学“高端人才支持计划”(2016年度),江苏高校优势学科建设工程资助项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000325

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