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不同来源裂解性多糖单加氧酶的酶学性质及功能研究

2020-12-02阅读(206)

不同来源裂解性多糖单加氧酶的酶学性质及功能研究

论文摘要

裂解性多糖单加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO）是最近发现的一类新型单铜氧化酶,通过氧化裂解多糖底物,增强糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases,GH）对多糖的水解效率。LPMO分布广泛,在细菌、古菌、真菌和昆虫中均有报道,但不同生境微生物LPMO的性质比较和功能研究少见报道。本论文以放线菌、肠道细菌和古菌的AA10家族LPMO为研究对象,通过异源表达获得三种不同来源的LPMO,比较其酶学性质差异并鉴定其对几丁质的氧化活性,在此基础上,对LPMO在天蓝色链霉菌几丁质降解过程中的功能进行同源验证。首先,从Streptomyces coelicolor（天蓝色链霉菌,放线菌）、Enterococcus faecalis（粪肠球菌,肠道细菌）和Natrialbaceae archaeon（古菌）中获得三个AA10家族LPMO基因,构建大肠杆菌表达系统,获得三个LPMO重组蛋白:ScLPMO10G、Ef LPMO10B、NaLPMO10A,其氨基酸序列和蛋白结构与典型的AA10家族LPMO的同源性较高。其次,比较了三种LPMO的酶学特性,发现其均具有几丁质氧化活性,ScLPMO10G、Ef LPMO10B、Na LPMO10A对几丁质酶的水解效率分别提高50.93%、48.74%、50.11%。三种LPMO的最适反应温度、pH和稳定性不同,其中,古菌N.archaeon来源的Na LPMO10A在较高温度（60℃）、高pH（pH 10.0）及高浓度Na+（1 mol/L）条件下的稳定性较好,在1 mol/L Na+溶液中保温8 h仍有70%以上的相对酶活。最后,成功构建了过表达ScLPMO10E和ScLPMO10G的天蓝色链霉菌菌株ScΔ10E（+）和ScΔ10G（+）,并实现了LPMO的过表达;以几丁质为唯一碳源生长时,ScΔ10E（+）和ScΔ10G（+）的胞外还原糖含量、胞外总几丁质酶活以及胞外酶系对几丁质的酶解效率均显著高于野生型菌株,几丁质酶解效率分别提高81.79%和224.74%,表明LPMO在链霉菌的几丁质降解中发挥重要作用。本文首次对不同生境微生物的LPMO性质进行比较研究,并对LPMO在天蓝色链霉菌几丁质降解过程中功能进行了同源验证,为LPMO的综合利用和生物质的高效降解提供指导,也为揭示LPMO的生物学功能奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 裂解性多糖单加氧酶概述
  •     1.1.1 LPMO的发现和命名
  •     1.1.2 LPMO的分类
  •     1.1.3 LPMO的应用
  •   1.2 裂解性多糖单加氧酶的结构及功能
  •     1.2.1 LPMO的蛋白结构
  •     1.2.2 LPMO的模块化结构
  •   1.3 裂解性多糖单加氧酶对多糖底物的氧化裂解
  •     1.3.1 LPMO裂解多糖的反应机理
  •     1.3.2 LPMO的电子供体来源
  •     1.3.3 LPMO活性检测的方法
  •     1.3.4 LPMO的酶学性质
  •   1.4 研究目的、意义和研究思路
  •     1.4.1 研究目的与意义
  •     1.4.2 研究思路
  • 2 裂解性多糖单加氧酶基因的克隆表达
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌种及载体
  •     2.1.2 引物
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 主要溶液
  •     2.1.5 培养基
  •     2.1.6 生物信息学分析软件及网站
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 LPMO来源菌种培养
  •     2.2.2 LPMO基因的克隆
  •     2.2.3 LPMO表达载体构建及鉴定
  •     2.2.4 LPMO蛋白序列的生物信息学分析
  •     2.2.5 LPMO的异源表达及纯化
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 LPMO基因的克隆
  •     2.3.2 LPMO表达载体的构建
  •     2.3.3 LPMO蛋白序列的生物信息学分析
  •     2.3.4 LPMO的异源表达及纯化
  •   2.4 本章小结
  • 3 裂解性多糖单加氧酶的酶学性质研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 主要试剂
  •     3.1.2 主要溶液
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 LPMO的底物特异性
  •     3.2.2 电子供体对LPMO活性的影响
  •     3.2.3 LPMO与几丁质酶协同降解几丁质
  •     3.2.4 温度对LPMO活性和稳定性的影响
  •     3.2.5 pH对 LPMO活性和稳定性的影响
  •     3.2.6 金属离子对LPMO活力和稳定性的影响
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 LPMO的底物特异性
  •     3.3.2 电子供体对LPMO活性的影响
  •     3.3.3 LPMO与几丁质酶协同降解几丁质
  •     3.3.4 温度对LPMO活性和稳定性的影响
  •     3.3.5 pH对 LPMO活性和稳定性的影响
  •     3.3.6 金属离子对LPMO活性和稳定性的影响
  •   3.4 本章小结
  • 4 裂解性多糖单加氧酶功能的同源验证
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌株及载体
  •     4.1.2 引物
  •     4.1.3 主要试剂
  •     4.1.4 主要溶液
  •     4.1.5 培养基
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 LPMO基因的克隆
  •     4.2.2 过表达LPMO的天蓝色链霉菌菌株构建
  •     4.2.3 重组天蓝色链霉菌蛋白过表达检测
  •     4.2.4 天蓝色链霉菌菌株生长特性测定
  •     4.2.5 天蓝色链霉菌胞外总几丁质酶活测定
  •     4.2.6 天蓝色链霉菌胞外酶系降解几丁质
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 过表达LPMO的天蓝色链霉菌菌株构建
  •     4.3.2 重组天蓝色链霉菌蛋白过表达检测
  •     4.3.3 天蓝色链霉菌菌株生长特性比较
  •     4.3.4 天蓝色链霉菌胞外总几丁质酶活测定
  •     4.3.5 天蓝色链霉菌胞外酶系降解几丁质
  •   4.4 本章小结
  • 5 结论与展望
  •   5.1 全文总结
  •   5.2 创新性
  •   5.3 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录 1 攻读硕士学位期间获得的学术成果
  • 附录 2 论文中涉及的核酸及氨基酸序列

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 刘宇昕

    导师: 余洪波

    关键词: 裂解性多糖单加氧酶,异源表达,几丁质,放线菌,肠道细菌,古菌

    来源: 华中科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 华中科技大学

    分类号: Q55

    DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.000742

    总页数: 86

    文件大小: 3972K

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