王艳丽1程艳波1李春力2
（1郑州第一人民医院儿科河南郑州450004;2郑州人民医院儿科河南郑州450000）
【中图分类号】R725.7【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）35-0051-02
【摘要】目的研究郑州地区秋冬季婴幼儿腹泻A组轮状病毒的VP4分子基因分型。方法收集郑州第一人民医院儿科2010年9-12月住院的腹泻患儿的粪便标本80份，采用TRIzol方法抽提大便中的核酸，酶联接免疫吸附剂测定方法（ELISA）检测轮状病毒基因组，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法以及巢式聚合酶链反应法（net-PCR）PCR法进行轮状病毒的VP4基因分型。结果80份粪便标本中，40份检测到A组轮状病毒RNA基因，阳性率为50％，对40份标本进行VP4基因分型研究，P8型为33例（82.5.％），P6型6例（15％），P8和P6混合感染型1例（2.5％），未发现其他型。结论郑州地区A组RV以P8型为主要流行基因型，并发现P6和P8混合型.
【关键词】轮状病毒VP4基因型腹泻婴幼儿
【Abstract】objectiveTocharacterizethemolecularepidemiologyofrotavirusinfectionandthedistributionofPgenotypeofrotavirusinZhengZhou.MethodsStoolsampleswerecollectedfrom80childrenwhowerehospitalizedintheDepartmentofPeadiatric,theFirstPeoplesHospitalofZhengZhoufromseptembertonovemberin2010.TRIzolwasusedtodetectrotavirusgenemicRNAandELISAwasusedtoidentifyofgroupArotavirus.Reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT－PCR)andnestpolymerasechainreaction(net-PCR)wereperformedtoidentifyrotavirusPgenotypes.ResultsOutof80samplesinvestigated,40wereidentifiedArotavirus,andgenotypedP8predominatedintheallkindsofstrains(77.5％).4wereP6(10%).1wasmixedinfectionoftypep6andP8(2.5%).othergenotypeswerenotdetectable.ConclusionP8wasthemainprevalenttypeinZhengZhou.anditdiscoveredthenewprevalentmixedinfectionoftypeP8andP6
【Keywords】rotavirusgenotypeVP4diarrheainfantile
无论在发展中国家和发达国家，轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的最主要原因[1]。利用血清学方法，RV分为七个不同的组（A组～G组），其中Ａ、Ｂ、Ｃ组轮状病毒能够感染人，特别是A组RV是世界范围内婴幼儿重症腹泻的最重要的病原体，是引起婴幼儿死亡的主要原因[2]。其中VP4是组成RV的对蛋白酶敏感的非糖基化蛋白，基因全长为2359bp，由755个氨基酸组成[3]，VP4蛋白酶敏感蛋白决定P血清型，P基因型分型较复杂，用重组的从不同的G血清型得到的VP4蛋白诱导产生中和抗体对不同的人类毒株进行中和试验，将RV的VP4蛋白分为P1A、P1B、P2、P3、P4等血清型。VP4的基因分型与血清分型有一定的关系，目前至少有11个P血清型及20多种P基因型。引起婴幼儿腹泻的血清型多为P8、P4型[4]。本研究选择常见的5种A组轮状病毒VP4基因型（P基因型）特异引物,采用RT-PCR及net-PCR技术对郑州地区婴幼儿A组RV腹泻进行了P基因型的分子流行病学研究，现报道如下。
1材料和方法
1.1材料
2010年9月－2011年1月收集郑州市第一人民医院儿科住院腹泻患儿标本80份，符合以下临床诊断标准[5]：大便次数增多，呈水样、蛋花汤样便或黏糊状、黄绿色稀便，无粘液及血。标本存于－70℃冰箱备用，详细记录每例患儿腹泻的临床经过以及有无呼吸道感染症状。
1.2RV的RNA提取及检测
采用TRIzol方法抽提大便悬液中的核酸，酶联接免疫吸附剂测定方法（ELISA）检测轮状病毒基因组,对于阳性较干燥标本用PH值＝7.6的Tris液稀释为10％，取上清用病毒/液体样品的RNA/DNA抽提试剂盒（购自上海华舜工程有限公司）抽提RNA，用30ul无菌水融解RNA以备用。
1.3轮状病毒VP4的分型
轮状病毒毒株分型采用轮状病毒国家标准检测方案，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法以及巢式聚合酶链反应法（net-PCR）PCR法基因分型，引物详见文献[6-8]（以上所用试剂以及引物合成均购自大连宝生物有限公司）。
2结果
2.1病毒检测结果以及病毒感染的年龄和性别分布
通过ELISA方法检测结果显示80份粪便标本中A组RV阳性样本为40份，阳性率为50％，40份阳性标本中年龄在6个月～36个月之间平均年龄11.7月。其中7～15个月患儿感染占32例，占80％，24月至36个月3例，占7.5％，小于6个月患儿5例，占12.5％。男性患儿为26例，女性患儿为14例，男女之比为1.9：1。
2.2病毒G血清型分型结果
对40份阳性标本进行VP4基因分型研究，P8型为33例（82.5％），P6型6例（15％），P8和P6混合感染型1例（2.5％），未发现其他型。
2.3病毒血清型与呼吸道感染
在40份阳性标本中合并有呼吸道感染的7例，均为P8型。
3讨论
自1973年Bishop等首次发现轮状病毒以来,关于轮状病毒感染的研究越来越深入。据世界卫生组织调查5岁以下每年大约有527,000患儿死于轮状病毒感染[9]。据统计，在我国2004年因腹泻死亡的患儿有77,000[10]。虽然大部分死亡病例出现在发展中国家，但即使在卫生条件好、水质洁净的发达国家，这种疾病也有一定的发病率，这相当大的死亡率和对国家带来的经济负担要求必须有效的控制措施，传统的公共卫生干预措施在控制RV感染是无效的，目前控制轮状病毒感染有效的方法就是轮状病毒疫苗的研制。轮状病毒其结构核心为含11个dsRNA的基因组，这11个RNA片断分别编码六个结构蛋白（VP1～VP4，VP6，VP7）和五个非结构蛋白（NSP1～NSP4），根据VP7和VP4的特异性可将RV分为两个血清型，分别是G型（VP7）和P型（VP4），VP7和VP4组成病毒颗粒的外壳。RV结构蛋白VP7（可由第7、8或9基因编码）和VP4（由第4基因编码）是刺激产生保护性抗体的中和抗原[11]。VP4具有多种功能：首先起血凝素作用；其次是与寄主细胞受体结合的蛋白；第三，Vp4可裂解为VP5和VP8，裂解强化了病毒的侵染力；第四，VP4可在体内中和抗体；第五，在动物体内VP4是毒力的决定簇。据研究，VP4的第384～401残基位置的序列与带外膜的病毒蛋白质的分子内融合位点有些同源，因此很可能病毒在进入细胞或芽生释放时有与寄主融合的活性。在人类引起感染的11个P基因型（P1,P3～P6,P8～P11,P14和P19)[12]。研究显示，P8、P4是引起婴幼儿轮状病毒腹泻的主要基因型，已成为1998年以后中国不同地区的主要流行株，同时也发现了一些不常见的P6型和P9型，宋文萍[13]等研究广州地区2007年11月-2008年2月秋季腹泻患儿的VP4分型，检测到多为P6型，且发现有P4、P6、P8、P10的混合，Iturriza．Comara等[14]收集了英国1995—1999年l8个不同区域的3601份RV样本，用RT-PCR法研究了轮转病毒的血清学分布，发现P型血清学分布为:P8型占9l％，P4型占11％，P6型占1.1％，P9型占0.1％。P6型以前认为主要与新生儿无症状感染有关，并认为是天然减毒株。但也有报道P6型毒株与轮状病毒感染有关。本研究通过对轮状病毒的VP4基因型分型显示：郑州地区2010年VP4分型以P8型为主，占（77.5％）,P6型4例占10％，P8和P6混合感染型1例占2.5％，并且发现P8和P6混合感染型1例，说明P血清型的分布呈现多样性和重新分配型。本研究未发现P4、P9、P10型，但发现在轮状病毒感染的患儿中合并呼吸道感染的患儿7例均为P8型，是否与P8毒性强有关，需要进一步的研究。
轮状病毒感染多样性,不同地区不同年度流行的优势株的转变[15],给RV的防治带来困难。这给研制在全国范围内推广使用的RV病毒疫苗带来困难,也让人们意识到对RV的流行进行长期监测的重要性[16]。郑州地区目前对轮状病毒的基因型分型研究较少，我们将对郑州地区每年的轮状病毒感染进行检测，并为疫苗研制提供依据。
参考文献
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