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丝状真菌柄孢霉（Podospora anserina）蛋白激酶SNF1及响应调节因子SSK1的功能分析

2020-12-02阅读(684)

丝状真菌柄孢霉（Podospora anserina）蛋白激酶SNF1及响应调节因子SSK1的功能分析

论文摘要

丝状真菌Podospora anserina（P.anserina）中含有非常多与木质纤维素降解相关的蛋白酶类,在生物能源转化方面具有重要意义,木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源,在生物燃料与其他增值化学品的生产和应用中具有巨大的潜在应用前景。P.anserina对纤维素酶的生物合成涉及许多生理过程,包括外部信号传感,信号转导,纤维素酶基因的转录和翻译,以及它们的分泌。外部信号传感是纤维素酶生产的最初步骤。为探讨蔗糖非发酵蛋白激酶（Surose non-fermenting protein kinase,SNF1）和响应调节因子SSK1对P.anserina的外部信号感应传导与纤维素利用中的潜在机制。我们通过生物信息学分析在P.anserina的基因组中鉴定了SNF1和SSK1的同源物,通过Split-Marker方法,对PaSNF1和PaSSK1基因进行敲除,通过抗性筛选、PCR验证以及Southern Blot验证阳性转化子,成功获得突变菌株△PaSNF1和△PaSSK1,与此同时构建突变回补菌株CPPaSNF1与CPPaSSK1。随后对野生型WT、突变菌株△PaSNF1和△PaSSK1、回补菌株CPPaSNF1与CPPaSSK1进行生长表型、替代碳源利用、渗透胁迫耐受反应、纤维素酶活力测定以及次生代谢产物合成鉴定等方面进行了比较分析。实验结果显示,（1）△PaSNF1与野生型菌株相比菌落生长速率明显下降,而△PaSSK1生长速率与野生型无异;显微观察发现,△PaSNF1和△PaSSK1与野生型相比菌丝直径明显减小。（2）△PaSNF1子实体数量明显减少,仅为野生型菌株的52%,而且△PaSNF1子实体发育成熟明显延迟;而△PaSSK1子实体数量及发育成熟与野生型类似。（3）△PaSNF1在不同碳源的培养基上生长速率均显著降低,特别是在木质素中抑制率高达52%,并且在葡萄糖碳源上也出现了抑制生长的现象;而△PaSSK1在不同碳源条件下的生长与野生型无异。（4）△PaSNF1在0.5M NaCl、0.5M KCl、0.5M山梨醇和0.75M甘油等渗透胁迫培养基上生长明显受到抑制;△PaSSK1在0.2M NaCl、0.3M KCl和0.5M山梨醇高渗透压处理下同样出现了生长抑制的现象,而对0.75M甘油却显示出有较强的耐受抗性。（5）氧化剂50μM甲萘醌同样抑制△PaSNF1的生长,但△PaSNF1对0.1%H2O2不敏感;而△PaSSK1对0.1%H2O2与50μM甲萘醌均不敏感。（6）△PaSNF1对热激反应显示出敏感性,热激处理后其生长减慢,抑制率显著提高;而△PaSSK1对热激反应并不敏感。（7）△PaSNF1显示对细胞膜抑制剂氟康唑抗性,与野生型相比,△PaSNF1的生长显著提高;而△PaSSK1对该条件并不敏感。（8）通过酶活力测定显示,△PaSNF1的滤纸酶活降低到野生型菌株的17.2%,羧甲基纤维素钠酶活仅为野生型的27.4%,β-葡聚糖苷酶酶活相当于野生型的50.3%;而△PaSSK1的外切葡聚糖酶活明显高于野生型菌株,β-葡聚糖苷酶酶活力却比野生型菌株低。（9）在HPLC及NMR分析发现,与野生型相比,△PaSNF1突变体柄曲霉毒素含量显著提高;与此相反,△PaSSK1突变体柄曲霉毒素含量显著降低,表明PaSNF1负调控柄曲霉毒素生物合成,PaSSK1正调控柄曲霉毒素生物合成,此外△PaSSK1突变体在7.5 min处产生了一个新的峰。根据上述结果,我们可以得出以下结论:（1）SNF1在应激反应、替代碳源的利用以及耐热性的调节中起着关键性的作用。重要的是,SNF1是丝状真菌生长发育以及次生代谢产物生物合成的关键调节因子;（2）SSK1在渗透胁迫中起到了重要的作用,并且对丝状真菌的次生代谢产物的合成至关重要。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 木质纤维素降解研究进展
  •     1.1.1 物理预处理方法
  •     1.1.2 化学预处理方法
  •     1.1.3 物理-化学联用预处理方法
  •     1.1.4 生物预处理方法
  •   1.2 丝状子囊真菌Podospora anserina简介
  •   1.3 蔗糖非发酵蛋白激酶
  •     1.3.1 SNF1蛋白激酶的结构
  •     1.3.2 SNF1蛋白激酶的功能
  •     1.3.3 SNF1蛋白激酶的研究进展
  •   1.4 响应调节因子SSK1
  •     1.4.1 双组分信号传导途径
  •     1.4.2 HOG-MAPK途径
  •   1.5 Split-Marker方法及应用
  •   1.6 研究目的、内容及意义
  •     1.6.1 研究目的与意义
  •     1.6.2 研究内容
  • 第二章 敲除基因SNF1对Podospora anserina的影响
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株及质粒
  •     2.1.2 实验所用溶液配制
  •     2.1.3 常用培养基
  •     2.1.4 实验设备
  •     2.1.5 实验试剂、试剂盒及酶类
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 P.anserina基因组DNA的提取
  •     2.2.2 敲除表达盒的构建
  •     2.2.3 P.anserina原生质体的制备与转化
  •     2.2.4 Southern Blot验证PaSNF1基因敲除突变体
  •     2.2.5 基因敲除突变菌株回补实验
  •     2.2.6 酶活力测定
  •     2.2.7 生物测定表型分析
  •     2.2.8 HPLC分析
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 P.anserina SNF1同源基因表征
  •     2.3.2 PaSNF1基因敲除突变体的构建与鉴定
  •     2.3.3 Southern Blot验证
  •     2.3.4 PaSNF1基因回补突变体构建
  •     2.3.5 PaSNF1对P.anserina菌丝生长的影响
  •     2.3.6 PaSNF1对子实体形态与孢子萌发的影响
  •     2.3.7 PaSNF1对P.anserina碳源利用的影响
  •     2.3.8 PaSNF1在环境胁迫耐受性方面的作用
  •     2.3.9 PaSNF1在次生代谢产物生物合成中的作用
  •     2.3.10 PaSNF1缺失对纤维素利用的影响
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 敲除基因SSK1对Podospora anserina的影响
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株及质粒
  •     3.1.2 实验室常用溶液配制
  •     3.1.3 常用培养基配制
  •     3.1.4 实验仪器
  •     3.1.5 实验试剂、试剂盒及酶类
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 P.anserina基因组DNA的提取
  •     3.2.2 敲除表达盒的构建
  •     3.2.3 P.anserina原生质体的制备与转化
  •     3.2.4 Southern Blot验证SSK1基因敲除突变株
  •     3.2.5 基因敲除突变株回补实验
  •     3.2.6 酶活力测定
  •     3.2.7 HPLC分析
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 P.anserina SSK1同源基因表征
  •     3.3.2 PaSSK1基因敲除突变体的构建与鉴定
  •     3.3.3 Southern Blot验证
  •     3.3.4 PaSSK1基因回补突变体构建
  •     3.3.5 PaSSK1对P.anserina菌丝生长的影响
  •     3.3.6 PaSSK1在环境胁迫耐受性方面的作用
  •     3.3.7 PaSSK1缺失对碳源利用的影响
  •     3.3.8 PaSSK1缺失对纤维素酶活力的影响
  •     3.3.9 PaSSK1在次生代谢产物生物合成中的作用
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间的研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 邓嘉雯

    导师: 田生礼

    关键词: 蔗糖非发酵蛋白激酶,基因敲除,木质纤维素降解

    来源: 深圳大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用

    单位: 深圳大学

    分类号: Q933;X705

    总页数: 82

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