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伪狂犬病病毒在小鼠体内复制和扩散的可视化研究

2020-12-08阅读(538)

伪狂犬病病毒在小鼠体内复制和扩散的可视化研究

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种严重危害养猪业的病毒性传染病,该病的病原是伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。PRV可以感染多种家畜和野生动物,猪是其天然宿主。近年来,疫苗的应用使伪狂犬病得到了有效控制,美国及部分欧洲国家甚至根除了该病。2012年,我国报道了多个接种伪狂犬病Bartha-K61株疫苗的猪场暴发了伪狂犬病新疫情。研究发现,引起此次疫情的PRV毒株发生了多处变异,与经典毒株属于不同的系统发育学分支,且对宿主的致病力增强。目前关于新的PRV流行毒株致病力增强的详细机制仍不清楚,而且毒株具有继续变异的可能。因此,有必要建立快速评估PRV毒株致病力的方法。本研究利用同源重组法构建了能够稳定表达NLuc荧光素酶的重组PRV（rPRVTJ-NLuc）,并对该重组病毒的稳定性、生长动力学以及荧光素酶活性进行了系统鉴定,结果表明,与亲本毒株相比,重组病毒可以表达红色荧光蛋白,其在PK-15细胞上具有传代稳定性,且其在PK-15细胞上的复制能力没有发生明显改变,能够表达较高水平的荧光素酶,且荧光素酶水平与病毒滴度呈正相关。将该重组病毒rPRVTJ-NLuc与其亲本株PRVTJ接种小鼠后,小鼠的临床症状、体重变化、死亡率、组织病理学变化以及病毒在组织中的分布均无显著差异,表明报告基因的插入没有影响重组PRV对小鼠的致病力。将重组病毒rPRVTJ-NLuc以103.0TCID50剂量通过腹腔、皮下和肌肉三种注射途径接种小鼠后,再经活体成像监测表明,发光信号首先出现在注射部位,然后再扩散至背部脊髓部位,最后信号消失。这个过程也表明PRV首先在注射部位进行复制,之后扩散至神经系统,最后建立潜伏感染或被清除。rPRVTJ-NLuc感染小鼠后,体内的荧光信号先变强后减弱,可以指示病毒从感染到逐渐被清除的过程。最终,通过对离体器官的成像,证实小鼠体内的发光信号来自于脊髓等神经系统。本研究构建了一株能够稳定表达NLuc荧光素酶的重组PRV,利用活体成像技术实现了PRV在小鼠体内复制与扩散过程的可视化。本研究为探索PPV变异株致病力增强的机制、评价新疫苗和抗病毒制剂提供了新的思路。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 伪狂犬病与伪狂犬病病毒
  •     1.1.1 伪狂犬病
  •     1.1.2 伪狂犬病病毒
  •   1.2 伪狂犬病病毒致病机制
  •     1.2.1 研究PRV致病机理的动物模型
  •     1.2.2 PRV的神经致病力
  •   1.3 活体成像技术在病毒学研究中的应用
  •     1.3.1 活体成像技术
  •     1.3.2 荧光素酶及其底物
  •     1.3.3 活体成像技术在病毒学研究中的应用
  •   1.4 研究目的与意义
  • 第二章 表达NLuc的重组伪狂犬病病毒的构建与鉴定
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 病毒、细胞与质粒
  •     2.1.2 仪器设备
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 转移载体的构建与鉴定
  •     2.1.5 转移载体与感染性基因组共转染Vero细胞
  •     2.1.6 表达NLuc的重组病毒的纯化
  •     2.1.7 重组病毒的蚀斑形成与荧光表达鉴定
  •     2.1.8 重组病毒的PCR鉴定
  •     2.1.9 重组病毒的生长特性分析
  •     2.1.10 重组病毒的荧光素酶活性分析
  •   2.2 结果
  •     2.2.0 重组病毒的构建
  •     2.2.1 重组病毒的蚀斑形成和荧光表达
  •     2.2.2 重组病毒的PCR鉴定
  •     2.2.3 重组病毒的生长特性分析
  •     2.2.4 重组病毒的荧光素酶活性
  •   2.3 讨论
  • 第三章 PRV在小鼠体内复制与扩散的可视化研究
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 病毒、细胞与实验动物
  •     3.1.2 仪器设备
  •     3.1.3 主要试剂
  •     3.1.4 重组病毒rPRVTJ-NLuc与亲本株PRVTJ在小鼠上的致病力比较
  •     3.1.5 小鼠组织器官的病理组织学分析
  •     3.1.6 荧光定量PCR检测小鼠组织中病毒基因组拷贝数
  •     3.1.7 重组病毒rPRVTJ-NLuc接种小鼠后的活体成像监测
  •     3.1.8 离体器官的成像
  •     3.1.9 统计学分析
  •   3.2 结果
  •     3.2.1 小鼠接种病毒后的临床症状评分
  •     3.2.2 小鼠接种病毒后的体重变化和死亡率
  •     3.2.3 感染PRV的小鼠的组织病理学分析
  •     3.2.4 接种病毒后小鼠各组织中病毒的分布
  •     3.2.5 重组病毒rPRVTJ-NLuc感染小鼠后的体内示踪
  •     3.2.6 不同接种途径揭示PRV体内复制和扩散的动态
  •     3.2.7 离体器官成像验证小鼠体内发光来源
  •   3.3 讨论
  • 第四章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王亚林

    导师: 孙元

    关键词: 伪狂犬病,变异株,致病力,活体成像,小鼠

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: S852.65

    总页数: 45

    文件大小: 4790K

    下载量: 143

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