猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP5单克隆抗体的研制

周艳君^[1]2005年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS)是一种以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为主要特征的传染病。由于PRRSV以侵害免疫系统为主,且易发生变异,可造成持续感染,而且具有抗体依赖增强作用,致使对该病的诊断和预防带来了很大困难。而通过单克隆抗体技术对PRRSV抗原表位进行深入研究,不仅有助于了解PRRSV抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意义。 本研究首先构建了含PRRSV CH-1a株各结构蛋白的重组表达载体pET30a-N、pGEX6p-rtM、pGEX6p-rtGP5、pET30a-GP4、pGEX6p-rtGP3和pGEX6p-rtGP2,并在大肠杆菌中进行了表达,利用PRRSV感染猪血清对表达产物进行Western blot分析,证实表达的六个融合蛋白都具有较好的反应活性。然后以PRRSV和表达的融合蛋白为抗原,免疫BAL B/c小鼠,最终共获得了16株针对N蛋白的单抗,15株针对GP5蛋白的单抗,5株针对GP3蛋白的单抗以及针对M蛋白、GP4蛋白和GP2蛋白的单抗各1株。 将N蛋白基因分为四个相互重迭的基因片段,对16株抗N蛋白的单抗进行鉴定,结果显示有7株单抗既能特异性识别ORF7-N2又能识别ORF7-N3的表达产物,其余9株单抗仅与全长的N蛋白发生反应,而不识别四个分段融合表达蛋白,推测9株单抗的抗原表位为构象依赖性抗原表位。将片段N2和N3相互重迭的部分(49-70aa)分成一系列小的基因片段,对7株单抗鉴定结果显示,有6株单抗能特异性识别融合多肽NEP3(49-58aa),而另外一株单抗N1H11对以上7个融合多肽均不识别,仅对49-70aa编码的肽段表现出了较弱的反应性,推测49-70aa仅是单抗N1H11抗原表位的一个组成部分。通过对NEP3从N端和C端进行一系列截短分析,确定了6株单抗抗原表位的主要功能区域,其中单抗N2H7识别的主要功能区域为H~(54)FPLA~(58)。单抗N2F7识别的主要功能区域为K~(52)PHFPLA~(58)。单抗N1A2、N1E3、N1G4、N2E5识别的主要功能区域为E~(51)KPHFP~(56)。对欧美分离株氨基酸的序列比较结果显示这叁个相互重迭的抗原表位在所有欧美分离株中都是高度保守的。而且利用PRRSV感染猪血清进行Western blot分析,结果表明抗原表位NEP3在PRRSV感染时具有较好的免疫优势。与LV株中由51-67aa和80-90aa共同组成的构象抗原表位不同,我们鉴定的抗原表位51-56aa、52-58aa和54-58aa虽然包含在这个构象表位之中,却是一个独立的线性免疫优势抗原表位,且位于核定位信号序列内部。 利用M基因两个相互重迭的片段M1(84-134aa)和M2(113-174aa)的融合表达产物对单抗M2B3进行检测,结果表明单抗M2B3既能识别M1又能识别M2基因片段的表达产物,推测其抗原决定区域位于二者相互重迭的部分112-134aa。选取二者重迭区域112-134aa并分别从N端和C端进行一系列截短,利用融合多肽ELISA对单抗M2B3进行鉴定,结果显示单抗M2B3不仅能特异性识别MEP1(112-134aa)而且还识别MEP2(117-134aa)和MEP3(112-129aa),但对其他融合多肽都不识别,据此确定117-129aa是单抗M2B3的主要抗原性区域。PRRSV感染猪血清中对MEP1～MEP3融合多肽进行Western blot分析结果显示,叁个融合多肽都能被感染猪血清特异性识别,因此确定表位117-129aa是PRRSV的优势抗原表位,

姚建聪^[2]2004年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP5单克隆抗体的研制》文中指出本研究用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组GP5蛋白，成功制备出4株针对GP5蛋白的单克隆抗体，并对单克隆抗体的特性进行了鉴定和分析。GP5系列表位单克隆抗体的研制，有利于开展GP5抗原表位的定位分析。同时，结合ORF5的遗传演化分析，有利于阐明GP5在PRRSV感染中的免疫学功能。 pGEX-4T-dORF5重组融合蛋白经亲和层析纯化后作为免疫抗原免疫8周龄Balb／c小鼠，第一次免疫用抗原加等量弗氏完全佐剂背部皮下多点注射，然后两次用抗原加等量弗氏不完全佐剂同法免疫，免疫剂量为100μg，只，融合前叁天做加强免疫，用不加佐剂抗原腹腔注射，剂量为100μg／只。获得免疫脾细胞，采用细胞融合技术与鼠源SP2／0骨髓瘤细胞进行融合。用部分纯化的pET32a-ORF5重组融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤，建立重组结构蛋白GP2间接ELISA方法，对重组GP5间接ELISA方法筛选出的阳性上清进行再次检测，淘汰假阳性孔。选择强阳性孔，采用有限稀释法进行亚克隆，获得4株稳定分泌抗GP5单抗的杂交瘤细胞系，分别命名为B6A3、B6A4、F12F10和B11F11B2。经间接ELISA检测，结果表明B6A3和B6A4效价达到1：320000，F12F10和B11F11B2效价在1：320000以上。对单抗进行亚类鉴定结果表明，所获得的4株单抗都为IgG2a亚类，轻链为κ型。免疫印迹试验表明，单抗B6A3、F12F10能与重组GP5产生反应。制备PRRSV细胞培养单层，间接免疫荧光抗体试验表明，B6A3、F12F10能与全病毒反应，产生特异性荧光。选择B6A3在HS.2H细胞系上进行病毒中和试验，结果表明该株单抗中和活性为可疑。把各株单抗分别作1：80000和1：160000稀释，B6A3和F12F10，B6A3和B11F11B2，F12F10和B11F11B2混合进行间接ELISA检测时，OD450nm值比其中任何一种单抗单独测定时的OD450nm值高。推测，B6A3和F12F10，B6A3和B11F11B2．F12F10和B11F11B2可能识别不同的抗原表位。

付利芝^[3]2005年在《PRRSV GP4和GP5多表位串联基因的表达及在小鼠诱导的免疫反应》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的传染病。本研究采用重迭区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension, SOEing)构建出两个含有PRRSV GP5和GP4优势抗原表位核苷酸片段的多表位串联基因,分析其真核表达重组质粒和原核表达产物在小鼠诱导的免疫反应。 采用SOEing PCR的方法将编码GP5的aa29～60和GP4的aa33～70核苷酸片段进行拼接,获得两个编码双表位多串联基因E54-2和E54-4。将E54-2和E54-4基因分别克隆至pcDNA3.1(+),构建出真核表达重组质粒pcDNA3-E54-2、pcDNA3-E54-4。采用SOEing PCR将E54-2基因与猪泛素基因(Ubiquiten)融合,获得融合基因Ub-E54-2,构建出真核重组表达质粒pcDNA3Ub-E54-2。将3种真核重组质粒分别转染COS7细胞,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4分别转染P815细胞,间接免疫荧光试验表明,重组质粒在哺乳动物细胞中能瞬时和稳定表达目的蛋白E54-2和E54-4。 将E54-2和E54-4基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-E54-2和pGEX-6P-E54-4,经在大肠杆菌中诱导表达,蛋白表达量分别为40%和30%。采用包涵体洗涤和电洗脱纯化重组蛋白GST-E54-2和GST-E54-4。Western-Blotting分析结果表明,重组蛋白可与猪源PRRSV阳性血清和鼠源的抗GP4和GP5血清发生特异性反应。 用3种真核表达重组质粒分别免疫小鼠,结果表明,3种真核表达重组质粒均能诱导体液免疫反应,产生特异性的抗GP4、GP5和多表位串联肽抗体。在首免后第28天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组和对照组之间抗GP5抗体水平差异显着(p<0.05);首免后第49天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组之间抗GP5抗体差异显着(p<0.05);在首免后第28天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组和对照组之间抗GP4抗体水平差异显着(p<0.05)。4免后3周,pcDNA3-E54-2免疫组中和抗体效价为1:16,pcDNA3-E54-4免疫组中和抗体效价为1:28。 用纯化的融合蛋白GST-E54-2、GST-E54-4和表达GST-E54-2和GST-E54-4融合肽的基因工程全菌体分别免疫小鼠。经ELISA检测结果表明,在3免后1周,E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗GP4和GP5抗体效价分别为1:1,600和1:3,200;E54-4全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗GP4抗体效价为1:3,200,抗GP5抗体效价分别为1:12,800和1:6,400。中和抗体检测结果表明,在3免后1周,E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗体效价分别为1:22.2和1:19.9;E54-4全菌免疫组和E54-4纯化蛋白免疫组抗体效价为1:45.7和1:33.9,高于E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组。 综上结果表明,构建的PRRSV GP4、GP5多表位真核重组表达质粒在小鼠体内可诱导特异性抗体产生,原核表达的GP4、GP5多表位串联肽具有良好的免疫原性,有开发成疫苗的潜在价值。

颜其贵^[4]2005年在《PRRSV-SCQ株结构基因生物信息学及人工感染仔猪病理变化与超微结构研究》文中研究表明猪生殖和呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又称蓝耳病(Blue-ear disease)是由动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的一种新的病毒性传染病,是一种以导致母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的新病。该病自发现以来已给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。病毒基因组约15kb,包括为聚合酶编码的最大的阅读框ORF1和为结构蛋白基因编码的阅读框ORF2-ORF7。本研究以频繁发生繁殖障碍症候群的母猪、出现顽固性呼吸症状和较高死亡率的仔猪饲养场为研究对象,运用血清流行病学调查方法(ELISA检测方法),对四川地区(包括重庆市的部分县市)的大型规模化猪场的种猪、部分商品猪群以及小型种猪场采取抽样和有针对性地对引种种猪进行PRRS的血清学调查。然后进行病毒的分离和病毒的分子生物学研究。主要研究包括: 1.运用IDEXX公司生产的ELISA检测试剂盒对所采集的血清样品进行检测。结果表明,收集的873份血清中,血清抗体阳性占326份,抗体阳性率为37.34%;其中:种母猪(包括后备猪)PRRSV抗体阳性率为38.29%(219/572),仔猪包括哺乳仔猪和断奶仔猪阳性率为36.84%(98/266),种公猪阳性率为25.71%(9/35)。 2.以出现繁殖障碍的母猪的血清并通过ELISA检测为抗体阳性者,接种Marc-145单层细胞,经盲传至第四代时出现典型的细胞病变效应(CPE);细胞培养物经电镜观察,发现其中有球形的病毒粒子,粒子大小为40-80nm,核心直径为20-40nm;用抗PRRSV特异性抗体能特异地中和病毒,中和指数为100,并将该地方分离株命名为PRRSV-SCQ;病毒毒力测定TCID_(50)为10~(-1.16)/0.05ml。根据Genbank中PRRSV北美洲株ATCC VR-2332的序列设计一对特异性引物,以PRRSV-SCQ RNA为模板,通过RT-PCR扩增其GP5基因片段,并将该片段插入克隆载体pMD 18-T的EcoRV位点;测序结果表明该GP5基因序列与PRRSV-VR2332、LV株的GP5基因核苷酸序列同源性分别为99.7%和61.6%,揭示SCQ地方分离株与VR2332株在基因型上更为接近,应属于美洲型。 3.成功地建立了分离株SCQ人工感染断奶仔猪的病理模型。利用本地分离株PRRSV-SCQ接种断奶仔猪,显微检查以肺泡隔增宽并有巨噬细胞增生为特点的增生性间质性肺炎以及发生广泛性微循环障碍所引起的病理变化具有一定的典型示病性。超微病理观察表明,在肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结和脾脏中,出现病变的细胞都有不同

司朝朝^[5]2015年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp1a的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种传染病,该病的主要特征是母猪出现繁殖障碍以及仔猪出现严重的呼吸道症状。自1987年在美国首次发现以来,在全球主要养猪国家广泛流行。1996年郭宝清等从猪场流产胎儿分离出该病毒,证实了我国存在PRRS的流行。在此后的时间里,该病在国内大部分地区流行并在部分地区呈上升趋势,给我国养猪业造成了极大的经济损失。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。研究表明,该病毒感染机体后能够引起免疫抑制,形成持续性感染,具有抗体依赖性增强作用,并且病毒基因组遗传变异显着。病毒基因组编码的蛋白可划分为结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白的功能主要作用在病毒RNA复制合成阶段并能够调控宿主对病毒的免疫反应过程。非结构蛋白1α (nsp1α)含有锌指结构域、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性区域、C-末端延伸区等区域,能够抑制I-干扰素产生,在PRRSV逃逸机体免疫的过程中起到重要的作用。本研究扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组质粒,表达重组蛋白作为免疫原,免疫动物后获得多克隆抗体及单克隆抗体。实验内容主要包括：1、PRRSV nsp1α原核表达及多克隆抗体的制备以真核重组质粒pcDNA3.1-nsp1α为模板,扩增出nsp1α片段,构建原核表达质粒pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)并优化培养条件。在37℃条件下,1mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4h,菌液超声破碎后SDS-PAGE电泳表明重组蛋白以包涵体形式大量表达;大量诱导菌液并超声破碎,高速离心后得到包涵体,经过一系列缓冲液洗涤后用8M尿素缓冲液溶解包涵体,复性的包涵体作为免疫原免疫新西兰大白兔。免疫叁次后,以包涵体复性液作为包被抗原,间接ELISA检测兔多克隆抗体血清,血清效价达到1：2048000以上。2、PRRSV nsp1α原核表达及单克隆抗体的制备以真核重组质粒pcDNA3.1-nsp1α为模板,扩增出nsp1α片段,构建原核表达质粒pET28a-nsp1α,转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃条件下,1 mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h, SDS-PAGE蛋白电泳表明重组蛋白以包涵体形式大量表达,用8M尿素缓冲液溶解包涵体后,采用透析复性；复性的重组蛋白包被ELISA板,间接ELISA表明重组蛋白能够识别猪PRRSV阳性血清与阴性血清,具有较好的免疫学反应活性；重组蛋白免疫BALA/c小鼠,叁次免疫后加强免疫一次,取小鼠脾脏细胞与SP2/0瘤细胞融合,以pET28a-nsp1α重组蛋白作为包被抗原,间接ELISA初次筛选阳性融合细胞,间接免疫荧光试验进一步筛选,最后得到稳定分泌nsp1α抗体的杂交瘤细胞；杂交瘤细胞注射小鼠腹腔,一周后收集腹水,间接ELISA检测效价达到1：512000。上述制备的nspla多克隆抗体和单克隆抗体进行Western blot、间接免疫荧光及免疫组化实验,均能够特异性识别真核重组蛋白pcDNA3.1-nsp 1α以及PRRSV BJ4株nspla天然蛋白。这为研制基于nspla检测的PRRSV诊断方法以及进一步研究nspla功能提供了研究基础。

刘涛^[6]2008年在《河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株ORF5基因的原核表达》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪繁殖障碍和呼吸道症状的传染病,对养猪业造成极大危害,控制这种传染病是生产上急需解决的问题,控制本病的关键之一在于生产高效的疫苗,但由于PRRSV变异很大,给高效疫苗的开发造成很大困难。本课题旨在从河北省本地猪场分离毒株,通过与已发表毒株的核苷酸和氨基酸序列进行对比,了解河北PRRSV的分子流行病学特点。并且以本地分离株为基础,克隆表达其诱导机体产生中和抗体的ORF5基因,构建成熟的原核表达系统,为今后基因工程疫苗的生产打下基础。本研究从河北省各地送检的六份疑似PRRS感染病料,经RT-PCR诊断试剂盒检测,阳性病料经处理后用Marc-145细胞增殖培养,其中沧州市送检病料接种Marc-145细胞后经过4代盲传后,开始出现细胞病变(CPE),经RT-PCR鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因片段,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化大肠杆菌Top10,阳性重组质粒进行序列测定与分析。通过与国际代表毒株及国内主要毒株比较分析,发现河北PRRS HB-3(cz)株与北美洲株亲缘关系较近,而与欧洲株关系较远;HB-3(cz)株与所有其它河北毒株序列同源性很高,疏水性、抗原性基本一致;06年夏以来河北省流行毒株亲缘关系很近。设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N端28个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,构建ORF5基因的原核表达质粒;将重组质粒转化Rosetta-DE3,经IPTG的诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为42.0kDa的目的蛋白,经Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,具有免疫原性;并对表达条件进行了优化。这为进一步研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。

王金凤^[7]2011年在《河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查》文中指出猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪发热、流产,断奶前、后的仔猪死亡率升高,不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病,它能引起免疫抑制、继发感染及其他疾病的免疫失败等。目前PRRS作为世界性流行病广泛传播于许多国家,已经成为全球兽医界关注的热点问题。我国1996年首次报道本病,关于该病发生、流行以及研究的报告日趋增多。PRRSV基因组易于变异的特性可导致病毒某些生物学特性发生改变,从而增加了该病的控制难度。因此,掌握PRRSV的流行变异趋势对于该病的防治将是十分有意义的。在PRRSV整个基因组中,非结构蛋白Nsp2和结构蛋白ORF5的变异最大,是进行PRRSV分子流行病学研究和病毒遗传变异分析的靶基因。因此,研究PRRSV的Nsp2、ORF5基因的变异具有十分重要的意义。本研究采集河北省2007～2011年间不同地区猪场的临床样本,选取肺脏、脾脏、淋巴结等组织和血清为材料,利用RT-PCR对PRRSV阳性病料中的Nsp2、ORF5基因进行扩增、克隆和序列测定,籍此分析我省近年来PRRSV的变异情况。通过RT-PCR方法,从样本中共获得16个Nsp2和ORF5基因。序列比较结果显示,所获得的16个Nsp2基因之间的核苷酸同源性为94.4%～99.8%,推导氨基酸同源性为88.3%～99.4%；与VR2332株的核苷酸同源性为73%～74.8%,推导氨基酸同源性为62.3%～68.5%；与2005年以前国内PRRSV流行毒株BJ-4、CH-1a、HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002相比,所获Nsp2基因与HB-1株的推导氨基酸同源性最高,为87.7%～93.2%。同时,获得的16个ORF5基因序列的核苷酸同源性为97%～99.8%,推导的氨基酸同源性在95%～99.5%之间；与VR2332和LV株的核苷酸同源性分别是87.1%～88.6%和55.2%～57.7%,推导编码氨基酸的同源性为87.9%～89.1%和62.5%～63.8%；结果表明,所获河北省PRRSV基因序列均属于北美洲型PRRSV,其Nsp2和ORF5基因变异很大。依据所获基因序列及GenBank中国内外代表性毒株相应基因序列推导的氨基酸序列分别绘制PRRSV的遗传进化树。结合Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析显示,全国流行的PRRSV毒株分属于3个亚群,其代表分别为BJ-4株、CH-1a株和HB-1株,我省流行的PRRSV毒株完全属于同一个亚群Ⅲ,与2002年分离到的HB-1株亲缘关系最近。

王玉娥^[8]2003年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。本研究利用噬菌体展示技术，结合ELISA和基因表达等技术对PRRSV结构蛋白的抗原表位进行了鉴定与分析，为PRRSV的结构蛋白免疫特性与功能研究以及表位疫苗的设计等奠定了基础。 1．运用GoldenKey分子生物学软件对PRRSV BJ-4结构蛋白的抗原表位及其二级结构进行了分析和比较，从中筛选13段显示表位特征的氨基酸残基序列，用PCR技术扩增相应的核苷酸片段，将其插入到噬菌体表达载体M13KE，结果预测的13个表位可在噬菌体表面得以展示。 2．利用PRRSV BJ-4阳性血清和鼠源抗重组结构蛋白抗体，采用间接ELISA方法对噬菌体展示的表位进行了鉴定。结果表明，在预测的13个抗原表位中，鉴定出7个表位。GP2a的aa110～aa136(GP2110)可被鼠源抗重组GP2a抗体所识别；GP3的aa81～aa91(GP381)能够被PRRSV阳性血清和鼠源抗重组GP3抗体识别；GP4的aa53～aa67(GP453)和aa107～aa115(GP4107)可被PRRSV阳性血清和鼠源抗GP4抗体识别；GP5的aa30～aa39(GP530)、aa161～aa169(GP5161)和aa190～aa200(GP5190)可被PRRSV阳性血清和鼠源抗重组GP5抗体识别。其中，GP2110、GP453和GP530等3个抗原表位与已报道的抗原表位相似，其余4个抗原表位(GP381、GP4107、GP5161和GP5190)是新确认的PRRSV抗原表位。 3．采用噬菌体随机7肽库对单克隆抗体GE3识别的抗原表位进行了鉴定。从第叁轮亲和筛选的噬菌体中随机挑取17个克隆进行功能鉴定，结果表明8个克隆与mAb GE3具有较强的特异性结合力并可以被PRRSV阳性血清阻断，测序发现7个克隆具有核心序列：P／EKPHF，该序列与PRRSV N蛋白aa50～aa55(P／EKPHF)具有较高的同源性。用PRRSV阳性血清和鼠源抗PRRSV抗体采用间接ELISA进行鉴定，结果表明筛选到的噬菌体克隆可以与血清发生特异性反应，从而初步确定了单克隆抗体GE3所识别的抗原表位。 4．将编码单克隆抗体GE3所识别的抗原表位的核苷酸片段插入到原核表达载体pGEX-4T-2中，实现了GE3所识别的抗原表位在大肠杆菌中的表达。经SDS-PAGE分析表明，表达的GST-融合蛋白与预期大小相符。Western-blot分析表明表达产物与PRRSV阳性血清没有反应性，而ELISA分析表明表达产物可与PRRSV阳性血清和单克隆抗体发生反应。由此说明单克隆抗体GE3所识别的抗原表位可能是存在于N蛋白上以KPHF为核心的构象型表位。

吴家强^[9]2008年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒分子遗传变异与疫苗研究》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称“猪蓝耳病”,是目前危害世界养猪业最严重的传染病之一,在临床上以造成怀孕母猪早产、流产、死胎以及仔猪的呼吸系统症状为主要特征。本文从PRRS的血清学调查、分子遗传变异、灭活疫苗研制、混合感染和PRRSV传染性cDNA克隆等方面进行了研究和探讨。1、PRRS血清学调查与病毒分离鉴定为了调查山东地区PRRS的感染状况,2004年至2006年从山东各地未免疫PRRS疫苗的猪场采集1,332份血样,采用IDEXX公司的间接ELISA试剂盒进行检测。结果表明,59.5%的血清样品呈PRRS抗体阳性,其中偏远农村的散养猪场和小规模猪场只有32.5%的血清样品呈PRRS阳性,然而,从大型规模化猪场采集的血清样品中PRRS抗体的阳性比例占83.1%。从PRRS阳性的猪场样品中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),在Marc-145细胞上呈现典型的细胞病变(CPE),但不同PRRSV分离株产生CPE的时间与类型不尽相同,并且不同分离株的毒力也存在较大差异。本研究结果表明,PRRS的流行状况与猪场规模大小和猪群密度密切相关,并且本地区猪场中存在不同表型的PRRSV分离株。2、PRRSV山东分离株分子遗传变异研究设计了4对PRRSV特异性引物,分别扩增5个PRRSV山东分离株的ORF5基因、ORF6基因、ORF7基因和Nsp2基因,并克隆至pMD18-T载体,送至公司测序,采用分子生物学软件分析病毒的分子遗传变异规律。序列分析表明,5个分离株ORF5基因的核苷酸序列同源性为88.2%-99.2%, ORF6基因的同源性为94.9%-99.8%, ORF7基因的同源性为93.5%-100%。其中两株PRRSV传统毒株与北美型代表株VR2332的核苷酸序列高度同源,而3株PRRSV变异株Nsp2蛋白缺失30个氨基酸,与国内以前报道的变异株JXA1株高度同源,与VR-2332株同源性相差较大。研究结果表明,山东省猪场近几年同时存在PRRSV传统毒株和变异株感染,并且近年来,山东PRRSV流行毒株有从传统美洲型向Nsp2基因缺失变异株演化的趋势。3、PRRS灭活疫苗(SD1株)研究在对PRRSV SD1株细胞生物学培养特性研究的基础上,我们对PRRS灭活疫苗生产工艺进行了研究,包括毒种繁殖、灭活方法、乳化工艺、安全检验与效力检验等内容。将效价大于107.0TCID50/mL的PRRSV-SD1株病毒培养液用终浓度为0.1%的甲醛于37℃灭活20 h,加入4%吐温-80作为水相,与油相(按油水比2:1的比例)于胶体磨中乳化而成。疫苗性状为油包水型,无菌检验合格,无毒副作用及其他不良反应。效力试验结果显示,当血清中和抗体效价≥1:10时,猪攻毒后表现基本正常,无不良反应。疫苗的免疫有效期可达6个月,4℃保存期暂定为12个月。田间试验和区域试验表明,母猪免疫后弱仔率、木乃伊胎率、死胎率下降约8%,仔猪成活率升高约10%,免疫猪群的中和抗体阳性率(≥1:10)可达80%以上。4、从PRRS疑似病料中检测PCV2的研究2005年至2007年期间从山东各地共收集156份PRRS疑似病料(组织和血清),其中102份经RT-PCR确定为PRRSV阳性。设计特异性引物,采用PCR技术,从PRRS疑似病料中检测猪圆环病毒2型(PCV2)。结果显示,有46份(29.5%)组织病料匀浆(肺、肝、脾、肾和淋巴结)为PCV2型阳性,然而,只有32份血清(20.5%)为PCV2阳性。其中,PRRS阳性病料中PCV2的阳性率为33.3%(34/102),而PRRS阴性病料中PCV2的阳性率仅为22.2%(12/54)。根据PCV2开放阅读框2(ORF2)绘制的遗传进化树分析表明,本研究中分离的PCV2核苷酸序列同源性在98.3%-100%之间,与国内外其他分离株相比,本地分离株更接近于法国分离株。研究结果表明,本地区PRRS疑似病料中PCV2的阳性率较高,而且其感染率在PRRS阳性病料和阴性病料中有着明显差异(P<0.05)。5、应用PRRSV传染性cDNA克隆构建PRRSV-PCV2重组病毒的研究PRRSV传染性cDNA克隆的研制成功使我们能够运用反向遗传学技术对病毒的基因组进行操作,在体外转染细胞,产生带有新的遗传标记的PRRSV。在本研究中,我们对运用PRRSV传染性cDNA克隆表达外源基因进行了探讨和尝试。因为PCV2是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要致病因子之一,而核衣壳蛋白基因(Capsid protein gene,即ORF2 gene)是PCV2的主要结构基因,其编码的核衣壳蛋白起具有重要免疫原性。在本研究中,我们首先采用PCR扩增出PCV2 ORF2基因,然后通过克隆技术插入PRRSV传染性cDNA分子克隆,转染细胞产生PRRSV-PCV2重组病毒。运用PCR技术和免疫荧光技术在重组病毒感染的细胞中成功验证了PCV2核衣壳蛋白的表达。为了进一步评估PRRSV-PCV2重组病毒的免疫原性,分别用PRRSV原始野毒和PRRSV-PCV2重组病毒各接种5头仔猪,另外一组接种Marc-145细胞培养液作为对照组。试验仔猪于第0d和第21d接种两次,颈部肌肉注射,然后分别于接种后4、7、14、21、28和35d各采血一次,检测PRRSV病毒血症持续时间和PRRSV、PCV2抗体水平。结果显示,PCV2抗体在接种后21d开始转阳,至少维持到接种后35d。与PRRSV原始野毒相比,PRRSV-PCV2重组病毒引起的病毒血症明显缩短。试验结果表明,PRRSV能够作为载体表达插入的外源基因,PRRSV重组病毒有望在不远的将来发展成为猪用多价疫苗,在临床上起到“一针防多病”的免疫功效。

郭杨^[10]2009年在《荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV方法的建立》文中指出猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是二十世纪八十年代末发现的一种高度传染性疾病,引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道疾病。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。在PRRSV的全基因组序列中,Nsp2基因是序列变异最大的基因之一。2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病。经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有Nsp2基因部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的。1将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNASTAR软件分析,参考国内外已经发表的Nsp2基因序列进行比较。经核酸序列分析比对后发现,SC-JX01株Nsp2基因与Genbank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性较高为98.1%-99.1%,氨基酸的相似性为96.3%-98.3%,表明所获得Nsp2基因序列的毒株属高致病性PRRSV型。同时发现共有30个氨基酸缺失,缺少氨基酸分别位于第481、第532-560位。将分离株与分离自不同地区高热病毒株的基因序列相比较,发现全部都具有相同的缺失,这说明引起猪高热病的病原变异不大;与较早期分离的AY150312、AY262352等毒株进行比较,发现缺失部位不同。对SC-JX01株Nsp2基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明与SC-JX01株Nsp2基因氨基酸序列性质一致。该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。2根据高致病性PRRSV Nsp2基因的缺失信息,设计合成一对引物,建立了基于Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV Nsp2变异株的方法。以含有高致病性PRRSV Nsp2基因的pMD-Nsp2质粒为阳性对照构建标准曲线,对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行评价,同时与常规RT-PCR进行了敏感性比较。结果表明,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号,PCR产物经测序证明为目的基因片断;检测线性范围广,在模板为3.15×10~9拷贝～3.15×10~0拷贝间有良好线性关系,相关系数为0.998 355;敏感度高,最低检测限为3.15拷贝;重复性好,组内变异系数为0.38%～2.22%,组间变异系数为1.74%～3.57%。3根据GenBank登录的高致病性PRRSV Nsp2基因序列和TaqMan探针荧光定量分析原理,利用Primer Express 3.0软件设计并合成了一对引物和一条探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV Nsp2变异株的方法。利用pMD-Nsp2质粒作为参比模板,对荧光定量RT-PCR的反应条件进行了优化,并对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,同时用建立的检测方法对以定量的10倍系列稀释质粒pMD-Nsp2为标准品进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达3.15拷贝,线性范围为10~9～10~0,达10个数量级;比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对3份不同的标准品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,组内变异系数为0.47%～1.61%,组间变异系数为1.64%～3.89%。用Nsp2-Taqman RT-PCR方法对猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法的检测灵敏度高出常规RT-PCR,与病毒分离检测方法的阳性符合率为100%,准确性达到预期目标,检测所需样本量少,可满足当前高致病性PRRSV Nsp2变异株的诊断需要。4本实验所建立的2种荧光定量RT-PCR方法(Power SYBR Green RT-PCR andTaqMan RT-PCR),具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、重复性好、通量高等优点,且荧光定量RT-PCR以闭管的模式操作,减少了后续步骤污染的可能性,整个PCR检测过程不到2 h。该方法的建立为高致病性PRRSV Nsp2变异株的早期快速诊断、分子流行病学调查等提供了一种新的快速定量检测手段,具有临床实用性。

参考文献：

[1]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 周艳君. 东北农业大学. 2005

[2]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP5单克隆抗体的研制[D]. 姚建聪. 中国农业大学. 2004

[3]. PRRSV GP4和GP5多表位串联基因的表达及在小鼠诱导的免疫反应[D]. 付利芝. 中国农业大学. 2005

[4]. PRRSV-SCQ株结构基因生物信息学及人工感染仔猪病理变化与超微结构研究[D]. 颜其贵. 四川农业大学. 2005

[5]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp1a的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备[D]. 司朝朝. 广西大学. 2015

[6]. 河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株ORF5基因的原核表达[D]. 刘涛. 河北农业大学. 2008

[7]. 河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查[D]. 王金凤. 河北农业大学. 2011

[8]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析[D]. 王玉娥. 中国农业大学. 2003

[9]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子遗传变异与疫苗研究[D]. 吴家强. 山东农业大学. 2008

[10]. 荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV方法的建立[D]. 郭杨. 四川农业大学. 2009

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