根瘤菌属五个新种的多相分类研究

论文摘要

根瘤菌是豆科作物、牧草、树种生长最重要的共生伙伴之一,它通过共生固氮作用为豆科植物提供氮素营养,从而促进植物生长和作物增产。充分利用这种共生固氮体系,对农牧业可持续发展具有重要意义。菜豆是豆科作物中重要的引进作物之一,前期通过对226株菜豆根瘤菌进行多样性和比较基因组学研究,发现在中国大面积种植后,与菜豆建立起共生固氮关系的根瘤菌类群增多,其中7株菌与已发现的类群不同,属于潜在新种。本研究采用结合系统发育分析、基因组分析、表型和生理生化研究、化学成分鉴定等的多相分类方法,对这7株菌进行系统研究,以确定它们的分类地位并命名,研究结果如下:16S rRNA基因序列分析结果显示,7株菌都属于Rhizobium属。持家基因atpD、glnⅡ、recA以及串联序列（atpD-glnⅡ-recA）系统发育树显示,这7株菌形成5个进化分支,彼此相互独立且明显区别于Rhizobium属各已知种。Rhizobium属相关模式株与这5个类群之间的串联序列相似性为89.795.3%,均低于96%,表明这7株菌为潜在的5个Rhizobium属新种,其中菌株C5和C16代表同一个新种,菌株M10和M1代表同一个新种,菌株L9、L18和L43则各自代表一个新种。与持家基因分析结果不同,共生基因nodC和nifH的系统发育树形成的分支与菌株宿主植物具有对应的关系,与其分类地位无关。基于菌株全基因组序列的ANI和dDDH计算发现,5个新种代表菌株与Rhizobium属模式株之间ANI的范围为87.6694.15%,dDDH的范围为31.854.5%,均低于阈值（95%和70%）;使用UBCG构建供试菌株与模式菌株92个核心基因的系统发育树发现,UBCG树的拓扑结构与串联序列系统发育树中的相似,进一步证实了这些菌株为新种。5个新种基因组的GC含量均在61%左右,在Rhizobium属菌株GC含量范围内（5766%）。对5个新种菌株进行了包括形态特征与培养特征观察、生理生化测定、交叉结瘤测试以及脂肪酸组分等一系列研究,发现它们形态及培养特征相似,但在一些生理生化特征如抗生素耐药性、碳源利用、酶活性等方面存在差异;交叉结瘤测试结果表明,这些新种仅能够与原宿主菜豆以及大豆有效共生结瘤,结瘤范围较窄;脂肪酸组成类似于Rhizobium属其他菌株,其中C18:0和Summed Feature 8为共同主要脂肪酸,在其他脂肪酸组成及比例方面,各菌株之间存在差异。综上,本论文确定了Rhizobium属内5个新种,暂命名为:Rhizobium leguminoides,模式菌株为L43T;Rhizobium phaseoloides,模式菌株为L18T;Rhizobium etloides,模式菌株为L9T;Rhizobium mazuyanense,模式菌株为M10T;Rhizobium chutanense,模式菌株为C5T（已发表）。研究不仅丰富了根瘤菌资源库,也为豆科植物接种根瘤菌提供更充足的种质资源。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 引言

1.2 细菌分类的发展和趋势

1.2.1 细菌分类的发展

1.2.2 多相分类技术在细菌研究中的应用

1.2.3 细菌分类学研究趋势

1.2.4 细菌的分类系统

1.3 基因组在微生物分类中的应用

1.3.1 dDDH分析

1.3.2 平均核苷酸一致性分析

1.3.3 DNA G+C mol%的计算

1.3.4 核心基因分析

1.4 根瘤菌的概况

1.4.1 根瘤菌的概述及其与豆科植物的共生固氮

1.4.2 根瘤菌分类的研究进展

1.4.3 根瘤菌新种的确定方法

1.5 研究内容

1.6 研究意义

1.7 菌株分类鉴定流程

第二章 16S rRNA基因、持家基因及共生固氮基因的系统发育研究

2.1 试验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 供试菌株总DNA的提取与检测

2.2.2 目的基因PCR扩增及测序

2.2.3 系统发育分析及序列相似性计算

2.3 试验结果与分析

2.3.1 16S rRNA基因系统发育分析

2.3.2 持家基因系统发育分析

2.3.3 共生基因系统发育分析

2.4 讨论

第三章全基因组序列分析

3.1 试验材料

3.1.1 供试菌株

3.1.2 仪器设备

3.2 试验方法

3.2.1 供试菌株总DNA的获得与序列测定

3.2.2 DNA杂交值（dDDH）

3.2.3 基因组平均核苷酸一致性（ANI）及DNA碱基组成（G+C mol%）

3.2.4 UBCG系统发育分析

3.3 试验结果与分析

3.3.1 基因组测序结果

3.3.2 dDDH、ANI和DNA G+C mol%

3.3.3 UBCG树

3.4 讨论

第四章表型特性研究与交叉结瘤试验

4.1 试验材料

4.1.1 供试菌株

4.1.2 仪器设备

4.2 试验方法

4.2.1 菌落形态特征观察

4.2.2 细胞形态特征观察

4.2.3 生理生化特征研究

4.2.4 交叉结瘤试验

4.3 试验结果与分析

4.3.1 菌落形态与细胞形态

4.3.2 生理生化的测定结果

4.3.3 交叉结瘤试验结果

4.4 讨论

第五章菌株脂肪酸组分分析

5.1 试验材料

5.1.1 供试菌株

5.1.2 仪器设备

5.2 试验方法

5.3 试验结果与分析

5.4 讨论

第六章结论

T作为新种模式种的描述'> 6.1 C5^T作为新种模式种的描述

T作为新种模式种的描述'> 6.2 M10^T作为新种模式种的描述

T作为新种模式种的描述'> 6.3 L9^T作为新种模式种的描述

T作为新种模式种的描述'> 6.4 L18^T作为新种模式种的描述

T作为新种模式种的描述'> 6.5 L43^T作为新种模式种的描述

参考文献

附录

致谢

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 霍云云

导师: 韦革宏

关键词: 多相分类,根瘤菌,菜豆,新种

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家重点研发计划课题“西部旱区农地养分高效利用的培肥原理与途径”(编号:2016YFD0200308)

分类号: Q939.114

总页数: 86

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