CRISPR辅助改造谷氨酸棒杆菌合成L-鸟氨酸

论文摘要

L-鸟氨酸（L-Ornithine）是尿素循环途径中的中间代谢产物,具有多种关键生理生化功能,在食品,医药和保健品领域具有广泛的市场需求。谷氨酸棒状杆菌SNK118（Corynebacterium glutamicum SNK118）是一株L-精氨酸工业生产菌株,本课题组已对其进行了全基因组重测序获得其DNA序列。本论文基于CRISPR-Cpf1系统的基因敲除和基于质粒的异源基因重组表达,对C.glutamicum SNK118进行系统工程改造用于高产L-鸟氨酸。本论文提供了一种有应用前景的高产L-鸟氨酸生产菌株和一种增强谷氨酸棒杆菌中辅因子NADPH的有效方法。（1）为切断鸟氨酸转化为瓜氨酸,并解除全局反馈阻遏调控的干扰,将SNK118基因组上的编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因argF和与其相邻的编码精氨酸阻遏物的基因argR同时敲除,获得菌株KBJ01。在500-mL摇瓶发酵84 h后,KBJ01菌株的L-鸟氨酸产量为28.24 g·L?1,是对照株JML04（SNK118ΔargR）的46倍(0.62 g·L?1)。（2）为增强L-鸟氨酸合成途径中的所需关键辅酶NADPH的供给,将糖丁基梭菌（Clostridium saccharobutylicum DSM 13864）来源的gapC（编码NADP+依赖型的三磷酸甘油醛脱氢酶）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis HB-1）来源的rocG（编码NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶）引入菌株KBJ01中,分别构建KBJ05（KBJ01/pXMJ19-CsgapC）和KBJ06（KBJ01/pXMJ19-BsrocG）。摇瓶发酵84 h后,重组菌KBJ05和KBJ06的L-鸟氨酸产量分别为34.75 g·L?1和32.93 g·L?1,比对照菌株KBJ02（KBJ01/pXMJ19）(26.98g·L?1)分别提高28.8%和22.1%,而糖酸转化率分别达到0.274 g·g-1和0.271 g·g-1,较KBJ02(0.237 g·g-1)分别提高了15.61和14.35%。（3）为缓解分支途径对丙酮酸的竞争,在KBJ01中敲除编码支链氨基酸通透酶的基因ncgl2228以抑制支链氨基酸的过量合成,得到突变株KBJ07,在500-mL摇瓶发酵84 h后,L-鸟氨酸产量增加至30.46 g·L?1,糖酸转化率达到0.26 g·g-1。（4）以上结果显示基因过表达和敲除对L-鸟氨酸产量的积极影响,为此综合上述两个策略,构建重组菌株KBJ09（KBJ07/pXMJ19-CsgapC）,KBJ10（KBJ07/pXMJ19-BsrocG）和KBJ11（KBJ07/pXMJ19-CsgapC-BsrocG）。在500-mL摇瓶发酵84 h后,菌株KBJ11的L-鸟氨酸产量最高,达35.85 g·L?1,糖酸转化率可达0.28 g·g-1。与对照菌株KBJ08（KBJ07/pXMJ19）的产量(30.34 g·L?1)相比,提高了18.16%。与菌株KBJ01相比,KBJ11产量提高了27%。（5）为进一步研究菌株KBJ11的性能,对其进行补料分批发酵。在5-L发酵中罐发酵80 h可产L-鸟氨酸60.01 g·L?1。10-L罐补料分批发酵,L-鸟氨酸产量达到88.26g·L?1,糖酸转化率达到0.41 g·g-1,其中生产强度为1.23 g·L?1·h-1（经过72 h）。本研究成果达到了鸟氨酸产量的领先水平。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 阚宝军

导师: 倪晔

关键词: 谷氨酸棒状杆菌,鸟氨酸,磷酸甘油醛脱氢酶

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

基金: 国家自然科学基金项目(31601463),国家轻工业技术与工程一流学科项目(LITE2018-07),高校学科人才引进计划(111-2-06)

分类号: Q78;TQ922

总页数: 63

文件大小: 3150K

下载量: 122

相关论文文献

• [1].L-鸟氨酸发酵菌种的代谢工程研究进展[J]. 微生物学报 2020(03)
• [2].固定化苏云金芽孢杆菌转化生产L-鸟氨酸[J]. 北京农学院学报 2014(01)
• [3].L-鸟氨酸产品开发与应用进展[J]. 中国酿造 2013(01)
• [4].L-鸟氨酸的功能与运动的关系及在运动实践中的应用展望[J]. 科技信息 2012(10)
• [5].表面活性剂对大肠杆菌产L-鸟氨酸的影响[J]. 中国食品添加剂 2012(02)
• [6].L-鸟氨酸的细胞转化制备及在卷烟中的应用[J]. 食品工业 2012(07)
• [7].低糖流加法生产L-鸟氨酸的优化研究[J]. 发酵科技通讯 2011(01)
• [8].N~δ-保护鸟氨酸的微波合成研究[J]. 安徽农业科学 2011(09)
• [9].纳滤在L-鸟氨酸后提取中的应用研究[J]. 膜科学与技术 2010(01)
• [10].L-鸟氨酸高产菌的原生质体融合育种[J]. 氨基酸和生物资源 2009(01)
• [11].L-鸟氨酸的制备及应用[J]. 生物加工过程 2008(01)
• [12].近红外光谱技术在酶法转化制备L-鸟氨酸过程中的应用[J]. 食品工业科技 2013(09)
• [13].一种新型治疗肝性脑病的药物:L-鸟氨酸苯乙酸[J]. 中国新药杂志 2013(11)
• [14].N-保护鸟氨酸的合成[J]. 化学世界 2011(04)
• [15].N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性位点的构成研究[J]. 现代生物医学进展 2008(03)
• [16].L-鸟氨酸-阿司匹林复合盐结晶工艺研究[J]. 食品与发酵工业 2013(07)
• [17].化学酶法制备D-鸟氨酸盐酸盐[J]. 安徽农业科学 2009(20)
• [18].N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的生物信息学分析[J]. 安徽农业科学 2008(10)
• [19].基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量[J]. 食品科学 2012(15)
• [20].定向诱变谷氨酸棒杆菌13032产L-鸟氨酸的研究[J]. 现代食品科技 2010(12)
• [21].钝齿棒杆菌中异源表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶合成L-鸟氨酸的研究[J]. 中国生物工程杂志 2018(07)
• [22].L-鸟氨酸盐酸盐细菌内毒素检查方法的建立[J]. 中国药物经济学 2014(12)
• [23].甘蔗水分胁迫响应的δ-鸟氨酸转氨酶基因克隆及分子特征分析[J]. 热带作物学报 2009(08)
• [24].成人鸟氨酸转移酶缺乏伴持续性脑谷氨酸盐代谢异常[J]. 国际医学放射学杂志 2009(06)
• [25].重组N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的表达条件优化[J]. 食品科学 2008(04)
• [26].由L-精氨酸化学酶法制备D-鸟氨酸盐酸盐[J]. 精细石油化工 2009(04)
• [27].L-鸟氨酸盐酸盐碳点的制备及其在细胞成像中的应用[J]. 湖北医药学院学报 2017(03)
• [28].L-鸟氨酸补料分批发酵的研究[J]. 食品与发酵工业 2011(04)
• [29].发酵法制备L-鸟氨酸苯乙酸盐的结晶工艺[J]. 食品与发酵工业 2015(07)
• [30].L-鸟氨酸发酵废菌渣水解固形物回用工艺的研究[J]. 食品研究与开发 2015(20)

标签：谷氨酸棒状杆菌论文;  鸟氨酸论文;  磷酸甘油醛脱氢酶论文;