利用CRISPR/Cas9技术构建流感病毒高产细胞系MDCK-Tpl2-/-

论文摘要

Tpl2是调节I型（IFNα/β）和II型（IFNγ） IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞（MOI=0. 1）,测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度。结果:靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2-/-);其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2-/-细胞培养上清的血凝效价提高了1. 78～2. 5倍。病毒接种后72h,MDCK-Tpl2-/-细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2. 8倍。结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础。

论文目录

1 材料与方法

1.1 病毒、质粒、细胞、鸡胚及小鼠

1.2 主要试剂

1.3 构建稳定敲除Tpl2的MDCK细胞系

1.3.1 sgRNA的设计和寡核苷酸链合成

1.3.2 pUC19-sgRNA载体构建

1.3.3 细胞的转染及分选

1.3.4 Tpl2基因敲除细胞系的鉴定

1.3.5 稳定细胞系的鉴定

1.4 Tpl2敲除MDCK细胞与亲本细胞生长动力学比较

1.5 流感疫苗生产用细胞基质MDCK-Tpl2-/-细胞的质量控制研究

1.5.1 细胞形态检查

1.5.2 微生物污染检测

1.5.3 病毒检测

1.5.4 致瘤性检测

1.6 流感病毒在MDCK-Tpl2-/-细胞上培养适应性检验

1.6.1接种流感病毒

1.6.2 红细胞凝集试验

1.6.3 TCID50测定

2 实验结果

2.1 合成sgRNA寡核苷酸序列并构建载体

2.2 p UC19-Tpl2-sgRNA质粒和p Cas9-GFP共转染MDCK细胞

2.3 Tpl2基因敲除单细胞克隆的筛选及鉴定

2.4 稳定敲除Tpl2基因的MDCK细胞的鉴定

2.5 Tpl2敲除的MDCK细胞与亲本细胞生长动力学比较

2.6 细胞形态检查

2.7 内、外源因子检测

2.7.1 微生物检测

2.7.2 病毒检测

2.7.3 MDCK-Tpl2-/-细胞的致瘤性检测

2.7.4 细胞培养上清血凝滴度的测定

2.7.5 细胞培养上清病毒TCID50滴度测定

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 刘赛宝,李亚芳,王辉,王伟,冉多良,陈洪岩,孟庆文

关键词: 细胞,细胞质控,禽流感病毒

来源: 中国生物工程杂志 2019年01期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 新疆农业大学动物医学学院,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

基金: 兽医生物技术国家重点实验室自主课题(SKLVBP2017010),国家自然科学基金(30771615),“十二五”农村领域国家科技计划(2011AA100305)资助项目

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20190106

页码: 46-54

总页数: 9

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