拟南芥HEN1调控胚珠发育的分子机理研究

论文摘要

有性生殖作为植物整个生命周期的关键环节,对于植物后代的繁衍和世代交替的发生至关重要。以模式植物拟南芥为例,植物的有性生殖过程大致可以分为雌雄生殖器官的形成、受精和胚胎发生三个阶段。胚珠作为植物主要雌性生殖器官,是受精发生的场所,因此受到人们的广泛关注。近年来,高通量数据表明microRNA作为一种重要的调控因子在胚珠发育过程中发挥着重要作用。此外已有报道表明与microRNA的产生相关的蛋白AGO9和DCL1分别参与调控功能大孢子的形成和珠被的发育。但microRNA加工途径中的其他成员在有性生殖方面的功能尚未报道。本论文利用反向遗传学手段进行研究,研究数据表明HEN1通过miR167负调控ARF6和ARF8参与调控胚珠发育。本论文的实验结果和主要结论如下:（1）hen1-8雌雄配子体传代率正常已有研究表明HEN1突变后导致角果结实率降低,但并未对该表型做详细分析。因此,我们首先对hen1-8进行角果分析,结果发现hen1-8的结实率只有25%左右,而其杂合体结实率正常。此外,杂合突变体与野生型正反交分离比正常。这些结果表明hen1-8雌雄配子体均能够正常传代。（2）hen1-8珠被发育异常为了探究hen1-8的雌、雄性孢子体哪一方出现异常,我们将野生型和hen1-8互交,结果发现当hen1-8作父本时,结实率正常;而当hen1-8作母本时,结实率只有55%,表明hen1-8的雌性孢子体异常。为了研究hen1-8胚珠在哪一发育时期开始出现异常,我们做了光切实验;结果发现hen1-8胚珠发育早期正常,而当发育至3-I期时,珠被出现了明显的发育滞后的现象,表明HEN1突变后影响胚珠珠被的发育。（3）hen1-8胚珠对花粉管的吸引能力降低我们将转基因材料ProLat52:GUS花粉授粉hen1-8雌蕊,授粉12 h后染色观察胚珠对花粉管的吸引情况。结果显示,野生型中有81.1%左右的胚珠吸引了花粉管,而突变体中只有47.4%左右;48 h的苯胺蓝染色结果显示野生型和hen1-8中受精后发育的胚珠比例分别为96.6%和56.5%。这些结果表明HEN1突变后胚珠对花粉管的吸引能力降低,进而导致育性降低。（4）HEN1负调控ARF6和ARF8的表达已有的研究表明miR167通过调控ARF6和ARF8的表达进而影响胚珠发育,而miR167又受到HEN1的调控。因此我们检测了hen1-8胚珠中ARF6和ARF8的表达水平,发现二者均有显著升高,且原位杂交结果显示ARF6和ARF8在hen1-8成熟胚珠中均出现了异位表达的现象,表明HEN1通过miR167负调控ARF6和ARF8的表达进而调控胚珠发育。

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1 前言

1.1 植物的世代交替

1.2 植物有性生殖

1.2.1 拟南芥花药的发育

1.2.2 拟南芥胚珠的发育

1.2.3 胚珠发育的调控机制

1.2.4 拟南芥双受精过程

1.3 HEN1 参与调控植物生长发育过程

1.4 ARF家族蛋白

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料及生长条件

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 酶和各种生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.2 方法

2.2.1 转基因植物表达载体的构建

2.2.1.1 植物总RNA的提取（试剂盒法）

2.2.1.2 反转录（试剂盒法）

2.2.1.3 植物基因组DNA的提取

2.2.1.4 目的基因扩增

2.2.1.5 PCR产物回收（试剂盒法）

2.2.1.6 TOPO连接反应

2.2.1.7 TA连接反应

2.2.1.8 大肠杆菌转化及质粒提取（试剂盒法）

2.2.1.9 DNA序列测定

2.2.1.10 LR反应

2.2.1.11 T4 连接反应

2.2.1.12 质粒DNA的酶切鉴定

2.2.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

2.2.2.1 根癌农杆菌的转化

2.2.2.2 拟南芥的栽培及转化

2.2.3 qRT-PCR

2.2.3.1 引物设计及合成

2.2.3.2 反应条件及结果分析

2.2.4 药剂处理和各种染色分析

2.2.4.1 胚珠的透明化

2.2.4.2 拟南芥胚珠光学切片观察

2.2.4.3 亚历山大染色（Alexander staining）

2.2.4.4 DAPI染色

2.2.4.5 苯胺蓝染色（Aniling blue staining）

2.2.4.6 GUS染色

2.2.5 扫描电子显微镜观察（SEM）

2.2.6 原位杂交

2.2.6.1 探针的制备

2.2.6.2 探针的半定量

2.2.6.3 材料的固定

2.2.6.4 材料的包埋

2.2.6.5 切片

2.2.6.6 脱蜡、消化、乙酰化和杂交

2.2.6.7 杂交后处理

2.2.6.8 检测

3 结果与分析

3.1 hen1-8 雌性孢子体异常导致育性降低

3.1.1 hen1-8 雌雄配子体传代率正常

3.1.2 hen1-8 花粉活性、发育和外壁形态建成正常

3.1.3 hen1-8 雌性孢子体发育异常

3.2 hen1-8 珠被异常进而影响胚珠的发育

3.2.1 HEN1 在整个胚珠发育过程中均有表达

3.2.2 hen1-8 胚囊发育异常

3.2.3 hen1-8 胚珠对花粉管的吸引能力降低

3.2.4 HEN1 调控胚珠珠被发育

3.2.5 hen1-8×hen1-2 F1 胚珠发育异常

3.2.6 hly1-2 胚珠发育缺陷的表型与hen1-8 相似

3.3 HEN1 通过miR167 负调控ARF6和ARF8 的表达影响胚珠发育

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏帅杰

导师: 张彦

关键词: 有性生殖,胚珠发育,珠被

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山东农业大学

分类号: Q943.2

总页数: 68

文件大小: 5651K

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