杨炜峰[1]2006年在《山羊胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定》文中提出山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是制备乳腺生物反应器理想的候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。本研究选用体内来源的关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs报道的建系方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养不同发育时期山羊胚胎ESCs和胎儿EGCs的影响,主要获得以下结论:1.超排处理45只山羊(42只关中奶山羊,3只波尔山羊),共得到可用胚胎341枚,其中4～16细胞胚胎26枚,桑椹胚144枚,囊胚108枚,孵化胚63枚。在以“桑椹胚全胚、去带桑椹胚、囊胚全胚、ICM和胚盘阶段的胚胎”为起始材料分离山羊类ESCs的试验中,发现“去带桑椹胚、ICM和胚盘阶段的胚胎”分离效果较佳。“桑椹胚全胚和囊胚全胚”在接种饲养层后,贴壁率较低(如囊胚全胚贴壁率为38.1%,内细胞团贴壁率为76.5%,二者差异显着,P﹤0.05),不适宜直接作为分离ESCs的起始材料。2.将ICM培养于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,以DMEM为基础培养液,研究了含血清和无血清条件下ICM的增殖规律。结果表明,无血清培养可以减少ICM分化的发生。而且在无血清培养条件下比较了添加不同生长因子对ICM(共计48个)增殖的影响,结果表明添加MEF条件培养液,STO条件培养液、大鼠心肌(rHF)条件培养液、LIF、bFGF、两种生长因子同时添加或都不添加对原代ESCs样集落出现率的影响不显着(P > 0. 05),但添加10 ng/mL bFGF稍微有助于ICM增殖。这些结果表明山羊ICM适宜于无血清培养。在山羊类ESCs传代方面,比较了机械法、酶消化法和二者结合的方法对传代效果的影响,酶消化法最高传至2代,机械法最高传至9代,机械法加酶消化的方法最高传至5代。3.山羊类ESCs集落形态多样,类ESCs集落AKP染色阳性,Oct-4和SSEA-1免疫组化染色阳性,SSEA-4阴性。在体外可以自发分化为神经样或上皮样细胞。4.自然配种8只奶山羊,获得交配后28～42d胎儿9只,另外由屠宰场收集山羊胎儿32只。在41只山羊胎儿中,仅对臀冠长为20～25 mm的胎儿(胎龄约为35d)进行比较。最终符合条件的15只胎儿共获得219个原代类EGCs集落。采用生殖嵴与同源胎儿成纤维细胞共培养的方法获得的原代集落数较多,与传统的人与小鼠分离PGCs的分离方法相比差异不显着(P>0.05)。在山羊类EGCs传代方面,比较了机械法、酶消化法或二者结合的方法进行山羊类EGCs传代的效果,酶消化法最高传至4代,机械法和“机械法辅助酶消化法”可传至9～12代,表明机械法可以获得较高的传代数。但是在试验中发现,单纯的机械法切割易于损伤新集落边缘的细胞,从而影响了集落的形态,
葛秀国[2]2004年在《牛和山羊胚胎生殖细胞的分离与培养》文中进行了进一步梳理本研究以牛和山羊胎儿为材料，从原始生殖细胞分离培养出EG细胞，并进行传代培养和鉴定，对影响胚胎生殖细胞(Embryonic germ cell,EG)分离与培养的影响因素进行了探讨，为进一步建立牛和山羊EG细胞系奠定了基础。实验主要结果如下：从49例牛胎儿分离培养胎儿原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC），胎龄在29~50d的牛胎儿可以用于分离培养原始生殖细胞，最高传至7代。统计46例山羊胎儿分离培养原始生殖细胞情况，胎龄在25~38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落，适合做EG细胞的分离培养，最高传至6代。用不同的饲养层培养牛原始生殖细胞，实验结果表明MEF，STO和BEF饲养层都能支持牛原代PGCs的增殖，但MEF较BEF和STO效果更好以MEF、GEF、BEF为饲养层，在不添加细胞因子情况下，都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明，MEF的培养效果较好，但与GEF组二者差异不显着(P>0.05)，BEF组培养效果较差（P<0.05）。以共培养方式培养牛、山羊原始生殖细胞，在原代培养时，都可以出现大量形态较好的EG细胞集落，说明同源的体细胞可以很好的支持PGC的生长和增殖。试验以叁个不同浓度LIF的培养液培养山羊PGCs。在原代培养时，效果差异不显着(P>0.05)；而在传代过程中，以含LIF 10 ng/mL组培养效果最好，但与含LIF 5 ng/mL组差异不显着(P>0.05)，LIF 1 ng/mL组培养效果较差(P<0.05)。试验比较了不同消化方法对山羊胎儿原始生殖细胞分离的影响。在37℃下，0.125%胰蛋白酶+0.02% EDTA（处理20~30 min）消化分离效果较好于0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA（处理15 min）试验比较了不同传代方法对牛和山羊胚胎生殖细胞细胞传代的影响，发现消化+机械分离法和消化+吹打法都可以用于EG细胞的传代。消化+吹打法操作简单，省时省力，也能够很好的保持细胞的增殖活力。牛和山羊的胚胎生殖细胞集落碱性磷酸酶鉴定为阳性。牛原代胚胎生殖细胞进行了细胞表面标志抗原SSEA-1，3，4鉴定，呈弱阳性。细胞体外培养可以分化为脂肪细胞、成纤维样细胞、上皮样细胞和类胚体。
闫龙[3]2008年在《山羊胚胎干细胞的分离与培养》文中进行了进一步梳理山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是克隆动物、转基因动物、制备生物反应器和组织工程等理想的候选细胞,然而至今没有成功建系的报道。本研究选用关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养山羊ESCs和EGCs的影响,并对得到的细胞进行了一系列的检测和鉴定,主要获得以下结论:1.本试验共超排处理了4只关中奶山羊采胚,共采集胚胎42枚,可用胚39枚,胚胎可用率为92.9%(39/42),其中桑椹胚5枚,囊胚28枚,孵化囊胚6枚,平均每只山羊获得10.05枚胚胎。原代培养时分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法处理胚胎,观察不同发育阶段的胚胎在原代培养时使用不同的处理方法对贴壁率和传代培养的影响。发现原代培养时,全胚培养法的贴壁率最高,而囊胚最适合于山羊ESCs的分离培养,最高传至18代。2.试验在传代培养时比较了机械法和酶消化法两种方法对山羊ESCs体外培养的影响,发现早期使用机械法传代有利于ESCs的增殖,而后期使用酶消化法传代有利于抑制ESCs的分化。本试验6代以前使用机械法传代,6代以后采用酶消化法传代,最高将山羊ESCs传至18代。3.试验采用山羊的克隆胚胎和孤雌激活胚胎分离ESCs,发现两种胚胎的贴壁率很低,胚胎细胞增殖较慢,通过比较不同发育阶段胚胎的体外培养结果,发现早期桑椹胚的贴壁率稍高于囊胚,试验将ntESCs和pESCs细胞最高分别传至4代和2代。4.试验对山羊ESCs进行了免疫组织化学染色和RT-PCR检测,表明其表达SSEA-1,SSEA-3,Nanog,Oct4,TERT和CD117。体外诱导分化试验证明山羊ESCs在体外经诱导可分化为心肌细胞,说明所获得的山羊ESCs具有ESCs的特性。5.试验共得到30例山羊胎儿,以胎儿生殖嵴分离培养EGCs。发现以高糖DMEM为培养基,添加15% KSR的无血清培养体系比含15%FBS的培养体系更能维持EGCs的长期传代培养,传代次数较高,但经t检验,二者之间差异不显着(P>0.05)。而传代培养时,机械法最高传至10代,酶消化法最高传至5代,机械法更适合于传代培养,二者差异显着(P<0.05)。6.山羊EGCsAKP染色阳性,Oct4和SSEA-1免疫组化染色阳性,RT-PCR检测显示其表达Nanog,Oct4,TERT基因。体外悬浮培养或延迟传代的山羊EGCs可以自发分化形成类胚体或成纤维样、神经样、脂肪样等细胞类型,表明该细胞具有ESCs的特性。
李天达[4]2009年在《山羊类胚胎干细胞的分离与培养》文中提出山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是克隆动物、转基因动物、制备生物反应器和组织工程等理想的候选细胞,然而至今没有成功建系的报道。本研究选用马头山羊为试验对象,在其繁殖季节,使用CIDR孕激素海绵栓诱导同期发情,使用OVAGENTM进行超数排卵处理,手术法体外冲胚。获取胚胎后参照小鼠和人ESCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法以及血清成分对分离、培养山羊ESCs的影响,并对得到的细胞进行了相关检测和鉴定,主要获得以下结论:1.应用CIDR阴道诱导同期发情,在撤栓后的24~36h羊只出现发情高峰,0~72h发情率为95.00%。对采用不同剂量的OVAGENTM的叁个试验组的山羊进行超数排卵处理,结果表明注射160mg试验组所获得的胚胎数量最多。超排共获得胚胎158枚,其中84枚胚胎鉴定为囊胚、B级以上,可用于山羊胚胎干细胞分离与培养试验。2.试验以DMEM/F-12+15%KSR+0.1mmol/Lβ-Me+0.1mmol/L非必需氨基酸+2mmol/L谷氨酰胺为基础培养液,添加细胞因子LIF(1000 IU/mL)和bFGF(20 ng/mL),以MEF作饲养层,采用机械法分离囊胚ICM,并利用机械分割的方法进行传代,最高将山羊类ESCs传至6代。最终未能获得稳定传代的细胞系。3.以DMEM/F-12为基础培养液,研究了含血清和无血清条件下山羊ICM的增殖规律。结果表明,含血清培养可以促进ICM的贴壁和增殖,有利于山羊ESCs的体外传代培养,但也促使细胞发生一定分化。添加FBS的试验组ICM的贴壁率较高。而添加KSR试验组的最高传代数为6代,高于添加FBS的试验组。4.试验以DMEM/F-12+15%KSR+0.1mmol/Lβ-Me+0.1mmol/L非必需氨基酸+2mmol/L谷氨酰胺为基础培养液培养山羊ESCs。结果表明利用机械法分离ICM。小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层以及联合使用LIF和bFGF和利用囊胚分离适合于山羊类ESCs的分离、培养。5.试验对分离得到山羊类ESCs进行生物学检测。结果表明所分离的山羊类ESCs具有典型的胚胎干细胞形态特征;碱性磷酸酶染色(AKP)染色检测结果呈阳性;ESCs特异性转录因子OCT-4和Nanog检测结果呈阳性;对其中一株山羊类ESCs进行核性分析,其核型表现为正常的二倍体核型。
郭燕杰[5]2014年在《猪和山羊多能性干细胞及其培养体系的研究》文中研究指明多能性干细胞是一类具有自我更新能力和能够实现向内、中、外叁个胚层分化的细胞。多能性干细胞在家畜如猪、牛、羊等动物中有广泛的应用价值，例如用于研究器官移植、人疾病模型以及生物药品的研制开发等，是具有重要研究意义的细胞材料。近年来，许多研究都尝试获得家畜多能性干细胞，然而这个过程中依然存在着很多困难和问题。如：获得的多能性干细胞不能在体外长时间稳定传代、多能性基因表达特征不统一、不能获得嵌合体动物或嵌合率低等。到目前为止依然没有公认的可供参考的家畜多能性干细胞系，没有适合多能性干细胞的培养体系可能是最主要的问题之一。本研究主要对猪和山羊的多能性细胞进行了研究。关于猪的多能性细胞研究，我们首先以猪胚胎生殖细胞（EGCs）为参考，通过添加各种细胞因子和化学小分子来优化培养条件，初步确定了适合猪多能性干细胞的培养体系。并在此基础上，诱导获得了猪诱导多能性干细胞（iPSCs）。在对获得的猪iPSCs进行鉴定确定其多能性之后，我们探讨了培养条件中SB431542和BMP4在诱导piPSCs形成过程中的作用机制。此外，我们通过mRNA和miRNA测序对piPSCs的转录组特性进行了分析。关于山羊的多能性细胞的研究，我们尝试用不同的培养条件分离山羊ES样细胞，并在此培养条件基础上进行了山羊iPSCs诱导。同时在此过程中构建了用于监控细胞多能性的报告系统。具体结果如下：1.猪胚胎生殖细胞（EGCs）的分离培养通过改变饲养层细胞的类型以及在培养基中添加各种小分子化合物来筛选适合猪EGCs的培养条件。在基础培养基（DMEM+15%FBS+10ng/mL hLIF+10ng/mL FGF2+40ng/mL hSCF，详见3.1.1.2）中添加PD0325901、CHIR99021和SB431542叁种小分子化合物（详见3.1.1.2），通过统计碱性磷酸酶（AP）染色阳性的EGCs克隆数目来确定最适的培养条件。之后，在此培养条件的基础上，比较了小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）、猪胎儿成纤维细胞（PEF）及中肾区基质细胞饲养层对猪EGCs的影响，确定了MEF饲养层为最适合的饲养层。2.猪诱导多能性干细胞（piPSCs）的建系及不同培养条件对细胞重编程的影响利用人的四因子OSKM（OCT4、SOX2、KLF4及C-MYC）对PEF进行诱导，并且在猪EGCs培养条件的基础上对猪iPSCs的培养条件进行优化，确定了最适合的培养条件，在此条件下获得了两株能在体外稳定传代的piPSCs系，将其命名为LFB2i-piPSC1和LFB2i-piPSC2。获得的两株piPSCs和人的胚胎干细胞（hESCs）类似，具有高的核质比并且表现出AP阳性。对这两株piPSCs进行分子及细胞生物学鉴定，结果表明该细胞具有外源基因插入，且外源基因的表达沉默；细胞表达内源的OCT4、SOX2、NANOG、ESRRB等多能性因子，和SSEA1、Tra-1-60等干细胞表面标记；体内外分化实验均表明其具有向叁个胚层分化的能力。通过流式细胞技术检测iPSCs诱导第8天上皮细胞标记E-cadherin阳性细胞数，从而将LFB2i-piPSCs培养基中的添加成分LIF、FGF2、CHIR99021、SB431542和BMP4单独或组合后对猪诱导多能性干细胞形成初期间充质向上皮转化（Mesenchymal toEpithelial, MET）的作用进行了系统的筛选。并且通过Real time RT-PCR和WesternBlotting共同证明SB431542和BMP4联合能够加速MET的发生。另外，对重编程过程中细胞增殖的检测发现SB431542和BMP4联合能够促进细胞的增殖。3.猪诱导多能性干细胞的转录组分析对LFB2i-piPSCs进行了mRNA和sRNA测序，并且和PEF、FGF2-piPSCs（能够产生嵌合体动物的piPSCs）数据进行了比较。mRNA-seq结果显示LFB2i-piPSCs表达高水平的SOX2, L-MYC, ESRRB等基因以及相对低水平的POU5F1(OCT4), KLF4和NANOG基因。miRNAs分析表明LFB2i-piPSCs高表达与多能性相关的miR-17-92、miR-302b-367、miR-106a-363、miR-290家族中的miRNAs，低表达let-7家族中的miRNAs。4.山羊NANOG启动子报告载体的构建和细胞多能性监控首先尝试用不同的培养条件进行了山羊ES样细胞的分离和iPS样细胞的诱导，并对获得的细胞进行了初步鉴定。之后克隆并验证了山羊NANOG近端启动子，将其与EGFP相连接构建了报告载体。通过细胞转染和显微注射证明该报告载体具备表达功能和组织特异性。将该载体稳定转染到山羊成纤维细胞中作为重编程的受体细胞，从而对山羊体细胞重编程过程进行监控。同时将该报告载体显微注射到山羊胚胎中用于监控山羊早期胚胎的发育进程。
熊浩[6]2010年在《山羊原始生殖细胞的分离培养》文中提出原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)在一定条件下维持未分化状态,经过体外长期培养可以建立胚胎性干细胞系,称为胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EGCs),这是继胚胎癌细胞(Embryonal Carcinoma Cells, ECCs)和胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)之后发现的又一多能性干细胞。本研究以江苏本地白山羊胎儿的生殖嵴为实验材料,从PGCs中分离培养得到EGCs,对其进行体外传代和鉴定等,并且分析了影响山羊PGCs分离培养的一些因素,为本地白山羊ESCs系的建立奠定了一定的基础。实验结果如下:1.小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast cells,MEF),山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast cells,GEF)和小鼠睾丸支持细胞(Mouse sertoli cells,MSCs)叁种细胞在体外生长行为基本相似,贴壁时间短,增殖迅速。试验发现以10μg/mL丝裂霉素-C处理3 h可以有效抑制GEF的增殖,适宜于饲养层的制作;在短期内冻存GEF可以置于-70℃保存,复苏率可以达到培养要求。2.原始生殖细胞在体外培养生长呈鸟巢状和集落状,凸起生长于成纤维细胞饲养层之上,传代后EGCs的形状与PGCs基本相似。3.以共培养,MEF和GEF作为饲养层的叁种培养方式中:在培养基中没有添加细胞因子时,仅仅能够观察到原代集落;在培养基中添加10 ng/mL的LIF时,只有以GEF为饲养层才能将得到的原代集落传至二代,其它二种培养方式仅仅可以观察到原代集落。以MSCs为饲养层时,添加细胞因子与否均无法观察到原代集落。4.胎儿生殖嵴在室温(25℃)下消化15 min,使用0.125%胰酶+0.02%EDTA要比0.25%胰酶+0.04%EDTA效果好,前者消化得到的原代集落要多于后者,差异显着(P<0.05);试验比较了两种传代方法对山羊PGCs传代的影响,无论是“挑取集落法”还是“胰酶消化法”,均能将PGCs传至第二代,两种方法差异不显着(P>0.05)。5.在培养液中添加不同浓度和种类的因子:①LIF:10 ng/mL;②LIF:20 ng/mL;③LIF(10 ng/mL)+SCF(10 ng/mL);④LIF(20 ng/mL)+SCF(20 ng/mL),以GEF为饲养层,发现这四种培养方式对于原代集落形成率的差异是不显着的(P>0.05),且均能得到传至第二代的EGCs。6.不同胎龄胎儿分离培养PGCs的效果,结果发现4例冠臀长小于15 mm的胎儿仅观察到一个原代集落,6例大于30 mm的胎儿没有观察到原代集落。7.本试验对山羊第二代EGCs进行冷冻保存,复苏没有获得成功,复苏率为零。
孙国杰[7]2002年在《山羊类胚胎干细胞的分离、克隆》文中研究说明本论文对影响山羊类胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)和胚胎生殖细胞(embryonic germ cell,EG细胞)培养、分离、克隆、传代效果的影响因素进行了研究， 方法一：采用昆白小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或山羊胚胎成纤维细胞(GEF)作为饲养层，高糖DMEM+10％NBS+20ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMβ-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素作为培养基，从5-6d胚胎中分离出山羊类ES细胞，克隆传至四代，其中第一代获得类ES细胞集落30个(33.3％)，第二代获得类ES细胞集落8个(8.9％)，第叁代获得类ES细胞集落3个(3.3％)，第四代获得类ES细胞集落2个(2.2％)。本实验研究了胚龄、生长因子、饲养层对山羊ES细胞分离和克隆的影响。结果表明：第6d的胚胎贴壁率最高(77.4％)；5.5d的胚胎获得11个类ES集落，有两个传至第4代；5d的胚胎贴壁率，获得类ES集落数均较低。LIF和SCF联合使用与对照组相比可提高类ES细胞的增殖率(52.9％:7.7％)，并且有两个类ES集落传至第4代。添加LIF和胰岛素对胚胎的贴壁和细胞的增殖有积极影响，单独添加LIF，没有形成类ES细胞集落，添加胰岛素有类ES集落形成，并传代一次。用小鼠胎儿成纤维细胞或山羊胎儿成纤维细胞作为饲养层，对胚胎的贴壁率、内细胞团的增值效果、ES的克隆效果，二种饲养层的差异不明显。ES细胞在体外悬浮培养，形成类胚体，山羊类ES细胞在无饲养层铺有明胶的皿底上培养，可分化为多种类型细胞，如上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞等。同时还比较了山羊胚胎与小鼠胚胎在培养系统中的生长行为。 方法二：采用45-70d山羊胎儿的生殖腺与其同源成纤维细胞共培养，高糖DMEM+7.5％NBS+7.5％FCS+20ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMB-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素作培养基，分离出山羊原始生殖细胞(PGCs)，克隆并多次传代。45d胎儿原代观察到36个类PGCs细胞集落，传至4代后丢失。55d的胎儿获得11个PGCs集落，可传代2次，从70d胚胎的生殖腺没有分离到PGCs细胞集落。采用混合培养法，单独添加LIF和对照组相比没有积极影响，LIF和SCF联合使用有2个PGCs集落传至第4代。采用饲养层培养法，在培养基中添加LIF和SCF，分离到了原生生殖细胞，并有2个PGCs集落传至第3代。PGCs细胞具有干细胞的诸多特征，聚集生长，呈典型的鸟巢状、岛状，AKP染色呈阳性，在体外分化培养中生长形成多种类型的细胞。
靳木子[8]2013年在《阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞培养技术的研究》文中研究指明阿尔巴斯白绒山羊和绵羊作为内蒙古自治区两大主要家畜品种,其胚胎干细胞的建系一直未能成功。成功的建立其胚胎干细胞系对两种家畜的育种以及当代畜牧业的发展具有重大的作用。本研究就阿尔巴斯白绒山羊和绵羊两种动物的胚胎干细胞建系展开研究,采用胎鼠成纤维细胞为饲养层,对比不同的传代方法、不同的培养液对两种动物胚胎干细胞培养的影响,并通过形态鉴定、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、体外分化检测、PCR鉴定等方法对其进行检测鉴定,为成功的建立大家畜胚胎干细胞系提供实验依据。一、阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的建系(一)前期准备实验1.分别利用自然发情和同期发情的阿尔巴斯白绒山羊母羊进行超数排卵处理,以获得高质量、多数量的体内胚胎。研究结果显示两种方法获得的阿尔巴斯白绒山羊胚胎质量均较高,但卵巢排卵点数量有极显着差异(P<0.01),自然发情母羊超排后每只卵巢排卵点10.6±3.8,明显多于同期发情处理后的母羊每只卵巢排卵点6.1±3.1。自然发情阿尔巴斯白绒山羊母羊更适合于超数排卵体内胚胎的获得。2.通过对4个多能性基因的同源性比较分析,确定了大动物(山羊、绵羊、牛)与人的同源性更相近,与鼠的同源性较远,从而确立了阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养液以人胚胎干细胞的培养液为主,即胚胎干细胞培养液Ⅰ:DMEMF12+10%胎牛血清+0.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM非必须氨基酸+0.lmML-Glutamine+20ng/mlLIF+10ng/ml bFGF+100IU/ml青霉素+0.05mg/ml链霉素,和胚胎干细胞培养液Ⅱ:DMEMF12+BSA+N2+B27+0.1mMp-巯基乙醇+0.1mM非必须氨基酸+0.1mM L-Glutamine+100IU/ml青霉素+0.05mg/ml链霉素+20ng/mlLIF+10ng/mlbFGF。3.实验中采用耳缘静脉注射的方法自制了兔抗阿尔巴斯白绒山羊血清,对不同稀释比例的血清进行效价检测,检验测定结果发现以1：5比例稀释的兔抗阿尔巴斯白绒山羊血清与豚鼠血清补体反应充分,是所制备血清的最优效价。(二)培养体系的确立1.以胎鼠成纤维细胞为饲养层,采用培养液Ⅰ和培养液Ⅱ两种液体、通过胚胎直接贴壁获得内细胞团、运用机械传代法和胰酶消化法传代培养阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞,运用90%胎牛血清+10%DMSO的冷冻保护液冷冻保存阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞并复苏培养,对其进行鉴定。结果显示,两种培养液都可用于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养,培养液Ⅱ中胚胎干细胞的生长速度更快,因此,培养液Ⅱ更适合于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养；机械传代法更适合于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的传代培养；两种培养液中培养的阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞经冷冻、复苏后保持着胚胎干细胞的干性特征,即普通的冷冻、复苏方法可有效的保存阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞。2.自制兔抗阿尔巴斯白绒山羊血清用于免疫外科学方法获得阿尔巴斯白绒山羊胚胎内细胞团,以胎鼠成纤维细胞为饲养层,采用培养液Ⅱ、运用机械传代法培养阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞以确定免疫外科学法是否适合于获得阿尔巴斯白绒山羊胚胎的内细胞团。研究结果显示,免疫外科学方法获得的阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞纯度较高,细胞检测结果显示其具有干细胞的全能性特征,即免疫外科学法适合于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养。二、绵羊胚胎干细胞的建系培养(一)前期准备实验运用一步法、两步法、波尔山羊冷冻精液法叁种方法制备绵羊冷冻精液,结果显示,一步法所获得精液在解冻后精子活力最强,成活率较高,而采用两步法和波尔山羊冷冻精液法所冷冻的绵羊精液,解冻后精液精子活力较低,成活率相对较低。采用一步法获得高质量的绵羊冷冻精液,通过体外受精技术可获得孵化率较高的绵羊胚胎。(二)培养体系的确立1.以胎鼠成纤维细胞为饲养层、采用SESC基础培养液(DMEMF12+10%胎牛血清+O.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM非必须氨基酸+20ng/ml LIF+10ng/ml bFGF+100IU/ml青霉素+0.05mg/ml链霉素)、胚胎直接贴壁获得内细胞团、通过机械法传代培养绵羊胚胎干细胞,摸索绵羊胚胎干细胞的培养体系。结果显示普通干细胞培养的技术路线适合于培养绵羊胚胎干细胞,可对其进行较深层次的研究。2.采用培养液Ⅰ和培养液Ⅱ两种不同液体、以胎鼠成纤维细胞为饲养层,通过胚胎直接贴壁获得内细胞团、运用机械传代法培养绵羊胚胎干细胞,比较分析两种培养液对培养绵羊胚胎干细胞的影响,并对其进行鉴定。结果显示,两种培养液都可用于绵羊胚胎干细胞的培养,培养液Ⅱ更利于细胞的生长。
吕丽华[9]2004年在《山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究》文中指出本文研究山羊卵母细胞体外培养、体外受精及胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的山羊胚胎体外生产体系。从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时探讨山羊胚胎干细胞的分离培养技术,为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究山羊卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高山羊卵母细胞的成熟率。使用微滴法培养,探讨山羊卵母细胞的回收、成熟液的调整对比、添加不同激素、以及不同抗氧化物质等对山羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3 层以上卵丘细胞包裹的A 级卵母细胞,添加浓度为1 μg/ml 的E 2、5 μM 的?-ME,成熟培养27h 可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率。使用国产绒促激素完全可以代替进口的FSH 和LH 用于山羊卵母细胞体外成熟培养,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究山羊体外受精条件的优化,为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。比较体外受精方法,不同获能物质的影响表明不同精子获能中,肝素效果比较稳定。Percoll 法处理精子卵裂率要显着高于上浮法,但是囊胚率和囊胚细胞数并没有提高。上浮法的精子镜检活力要好于Percoll 法分离的精子。但是,总体受精率、发育率还很低。试验叁通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合山羊胚胎体外发育的培养体系。通过共培养方法对共培养体系、换液程序、以及不同培养液的研究表明,在山羊胚胎培养中,基础培养液选用配制简单的SOF(CR1 也可使用),添加BSA/FCS,并采用正确换液程序,即48h 前是SOF+BSA,之后换为SOF+FCS 可获得理想的囊胚率和卵裂率。共培养条件下颗粒细胞和输卵管细胞对胚胎的发育并没有明显差异,但就发育率而言,显着优于无共培养体系。由此,说明共培养细胞类型对胚胎发育影响不大,但可以很好地克服胚胎的8~16-细胞阻滞。试验四利用透射电镜研究山羊体内胚和体外胚的超微结构,旨在对体外胚胎质量及其培养体系进行评价,为进一步提高体外胚胎的质量提供超微结构方面的理论依据。结果表明山羊体外胚胎质量要比体内发育胚差,包含有大量脂滴、畸形线粒体以及空泡化严重、细胞间隙连接较少且松散、核质比下降等。试验五以体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚叁种不同来源的囊胚为材料,分离山
刘羿羿[10]2010年在《山羊类胚胎干细胞和PGCs的培养与鉴定》文中指出为摸索山羊胚胎干细胞体外培养条件,本实验从胚胎来源、接种方法、饲养层、包被条件、生长因子等方面对影响山羊胚胎干细胞的分离、培养的因素进行了研究,并探索了山羊PGCs的体外培养条件,最后对胚胎干细胞和PGCs进行了鉴定。1.通过超数排卵、体外受精、核移植方法获取囊胚。将体内获取的山羊囊胚切半或将全胚接种到山羊胎儿成纤维细胞饲养层、胎牛肝脏成纤维细胞饲养层和小鼠胚胎原代成纤维细胞饲养层细胞上,比较贴壁率和传代次数后发现饲养层细胞和胚胎处理方法对山羊ICM贴壁和传代培养影响均显着,切半的山羊体内发育的囊胚在小鼠胚胎原代成纤维细胞上贴壁率最高为55.6%,可以在体外传至6代,而在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上孵化的全胚贴壁率最低为10%,体外仅传2代。2.分别采用高糖DMEM及低糖DMEM/F12干细胞培养液在小鼠胚胎原代饲养层细胞上培养切半的体外发育囊胚,待囊胚贴壁后用玻璃针剥离内细胞团,酶消化后传代培养。结果表明:低糖DMEM/F12更适宜于山羊ICM的增殖与克隆形成,ICM在低糖培养液中贴壁率为35.7%,可传5代,在高糖培养液中贴壁率为26.3%,可传3代,差异显着。3.为比较明胶和ECM对山羊类胚胎干细胞贴壁和培养的影响,将切半的体外发育的胚胎接种到小鼠胎儿原代成纤维细胞饲养层上,用低糖培养液培养,结果发现在明胶包被的培养皿上ICM贴壁率为35.7%,在ECM包被的培养皿上ICM贴壁率稍高,为40%,均可传5代,差异不显着。本实验比较了体外发育的囊胚和克隆囊胚的贴壁率并传代培养,结果发现:在ECM包被的培养皿、小鼠胚胎原代成纤维细胞饲养层上,低糖培养的条件下,核重编程囊胚ICM的贴壁率为25%,最高传2代,体外发育的囊胚ICM贴壁率为40%,最高传5代,差异极显着。4.将内蒙古白绒山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与生殖嵴周围细胞共同分离,在叁种培养体系中传代培养,结果表明:未添加任何因子的A培养体系仅能传1代,仅添加LIF及Insulin的B培养体系可以传至4代,添加LIF,Insulin及优质胎牛血清DMEM/F12的C组培养体系可以传至9代。5.对所分离的山羊类胚胎干细胞和PGCs细胞进行形态学分析、RT-PCR鉴定、AKP染色及免疫荧光检测,结果发现:山羊类胚胎干细胞和PGCs细胞可以形成类似鸟巢状的集落,细胞界限不清,核较大,易于周围饲养层细胞区别,AKP鉴定为阳性,RT-PCR检测β-actin、hTERT、GAPDH、Nanog、Oct3/4为阳性,免疫荧光鉴定发现Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4呈阳性,在体外可以形成有空腔的类胚体,可以体外分化为神经样细胞,脂肪细胞和上皮细胞状细胞。
参考文献：
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[9]. 山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究[D]. 吕丽华. 山西农业大学. 2004
[10]. 山羊类胚胎干细胞和PGCs的培养与鉴定[D]. 刘羿羿. 内蒙古农业大学. 2010
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