薛飞飞[1]2008年在《基于数据挖掘的肝郁脾虚证研究》文中提出中医学是个巨大的知识宝库,几千年的传承为中医学的研究提供了丰富的原始资料,而从这些资料中发现新的知识是中医科研的目的之一。数据挖掘是从数据库中识别出有效的、新颖的、潜在有用的模式的非平凡的过程,它融汇了人工智能、模式识别、模糊数学、数据库和数理统计等多种技术和方法。证候研究是中医临床治疗的基础,证候诊断的规范化和标准化是实现中医药现代化的必然条件。本研究以肝郁脾虚证为切入点,用数据挖掘技术中的数理统计的方法对肝郁脾虚证的古今文献进行了研究。不仅有助于加深认知肝郁脾虚的辨证论治规律,也为证候的研究提供了一种有价值的方法学上的探索。研究目的肝郁脾虚证是临床常见的证候之一,无论是古医籍还是现代期刊文献都为证候的研究积累了大量的原始数据。但这些数据大多都以零散的形式,存储在各种各样的文献或资料中。本研究用数据挖掘的方法对相关文献进行研究,试图从中发现肝郁脾虚证证候的一些普遍性规律,为肝郁脾虚证的规范化提供一定的依据,并为中医证候学研究提供方法学的探索。研究对象1、以《中华医典》中“肝郁脾虚证”、“肝郁证”和“逍遥散方证”的相关文献作为数据挖掘的数据集。2、以现代期刊中的“肝郁脾虚证”的相关文献作为数据挖掘的数据集。研究方法用数据挖掘中的方法之一——数理统计为挖掘工具,如频数分析、因子分析和判别分析等数据挖掘技术对古文献中肝郁脾虚证和肝郁证,以及现代期刊中的肝郁脾虚证的数据进行挖掘试验,从而发现并总结规律。研究结果1古代文献1.1肝郁证数据挖掘试验频数分析:情志因素如恼怒、思虑为肝郁证常见的病因;胸胁胀痛(闷)、腹胀(痛)、呕吐为肝郁证常见的症状;乳房疾病和胁痛在肝郁证所占的比例最大;逍遥散类方和柴胡疏肝散是肝郁证常用方剂;白芍、柴胡、香附等疏肝理气药是肝郁证常用中药;弦、沉、涩叁种脉象是肝郁证的常见脉象;情志过极和误用温热之剂是肝郁证最主要的禁忌。在有性别记录的医案中,肝郁证常出现于女性。因子分析:古代文献中肝郁证的主要兼证为肝气犯胃、肝郁脾虚和肝郁化火。逍遥散方在古代文献的肝郁证中应用比较广泛,理气、清热、化痰类药也是治疗肝郁证常用药物。1.2肝郁脾虚证数据挖掘试验频数分析:肝郁脾虚证症状频率超过10%的有胸胁胀痛(闷)、月经不调、脉弦、食欲不振、身热、乏力、腹胀(痛)、骨蒸潮热、口渴、烦热、呕吐、嗳气、急躁易怒、口苦。因子分析:古代文献中肝郁脾虚证的主要兼证为肝气犯胃、肝郁脾虚和肝郁化火和虚热证。卡方检验:与肝郁证相比,肝郁脾虚证中月经不调、食欲不振、身热、乏力、便溏、脘痞、面色萎黄、口渴等症状出现几率较高;而肝郁证的腹胀(痛)、便秘、头痛、腰背痛(酸、胀)、善太息、苔白腻等症明显高于肝郁脾虚证。2现代期刊2.1临床科研资料频数分析:总体和几种疾病的肝郁脾虚证出现频率最多的前5个症状都为:腹胀(痛)、胸胁胀痛(闷)、脉弦、舌淡红苔白、食欲不振和便溏,只是顺序稍有不同。古今文献相比,古代文献中各症状的出现率整体明显低于现代文献中各症状出现频率,症状比较分散,而现代文献记载的症状比较集中。卡方检验:肝病肝郁脾虚证频率高于其他疾病且有显着意义的症状有:乏力、面色萎黄、善太息、情绪抑郁;胃病肝郁脾虚证症状中频率高于其他疾病的有:舌淡红苔白、食欲不振、胃脘痛;肠道疾病肝郁脾虚证症状中频率高于其他疾病的:泄泻、肠鸣、善太息、舌淡红苔白、脉弦、腹胀(痛);抑郁症肝郁脾虚证症状中频率高于其他疾病的:情绪抑郁、脉涩/细、善太息、肠鸣。判别分析:乏力、面色萎黄和胸胁胀痛对肝病的贡献度较大;舌淡红苔白、食欲不振、胃脘痛对胃病贡献度较大;便溏、腹胀和泄泻对于肠道疾病贡献度较大;情志抑郁、善太息和脉弦涩对抑郁症的贡献度较大。对肝病、胃病、肠道疾病中几种疾病分别做了判别分析,并建立函数式,通过系数估计了各个症状对各种疾病的贡献度。2.2动物实验资料神经内分泌和中医肝脏的关系较为密切。对于神经递质类指标而言,海马和杏仁核往往结果相反,特别反映在CA1区和BLA。神经肽、神经营养因子和免疫系统的变化比较一致,神经肽在各部位都呈升高的趋势,神经营养因子和免疫指标在各部位呈现总体下降的趋势。可以由此推断慢性束缚应激大鼠在临床上更接近于中医的肝郁脾虚证,逍遥散的调节呈现出区域选择性、时相性和双向调节作用。结论:1、古代文献中肝郁脾虚证和肝郁证症状组成基本相似。肝郁证常见的兼证为肝郁脾虚、肝气犯胃和肝郁化热。2、现代文献中,腹胀(痛)、胁肋胀痛(闷)、脉弦、舌淡红苔白、食欲不振和便溏6症在各病肝郁脾虚证出现频率都很高,可以看作是肝郁脾虚证的核心证候,说明疾病各自的症状特点,并未掩盖总体证候特点。3、各病的肝郁脾虚证依然呈现着各自的特点,因此需建立疾病之上的共性标准及基于疾病的个性诊断标准。4、通过判别分析,对肝病、胃病、肠道疾病和抑郁症的肝郁脾虚证初步建立了计量诊断函数,为肝郁脾虚证的规范化提供了一定的诊断依据。5、以方测证,现代文献中记载的肝郁脾虚证造模方法比较成功,逍遥散的调节呈现出区域选择性、时相性和双向调节作用。
马庆宇[2]2017年在《肝郁脾虚证大鼠下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的变化及逍遥散的调节作用》文中研究表明1研究背景肝郁脾虚证是中医常见证候,可见于抑郁症、腹泻型肠易激综合征、慢性肝病、亚健康等临床多种疑难病症的不同阶段。在这些难治性疾病的治疗过程中,现代医学和传统中医学均体现了各自的优势。现代医学擅长掌握疾病的诊断和病理生理过程,侧重于疾病本身,而中医的特色则是辨证论治,是对证治疗,更注重与病症相关的证候。对肝郁脾虚证的生物学基础研究有助于我们探寻其证候实质并更好地应用于临床治疗。目前中医"微观辨证"的发展为证候的研究提供了新的思路,与症状和体征等信息比较,微观指标更容易量化和标准化,一些生物标志物的研究随着科技的发展而受到了比较多的重视。这对中医辨证论治体系的完善和中西医诊断方法的结合具有重大的意义。脑-肠肽(brain-gut peptide,BGP)是一类在中枢神经系统和胃肠道表达的内分泌信号分子,通过脑-肠轴(肠-脑轴)参与摄食调节及能量平衡。Nesfatin-1作为一种新发现的抑制摄食的BGP,能够以非饱和的状态自由通过血-脑屏障。另外,nesfatin-1也被证实参与了应激反应并且与抑郁状态呈正相关。目前认为,在下丘脑内部存在着nesfatin-1-POMC/OT网络系统。下丘脑弓状核(arcuate nucleus,ARC)中的阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)神经元可以被外源性(来自于外周或室旁核)或者内源性(ARC自身表达)的nesfatin-1所激活,并通过黑皮质素通路或者激活室旁核(paraventricular nucleus,PVN)的催产素(oxytocin,OT)通路来起到抑食作用。这一网络系统的正常运转保证了 nesfatin-1在生理状态下对摄食的调节功能,而一旦平衡被打破,就会出现一系列的神经精神相关症状和胃肠道功能紊乱症状。本课题组前期研究表明,肝郁脾虚证模型大鼠存在着广泛的BGP水平的改变,这可能是肝郁脾虚证脑-肠互动功能发生障碍的原因之一。但nesfatin-1及nesfatin-1-POMC/OT网络与肝郁脾虚证的关系目前尚未见相关研究。逍遥散是中医用于治疗肝郁脾虚的名方,已被广泛地运用于肝郁脾虚证的相关研究中。本研究团队前期实验研究观察到,以慢性束缚21天建立应激模型,以逍遥散干预,对肝郁脾虚证起到突出的调节作用。逍遥散的作用机制可能与调节多种BGP有关。但逍遥散是否能通过调整nesfatin-1及nesfatin-1-POMC/OT网络而改善肝郁脾虚证,目前尚不明确。2 研究目的本课题通过分析脑-肠肽nesfatin-1相关信号的变化来探讨肝郁脾虚证的实质及"肝郁"与"脾虚"之间的相互作用。首先确认肝郁脾虚证模型大鼠是否存在nesfatin-1信号的变化,然后进一步分析其变化的来源及作用途径,最后分析nesfatin-1信号对摄食调节中枢下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的影响,并观察逍遥散的调节作用。3研究方法本实验主要由四部分组成。实验一首先结合课题组前期实验研究,以21天慢性束缚应激方法复制肝郁脾虚证大鼠模型。观察模型大鼠一般状况、体重、进食量、旷场及糖水实验的行为学变化、血清D-木糖含量及外周皮质酮(corticosterone,CORT)水平,并运用以方(逍遥散)测证和以药(氟西汀)测症的方法,对肝郁脾虚证动物模型进行评价。实验二分别运用酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)法和酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法对模型大鼠外周关键的抑食因子nesfatin-1和促食因子饥饿素(ghrelin,GHRL)在血清中的含量进行检测,分析两者之间的相关性。随后观察逍遥散干预对外周nesfatin-1信号的调节作用。实验叁首先筛选适合于本实验设计所用的实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术的内参基因,随后以此内参基因为参照观察各组大鼠下丘脑及胃底部的NUCB2/nesfatin-1 mRNA表达,并对下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络相关的基因表达进行检测,同时观察逍遥散的调节作用。实验四应用免疫印迹法(Western blot,WB)和/或免疫组织化学法检测各组大鼠下丘脑NUCB2/nesfatin-1、POMC、OT、以及黑皮质素受体亚型4(melanocortin recepter subtype4,MC4R)的蛋白表达水平,并使用免疫荧光双染法对nesfatin-1-POMC/OT网络相关的分子进行共定位,以探讨肝郁脾虚状态下下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的变化及逍遥散的调节作用。4实验结果实验一:大鼠暴露于慢性束缚应激状态下逐渐出现摄食量的降低和体重增加的减缓,出现毛发枯黄、懒怠少动、大便干湿不调等外观体征状态变化;行为学研究显示:旷场实验中大鼠移动总距离和中央区停留时间降低,糖水试验中蔗糖偏好率降低;微观指标检测显示:血清D-木糖含量降低,CORT水平升高。而逍遥散组和氟西汀组则较模型组大鼠各项指标明显改善。实验二中EIA及ELISA检测显示:与正常组相比,模型组大鼠nesfatin-1在外周血清的浓度明显升高,GHRL的含量明显降低,并且各组大鼠血清nesfatin-1水平和GHRL浓度负相关,而逍遥散组大鼠则较模型组大鼠nesfatin-1水平明显下调,GHRL水平明显上调。实验叁中内参基因的筛选显示,亲环素A(Peptidylprolylisomerase A/cyclophilin A,PPIA)为本实验设计中最适合用于检测下丘脑基因变化的内参基因。随后的RT-qPCR检测显示:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑NUCB2/nesfatin-1mRNA无显着变化;而下丘脑的POMC、OT和MC4R以及胃底部的NUCB2/nesfatin-1 mRNA表达均升高,与正常组比较具有统计学意义。经过逍遥散干预后,大鼠下丘脑POMC、OT和MC4R的基因表达及胃底部的NUCB2/nesfatin-1 mRNA表达均明显下调。实验四中WB检测结果与实验叁中基因表达情况基本一致;免疫组化染色显示:NUCB2/nesfatin-1免疫阳性神经元在下丘脑ARC及PVN广泛分布,而POMC仅分布于ARC,OT仅分布于PVN。免疫组化半定量统计分析说明,在下丘脑ARC区,模型组大鼠POMC免疫阳性神经元阳性细胞率和平均光密度值较正常组均出现明显升高,而NUCB2/nesfatin-1则没有明显变化;在下丘脑PVN区,模型组大鼠OT和NUCB2/nesfatin-1免疫阳性神经元阳性细胞率及平均光密度值较正常组均出现明显升高,而逍遥散组与模型组相比则明显减少。免疫荧光双染结果表明,NUCB2/nesfatin-1神经元在下丘脑ARC及PVN广泛分布;POMC仅分布于ARC,OT仅分布于PVN。在ARC可见 POMC 和 NUCB2/nesfatin-1 双染神经元,在 PVN 可见 OT 和 NUCB2/nesfatin-1 双染神经元。5结论及意义实验一的模型评价结果说明本实验成功地复制了 21天慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠模型,此模型大鼠存在着类似于中医肝郁脾虚证的情绪抑郁(抑郁样行为)、腹胀食少(体重增长减缓和进食量降低),消化吸收能力差(D-木糖吸收能力下降),便溏不爽(大便形态改变)等变化,而运用中药复方逍遥散和治疗抑郁症的经典药物盐酸氟西汀干预后各指标的逆转也从侧面印证了模型的成功建立。实验二结果表明肝郁脾虚证大鼠模型存在着nesfatin-1和GHRL这两个作用相反而又互相制约的摄食调节因子的改变,在慢性应激状态下,外周的抑食-促食平衡被打破,而这种失衡状态对中枢神经系统的摄食调节区域的影响值得我们进一步研究。实验叁结果证实下丘脑的PPIA基因在慢性束缚应激刺激、逍遥散干预、氟西汀干预的影响下稳定性最高,这为以后类似的实验中RT-qPCR检测提供了可靠的内参照。随后的RT-qPCR检测中,模型组胃底部NUCB2/nesfatin-1mRNA显着升高,说明肝郁脾虚状态下大鼠血清nesfatin-1水平的升高很可能是从胃组织表达分泌而来的。虽然模型组大鼠下丘脑NUCB2/nesfatin-1的基因表达与正常组相比无显着改变,但是下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络却被过度激活,这说明外周的nesfatin-1信号通过血液循环到达下丘脑发挥抑食作用。逍遥散干预可以不同程度地改善这种失衡状态,在调节情志变化的同时减轻胃肠道症状。实验四的WB检测进一步证实了 RT-qPCR的结果。在持续的应激下,外周的nesfatin-1表达增高可以激活下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络,这一过程可能是通过脑-肠轴实现的。通过氟西汀或逍遥散处理,可以通过降低外周nesfatin-1水平、抑制下丘脑POMC/OT网络的激活,从而起到疏肝解郁、调节食欲的作用。本研究结果提示:肝郁脾虚证模型大鼠存在着外周血清nesfatin-1浓度的升高和下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的过度激活,通过这一信号途径,模型大鼠的进食量和体重出现了明显的降低,并且伴随着抑郁样的情绪状态。逍遥散干预后相关指标的逆转说明其可能通过调节外周nesfatin-1信号以及下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络从而起到疏肝解郁、调节食欲的作用。以此为切入点揭示了肝郁脾虚证脑-肠轴食欲调节失衡的机制,以及中药复方逍遥散疏肝解郁、健脾调节食欲作用的靶点和机理。
李长安[3]2017年在《心理应激哮喘大鼠模型的建立及调肝理肺法作用机制研究》文中指出研究目的哮喘是典型的心身疾病,心理应激在疾病过程中起着重要作用。既往研究显示,情志可引起神经-内分泌-免疫失衡,HPA轴是其主要调节途径之一。心理应激条件下,哮喘气道炎症明显增强,对激素反应性下降;其作用机制可能与糖皮质激素受体表达及功能下调,激素敏感性下降有关。本研究模拟临床情志致病特点,建立心理应激哮喘大鼠模型,通过相关指标检测,揭示心理应激哮喘大鼠HPA轴功能变化情况及其与气道炎症反应的相关性;并通过哮喘宁颗粒对心理应激哮喘大鼠进行干预,观察模型大鼠宏观表征、行为学以及血清、灌洗液、肺组织相关指标变化,探索调肝理肺法对心理应激哮喘大鼠HPA轴及气道炎症的调控作用,阐明调肝理肺法的作用机理和作用环节。研究方法本研究在前期工作基础上,将雄性SD大鼠随机分为正常组、应激组、哮喘组、应激哮喘组、西药组和中药组。并模拟临床情志致病特点,采用卵蛋白混合致敏联合束缚制动的方法,建立心理应激哮喘大鼠模型,从宏观表征、行为学、肺通气功能等客观指标进行模型评价;并通过检测血清、灌洗液内CRH、ACTH、CORT水平,肺组织GR表达及气道炎症因子含量,深入研究模型大鼠HPA轴功能的变化及其与气道炎症反应的相关性。并用哮喘宁颗粒对心理应激哮喘大鼠进行干预,与其余各组相比较,观察血清及BALF、肺组织中相关指标浓度、阳性细胞表达及蛋白表达的变化情况,研究调肝理肺法对心理应激哮喘大鼠HPA轴功能及免疫炎症失衡的调节作用。研究结果1)采用OVA混合致敏联合束缚制动成功建立心理应激哮喘大鼠模型。结果显示应激哮喘组大鼠表现为兴趣减退、毛发晦暗无光泽、便溏、饮食量减少、体重增加缓慢;激发过程中有抓咬口鼻、体腹部皮肤,呛咳、喷嚏及喉中哮鸣音等表现。与正常组相比较,应激哮喘组水平运动、垂直运动得分明显下降(P<0.05,P<0.01);蔗糖水偏好程度、悬吊实验挣扎次数下降(P<0.01);悬吊实验中不动时间明显增加(P<0.01);肺通气功能 PEF、FEF25-75%、FEV0.3/FVC 下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01),气道阻力Ri、Re明显升高(P<0.05,P<0.01);静脉血嗜酸粒细胞升高(P<0.01);肺组织炎症细胞浸润明显。与应激组或哮喘组相比,应激性哮喘组的症状、体征和相关指标均明显恶化。2)与正常组比较,应激哮喘组大鼠血清、BALF内CRH、ACTH、CORT及IgE、IL-4、IL-17含量明显增高(P<0.01),IFN-γ含量明显下降(P<0.01)。肺组织中GR阳性表达及含量明显下降(P<0.01);而IL-4、IL-17阳性细胞表达及含量增高明显(P<0.01);IFN-γ阳性细胞表达明显减低(P<0.01),而肺组织IFN-γ含量轻度减低,差异无统计学意义(P>0.05)。与应激组或哮喘组相比,应激性哮喘组的HPA轴及气道炎症相关指标均有不同程度加重。相关性研究显示,CORT与IL-4、IL-17、IgE呈正相关,与IFN-y呈负相关;而肺组织中GR水平与之相反,即与IFN-y含量呈正相关,而与IL-4、IL-17等呈负相关。而CORT含量与心理应激哮喘大鼠行为学指标相关性研究发现,CORT含量与糖水消耗量、糖水比例等呈负相关,而肺组织GR含量与糖水消耗量、糖水比例、翻动次数及水平垂直运动呈正相关;但与静止时间呈负相关,相关性较弱。3)哮喘宁颗粒治疗后,中药组大鼠前期活动减少,反应迟缓,毛发晦暗,后期情绪改善,较为活跃,饮食量增加,对周围事物兴趣增高;激发过程中呼吸频率增快,腹肌收缩加深、加快,时有搔抓头面、体腹部毛发。与模型组相比较,中药组大鼠水平运动、垂直运动得分明显增加(P<0.01);蔗糖水偏好程度、悬吊实验挣扎次数明显增高(P<0.01,P<0.01);悬吊实验不动时间明显降低(P<0.01);肺通气功能中药组大鼠PEF、FEF25-75%、FEV0.3/FVC轻度增高;而Ri、Re减低,差异有显着统计意义(P<0.01);静脉血嗜酸粒细胞明显降低(P<0.01);肺组织中炎症细胞浸润明显减少。中药组大鼠血清、BALF内CRH、ACTH、CORT含量较应激哮喘组明显下降(P<0.01),而肺组织GR阳性表达明显增高(P<0.01),其含量轻度升高,差异无统计学差异(P>0.05)。而血清、BALF及支气管肺组织IL-4、IL-17含量及阳性细胞表达明显下降(P<0.01);肺组织IFN-γ阳性细胞表达明显降低(P<0.01),而含量略有降低,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性研究结果显示CORT含量与IFN-γ呈负相关,而与IgE、IL-4、IL-17等炎症指标呈正相关;而肺组织GR含量与IFN-γ水平呈正相关,而与IL-4、IL-17等炎症指标呈负相关。而CORT含量与大鼠行为学相关性研究发现,CORT含量与糖水消耗量、糖水比例、翻动次数及垂直运动次数呈负相关;而与静止时间呈正相关,但相关性均较弱,无统计学差异(P>0.05)。研究结论1)采用OVA混合致敏联合束缚制动成功建立心理应激哮喘大鼠模型,符合支气管哮喘肝失疏泄、肝肺失和证候学特征。2)心理应激通过诱导哮喘HPA轴功能失调,GR表达下调,降低CORT抗炎作用;诱导Th2、Th17免疫偏移,抑制Th1炎症反应,引起Th1/Th2免疫失衡、气道免疫炎症增强,从而促进哮喘发生、发展。3)调肝理肺法可显着改善哮喘心理应激哮喘大鼠焦虑、抑郁程度;同时降低心理应激哮喘大鼠血清、支气管肺泡灌洗液HPA轴相关指标,增加肺组织GR表达,调节Th细胞平衡,降低气道炎症;提示调肝理肺法可能通过调控HPA轴功能,减轻气道炎症反应,从而实现对心理应激哮喘的治疗作用。
李聪[4]2017年在《肝郁证模型大鼠高泌乳素及神经-内分泌-免疫机制和相关方药的作用》文中研究指明本研究基于"方证相关"理论,以肝郁证、泌乳素与神经-内分泌-免疫网络叁者之间的关联性和柴胡疏肝散对肝郁证的疗效为立论前提,根据中医病因学及发病学的原理复制了肝郁证大鼠模型,以中医肝郁证存在免疫系统和PRL异常及PRL可能参与其免疫功能调节为问题切入,探查不同时间点的免疫功能状态、PRL及其相关调节因素的变化,以从泌乳素神经-内分泌-免疫关联的角度探讨中医肝郁证的现代内涵。在此基础上,以"肝郁证-PRL-细胞免疫-分子信号通路"之间的关联为切入,从系统生物学和分子生物学角度,探讨肝郁证模型泌乳素—免疫细胞功能—泌乳素受体及其信号通路关联蛋白和目的基因的变化上,探查柴胡疏肝散、氟西汀和溴隐亭对模型上述环节的干预效应。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献研究主要是对肝郁证及其现代神经-内分泌-免疫学内涵和泌乳素免疫调节作用的实验和临床研究进展进行了综述。实验研究包括研究一和研究二两部分,研究一侧重探查不同时间点肝郁证神经内分泌免疫状态及泌乳素分泌水平的变化;研究二重点探查肝郁证高泌乳素血症神经-内分泌-免疫异常机制及柴胡疏肝散作用。研究一 肝郁证模型大鼠的免疫功能状态及泌乳素变化方法:大鼠随机分为正常对照组、肝郁模型组。模型组按慢性束缚制模方法处理,连续28d;分别于造模第15d、22d、29d,腹主动脉取血,低温取下丘脑;酶免法测定血清NE、E、IL-2、IL-6、γ-IFN、TNF-α,下丘脑5-HT、DA;放免法测定下丘脑TRH、血清CORT,PRL;流式细胞仪法测定CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T。各组指标数据均以(x±s)表示,数据符合正态分布采用独立样本t检验。结果:造模两周后,模型大鼠开始出现易怒烦躁,并逐渐转为情绪低落、表情淡漠和争斗减少,伴见饮食减少,大便较干;与正常组相比,模型大鼠2W末、3W末、4W体重均见明显降低(P<0.01);模型大鼠2W末、3W末、4W活动状态和情绪睡眠积分明显增加(P<0.05或P<0.01)、4W末皮肤毛发积分值明显增加(P<0.05);模型大鼠2W末、4W末糖水偏嗜量明显降低(P<0.01)。模型大鼠2W末血清NE、E、CORT、PRL、TNF-α、γ-IFN、CD3、CD4含量明显增加,血清IL-6含量和下丘脑5-HT、DA含量明显降低(P<0.05或P<0.01);3W末、4W末血清NE、E、CORT、PRL含量和下丘脑5-HT和TRH含量明显增加,血清IL-2、IL-6、TNF-α、γ-IFN、CD3、CD4、CD4/CD8含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。研究二肝郁证模型大鼠高泌乳素及神经-内分泌-免疫机制和相关方药的作用方法:大鼠随机分成正常组、肝郁组、柴胡疏肝散大剂量组、柴胡疏肝散小剂量组、溴隐亭组、氟西汀组。实验期间观察并记录各组大鼠每周外观行为和体重的变化。模型组分别按上述方法造模,连续28d;于造模第15d,西药组分别给予溴隐亭0.22mg/kg·d灌胃,氟西汀1.8mg/kg·d灌胃;中药大剂量组大鼠给予柴胡疏肝散颗粒1.24g/kg· d灌胃,小剂量组大鼠给予柴胡疏肝散颗粒0.31g/kg·d灌胃,1次/d,连续14d。实验第29d,腹主动脉取血,低温取下丘脑和垂体。酶免法测定血清NE、E、IL-2、IL-6、γ-IFN、TNF-α,下丘脑5-HT、DA;放免法测定下丘脑TRH、血清CORT,PRL;流式细胞仪法测定CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T。蛋白免疫印迹法测定T淋巴细胞STAT5、PRLR蛋白表达;实时荧光定量PCR法测定T淋巴细胞IRF-1基因表达;免疫荧光法测定垂体PRL蛋白表达。各组指标数据均以(x土s)表示,采用单因素方差分析(one-wayANOVA)后,行多组间比较,采用LSD检验。结果:造模两周后,模型大鼠开始出现易怒烦躁,并逐渐转为情绪低落、表情淡漠和争斗减少,伴见饮食减少,大便较干;与正常组比较,模型大鼠1W末、2W末、3W末、4W体重均见明显降低(P<0.01);模型大鼠2W末、3W末、4W活动状态和情绪睡眠积分明显增加(P<0.05或P<0.01)、4W末皮肤毛发积分值明显增加(P<0.05);模型大鼠2W末、4W末糖水偏嗜量明显降低(P<0.01);模型大鼠2W末爬行格数、直立次数、中央格停留时间、里程数均明显升高(P<0.01),修饰次数明显降低(P<0.01),4W末爬行格数、直立次数、修饰次数、里程数均明显降低(P<0.05或P<0.01),中央格停留时间明显升高(P<0.01);模型大鼠4W末血清NE、E、CORT、PRL含量、下丘脑5-HT和TRH含量和垂体PRL表达量明显增加,血清IL-2、IIL-6、TNF-α、γ-IFN、CD3、CD4、CD4/CD8含量、T淋巴细胞STAT5蛋白、PRLR蛋白和IRF-1 mRNA表达量明显降低(P<0.05 或 P<0.01)。给药2W后,柴胡疏肝散大剂量组大鼠情绪改善明显,活动稍增多,饮食有所增加；柴胡疏肝散小剂量组和溴隐亭组大鼠无明显变化;氟西汀组大鼠情绪改善明显,活动和饮食增多,扎堆倦卧减少,皮肤毛发明显改善。与肝郁模型组比较,柴胡疏肝散大剂量组大鼠体重、糖水偏嗜度、爬行格数、里程数以及血中IL-2、IL-6、TNF-α、γ-IFN、CD3+T淋巴细胞数、CD4+T淋巴细胞数、CD4/CD8T淋巴细胞数、T淋巴细胞STAT5蛋白、PRLR蛋白和IRF-1mRNA表达量均明显升高,活动行为积分值、情绪睡眠积分值、皮肤毛发积分值、中央格停留时间以及血中NE、E、CORT、PRL和下丘脑5-HT、TRH、垂体PRL的表达均明显降低(P<0.05或P<0.01);氟西汀组大鼠体重、糖水偏嗜度、爬行格数、修饰次数、里程数以及血IL-6、TNF-α、γ-IFN、CD4/CD8T淋巴细胞数明显升高,活动行为积分值、情绪睡眠积分值、皮肤毛发积分值和中央格停留时间以及血NE、E、CORT、PRL、垂体PRL和T淋巴细胞的IRF-1 mRNA表达量明显降低(P<0.05或P<0.01);溴隐亭组大鼠血PRL、下丘脑TRH和垂体PRL的表达明显降低,血IL-6、CD3、CD4和CD4/CD8T淋巴细胞数、T淋巴细胞STAT5蛋白、PRLR蛋白和IRF-1 mRNA表达量均明显升高(P<0.05或P<0.01)。与柴胡舒肝散大剂量比,氟西汀组大鼠情绪睡眠积分值、爬行格数、里程数、外周血CD3、CD4、CD4/CD8T淋巴细胞数目、T淋巴细胞PRLR蛋白、STAT5蛋白及IRF-1 mRNA表达量明显降低,中央格停留时间、糖水偏嗜量、明显升高(P<0.05或P<0.01);柴胡疏肝散小剂量组大鼠活动状态、情绪睡眠积分值、中央格停留时间、血清PRL和下丘脑TRH均明显升高,糖水偏嗜量、爬行格数、里程数、血清IL6、外周血CD3、CD4、CD4/CD8T淋巴细胞数目和T淋巴细胞PRLR蛋白、IRF-1 mRNA表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01);溴隐亭组大鼠在活动状态、情绪睡眠积分值、下丘脑5-HT含量均明显升高,糖水偏嗜量、T淋巴细胞PRLR蛋白表达量明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:肝郁证模型大鼠存在持续性泌乳素升高、HPA轴亢进及神经内分泌免疫的异常(中枢单胺类递质出现先降低逐渐回升,免疫功能先升高后降低),其机制涉及到T细胞及其JAK-STAT信号通路的传导异常,其中过高的PRL引起的T细胞膜上的PRL受体表达降低是其重要的调控环节。另外,肝郁证免疫功能降低可能还涉及到HPA轴的亢进,其确切的调控机制仍待进一步探查。柴胡疏肝散对该模型大鼠的肝郁证候和西医(神经内分泌免疫系统)病生理指标均有良好的改善作用;氟西汀对该模型大鼠的肝郁证候有改善作用,对其中神经内分泌部分指标有改善作用,对免疫功能的改善作用不明显;溴隐亭对肝郁证候无明显作用,对高泌乳素血症及免疫功能有一定的改善作用。较之于西药,中医因证治方具有整体和多环节调节作用优势。肝郁模型大鼠存在"PRL-免疫系统-T细胞-JAK-STAT"调节异常,中药柴胡疏肝散和西药溴隐亭对模型大鼠免疫功能均有改善作用,其机制均涉及PRL中枢调节及T细胞PRL-JAK-STAT信号通路的调节。氟西汀对肝郁证免疫系统的调节可能不涉及T细胞JAK-STAT信号通路。推测PRL的升高不仅是慢性应激肝郁证神经内分泌免疫功能异常的部分生物学基础,也是柴胡疏肝散方作用于肝郁证的重要分子靶标。
刘碧原[5]2017年在《肝郁证雄性大鼠性腺轴的变化及疏肝方与补肾方干预效应的比较》文中进行了进一步梳理大量研究表明中医证候的现代内涵涉及多系统的病理生理变化。肝郁证涉及包括神经、内分泌、免疫、消化、血液在内的多系统异常。基于中医肝脏与现代生殖系统相关和临床肝郁证常涉及男性生殖系统疾病的背景,提出男性肝郁证可能涉及现代性腺功能调节异常的概念,在前期束缚肝郁证大鼠模型研究的基础上,动态观察了模型大鼠复制不同阶段的肝郁证候及性腺轴的变化;基于方证相关的原理,比较观察中医疏肝方(柴胡疏肝散)、补肾方(五子衍宗丸)及抗抑郁西药(盐酸氟西汀)对该模型大鼠肝郁证候及性腺功能损伤的防治效应;并从分子层面进一步探查相关方药对肝郁证大鼠睾丸损伤的保护作用机制。研究一肝郁证模型大鼠的性腺功能状态及其变化方法:健康雄性wistar大鼠60只,体重210±10g,随机分为正常对照组30只和模型组30只。模型组按照每天束缚桶束缚3h,共4周的方法,复制肝郁证模型;正常对照组不予处理。分别于实验第2周末、第3周末、第4周末从正常组和模型组中随机抽取10只大鼠,10%水合氯醛(0.30ml/100g体重)腹腔麻醉,经腹主动脉采血并取睾丸及下丘脑等组织。检测指标:(1)肝郁证相关的神经-内分泌指标:下丘脑5-羟色胺(5-HT)、血清去甲肾上腺素(NE)、血清皮质酮(CORT);(2)性腺功能指标:1)血清性激素:促性腺激素释放激素(GnRH)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、泌乳素(PRL)、睾酮(T)、雌二醇(E2);2)性腺器官:睾丸湿重及脏器指数、睾丸HE观察。每周观察并记录各组大鼠一般外观表征(行为状态、活跃程度、情绪反应、饮食状态等)及体重的变化。结果:(1)肝郁证模型大鼠中医证候学相关指标的变化:与正常组相比,模型组大鼠第2周、第3周、第4周的行为状态、活跃程度、情绪反应和饮食情况的评分均明显升高,体重1周末～4周末均显着降低(p<0.01);下丘脑5-HT水平2周末明显降低,3周末和4周末明显升高(p<0.01);血清NE和C0RT水平在2周末～4周末均明显升高(p<0.01或p<0.05)。(2)肝郁证模型大鼠性腺功能的变化:与正常组相比,模型组大鼠的血清GnRH在2周末和3周末均明显增高(p<0.01),4周末明显降低(p<0.01);FSH、LH在2周末～4周末均明显降低(p<0.01或p<0.05),PRL、E2在2周末～4周末均明显升高(p<0.01或p<0.05),T在3周末和4周末明显降低(p<0.01);睾丸重量在2周末～4周末均明显下降,病理损伤评分2周末～4周末明显升高(p<0.01或 p<0.05)。结论:慢性束缚应激法复制4周的肝郁证模型大鼠表现出与中医肝郁证类似的外观变化和相关实验室指标的异常,并伴有性腺轴功能的调节异常和睾丸的损伤。随着造模时间的延长,模型大鼠呈现血中GnRH、T、LH和FSH/PRL和E2则分别持续降低/升高,睾丸病理损伤逐渐加重的特点。提示下丘脑可能是肝郁证发展中性腺轴调节紊乱的主要部位。研究二疏肝方与补肾方对肝郁证雄性大鼠性腺功能的调节作用及机制方法:健康雄性wistar大鼠69只,体重210±10g,随机分为正常对照组12只,造模组57只。正常对照组不予处理,造模大鼠按照上述方法复制肝郁证模型。于造模第2周末(即造模第14天)将造模大鼠随机分为模型组12只、柴胡疏肝散大剂量组(柴大组)12只、柴胡疏肝散小剂量组(柴小组)12只、氟西汀组(西药组)9只、五子衍宗丸组(补肾组)12只。其中柴大、小剂量组分别按1.24g/kg和0.31g/kg(相当于70kg体重成人用量的2倍和0.5倍)给予柴胡疏肝散,西药组按1.8mg/kg(相当于70kg体重成人用量)给予盐酸氟西汀,补肾组按1.08g/kg(相当于70kg体重成人用量)给予五子衍宗丸。每日1次,连续灌胃两周。实验第4周末处死动物及采样,检测指标:(1)肝郁证相关指标:1)外观行为学指标(同上)和旷场试验;2)证候相关的神经-内分泌指标:下丘脑5-HT,血清NE、E、Ach、C0RT。(2)性腺轴相关指标:血清GnRH、FSH、LH、T、E、PRL;睾丸湿重及脏器指数、睾丸HE病理观察。(3)睾丸生化及分子指标:1)线粒体 SOD、MDA、CytC 及 8-OHdG;2)睾丸 PKA、ERK、STAR 及 Cypllal。结果:(1)证候学变化:1)行为学变化:与正常组相比,模型组大鼠第2周～第4周的各组行为评分均明显升高,体重明显降低(p<0.01);第2周旷场试验中的爬格数、爬行里程数及中央格停留时间均明显增加(p<0.01),第4周旷场试验中的爬格数、爬行里程数明显减少,中央格停留时间明显增加(p<0.01)。与模型组相比,在第4周末,柴大组和柴小组大鼠的各组行为评分均明显降低(p<0.01),西药组大鼠的行为状态,活跃程度及情绪反应评分明显下降(p<0.01);柴大组和西药组大鼠爬格数及爬行里程数均明显上升,中央格停留时间明显下降(p<0.05);柴大组大鼠体重明显增加(p<.0.01),柴小组、西药组和补肾组体重未见明显差异。2)神经-内分泌指标:与正常组相比,模型组大鼠下丘脑5-HT、血清NE、C0RT均明显升高(p<0.01),Ach明显降低(p<0.01)。与模型组相比,柴大组大鼠下丘脑5-HT、血清NE、C0RT均明显降低(p<0.01),Ach明显升高(p<0.01);柴小组大鼠血清Ach明显升高,NE明显降低;西药组和补肾组大鼠血清NE、E、CORT均明显降低(p<0.01)。(2)性腺轴相关指标:与正常组相比,模型组大鼠血中GnRH、LH、T均明显降低(p<0.01),PRL、E2明显升高,睾丸重量明显降低,病理损伤评分明显升高(p<0.01)。与模型组相比,柴大组大鼠血中 GnRH、LH、T 均明显升高(p<0.01 或 p<0.05),PRL、E2 明显降低(p<0.01),睾丸重量明显升高(p<0.01),病理损伤评分明显降低(p<0.01);柴小组大鼠血中PRL和E2明显降低(p<0.01);西药组大鼠血中LH明显升高(p<0.05),PRL和E2明显降低(p<0.01或p<0.05);补肾组大鼠血中GnRH明显升高,E2明显降低(p<0.01或p<0.05)。(3)睾丸生化及分子指标:1)与正常组相比,模型组大鼠睾丸线粒体MDA、CytC、8-OHdG均明显升高,SOD明显降低(p<0.01或p<0.05)。与模型组相比,柴大组大鼠睾丸线粒体MDA、CytC、8-OHdG均明显降低,SOD明显升高(p<0.01或p<0.05);柴小组大鼠睾丸线粒体MDA明显下降,SOD明显上升(p<0.01或p<0.05);西药组大鼠睾丸线粒体SOD明显增高(p<0.05)。2)与正常组相比,模型组大鼠睾丸PKA、ERK、STAR、Cypllal均明显下降(p<0.01或p<0.05)。与模型组相比,柴大组大鼠睾丸PKA、ERK、STAR、Cypllal均明显上升(p<0.01或p<0.05),柴小组大鼠睾丸PKA、STAR明显上升(p<0.01),西药组大鼠睾丸ERK、STAR明显升高(p<0.05),补肾组大鼠睾丸PKA明显升高(p<0.01)。结论:柴胡疏肝散大、小剂量及西药(氟西汀)对束缚肝郁模型大鼠的一般外观行为学均有不同程度的改善作用,其中柴胡疏肝散大剂量改善作用明显,补肾方(五子衍宗丸)的改善作用不明显。柴胡疏肝散大剂量对肝郁模型大鼠性腺轴有较好的调节作用及减轻睾丸的病理损伤,其保护作用可能与减轻线粒体氧化应激损伤和调节睾酮生成信号转导通路有关。补肾方和西药对模型大鼠性腺轴损伤的个别或部分指标有一定的改善作用。该研究结果为揭示中医"疏肝方与肝郁证相关"的科学内涵提供了一定的生物学证据,对认识肝郁证性腺生殖系统的病生理学机制、论证中医辨证论治中方证相关(因证用方)经验的合理性提供了实证依据。
闫明茹[6]2007年在《针灸关元、命门、足叁里穴对免疫失调模型大鼠IL-18、AVP及相关因子影响的实验研究》文中研究说明针灸作为传统的治疗方法行之有效,其整体调节的优势逐步被认同,虽然已经进行了大量的研究工作,但针灸机理的阐释仍不能令人满意。对针灸防治、预防疾病的作用机制进行进一步深入的研究,仍是必要的。微观研究,整体综合或许是一条思路。本实验在前期实验的基础上,通过继续观察针刺对束缚、佐剂性关节炎(AA)模型大鼠的影响,从电针刺激作为处理手段,选取关元、命门、足叁里叁穴,在深究上述叁个穴位在中医理论下共性和特性的基础上,通过检测分子生物学水平上的指标变化来研究这叁个穴位对不同应激源所致免疫失调的模型大鼠的调控机制,并结合神经内分泌免疫网络学说,来揭示针灸整体调控的部分机理。实验以AA、束缚模型作为研究对象,采用组织学、免疫组化及放射免疫等技术方法检测脑内及血液中细胞因子、神经肽类等物质,观察针灸对不同应激源所致的免疫失调模型的影响。选取雄性Wistar大鼠120只随机分为15组,每组各8只,分别为:正常组、AA模型组、束缚模型组、AA针关元组、AA针命门组、AA针足叁里组、AA灸关元组、AA灸命门组、AA灸足叁里组、束缚针关元组、束缚针命门组、束缚针足叁里组、束缚灸关元组、束缚灸命门组和束缚灸叁里组等。实验结论为,针刺的调整作用是多方面、多环节、多途径、多水平的,针刺对神经、内分泌、免疫叁大系统均具有调节作用,主要结果如下:1.针灸能使AA大鼠关节红、肿、热等症状减轻,关节肿胀率降低,镜下观察关节滑膜中炎性细胞浸润明显减轻,关节软骨结构完整。提示针灸具有减少炎症渗出,促进渗出物吸收,抑制炎症反应作用。2.针灸能使AA大鼠迟发性左足足爪肿胀率降低,且针灸关元穴效应最强,电针更为明显。提示针灸能减轻机体继发反应的程度,对机体亢进的免疫反应有一定的阻抑作用。3.针灸通过调节IL-1、TNF-α、IL-2、L-18的水平来降低机体的炎症反应程度。4.针灸对大鼠血清IL-2水平具有双重调节作用:对AA模型大鼠表现为明显上调,对束缚模型大鼠表现为上调不明显,关元则表现为下调趋势。5.针灸可通过调节大鼠ACTH的水平来减轻外界各种不良应激对机体所造成的伤害。6.针灸可整体调节大鼠大脑皮层AVP的分泌和释放,继而在中枢水平即可刺激CRF及ACTH释放,刺激肾上腺糖皮质激素分泌,发挥对整个HPA轴的功能的调控作用。7.关元穴对机体炎症反应的调节作用优于足叁里穴和命门穴,且命门穴作用最差;同时,关元穴、命门穴和足叁里穴在防治免疫功能失调疾病中具有各自规律与特点,并且对不同模型的调节作用不同,体现了腧穴特异性的特点。并且电针对机体的免疫调整作用强于艾灸。8.针灸可通过对中枢、外周等不同水平的作用,调节机体神经递质和相关免疫因子的合成和释放,继而作用于神经-内分泌-免疫网络,并通过此网络多水平、多层次、多靶点的共同作用,发挥多元化的功能,从而提高机体对外界不良应激的抵抗能力,并将外界对机体的伤害减小到最低。针灸的这种作用,由于各类内在因素的影响,体现了多元化、复杂性的一面,同时也证明了针灸在调控神经-内分泌-免疫网络中各种递质、细胞因子复杂的内在机制。
苏敏[7]2014年在《肠安Ⅱ号方对叁硝基苯磺酸（TNBS）诱导炎症后肠易激综合征（PI-IBS）大鼠肠粘膜免疫屏障的作用机制研究》文中提出[研究背景]肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是以腹痛、腹部不适伴有排便习惯改变、粪便性状异常为主要症状的功能性胃肠病,IBS发病机制复杂,与多种影响因素有关。随着感染后肠易激综合征(post-infectious irritablebowel syndrome, PI-IBS)的提出,国内外研究越来越多,目前多认为胃肠感染后肠道存在低度炎症或无炎症,处于持续的免疫激活状态,致使出现IBS症状。经过近10年临床观察文献分析得出,目前西医主要是通过调节胃肠动力,改善肠道菌群为主的对症治疗,中医认为肝郁脾虚是基本病机,肝郁脾虚证是主要证型,痛泻要方及其加减方为主要治疗手段,并且临床疗效显着。本研究采用的肠安Ⅱ号方由痛泻要方加减,并加强了其益气安肠,温阳固涩的作用,前期研究发现肠安Ⅱ号方对IBS模型大鼠免疫功能具有显着的改善作用,而PI-IBS的主要疾病特点是肠道存在低度炎症、持续的免疫激活状态,因此采用肠安Ⅱ号方干预治疗PI-IBS,并且阐明其对PI-IBS的作用机理具有重要意义。[研究目的]通过对IBS近现代中西医治疗进展的论述和对中西医治疗IBS临床研究的文献分析,讨论目前存在问题及优点,为临床、科研提供参考；对肠安Ⅱ号方进行药效学实验,明确肠安Ⅱ号方的药理作用；采用新生母子分离+叁硝基苯磺酸结肠灌注+慢性束缚刺激建立PI-IBS大鼠模型,给予肠安Ⅱ号方不同剂量进行干预,观察其疗效并研究其对PI-IBS大鼠肠粘膜免疫屏障的作用机制。[研究内容]实验一、肠安Ⅱ号方对小鼠的药效学研究目的：观察肠安Ⅱ号方的镇痛抗炎作用及其对胃肠动力和免疫功能的影响。材料与方法：采用ICR小鼠小肠推进和新斯的明亢进实验来观察肠安Ⅱ号对胃肠动力是否有影响；采用热板镇痛法和二甲苯致小鼠耳肿胀实验来观察肠安Ⅱ号方是否有镇痛抗炎作用；以迟发性变态反应(DTH)、碳粒廓清指数测定的实验来观察其是否对免疫功能有影响。结果：在小鼠小肠推进运动实验、新斯的明致小肠亢进实验中肠安Ⅱ号低、中、高剂量组推进率与正常组比较有显着差异(P<0.01),而3组间两两比较没有差异(P>0.05)；肠安Ⅱ号中、高剂量组的耳肿胀度与正常组相比有显着降低(P<0.01),低剂量组的肿胀度有所降低但无统计学意义(P=0.058>0.05)；在小鼠热板镇痛实验中,给药后60s肠安Ⅱ号中、高剂量组阈值与正常组比较,有显着性差异(P<0.05),给药后120s肠安Ⅱ号高剂量组阈值与正常组比较有显着性差异(P<0.05)。迟发型变态反应实验中,肠安Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠耳肿胀度比模型对照组显着降低(P<0.001)。肠安Ⅱ号低、中、高剂量组与空白对照组相比,有明显增强正常小鼠碳粒廓清指数的趋势,但未达到统计学意义(P<0.05)。实验二、肠安Ⅱ号方对TNBS诱导炎症后肠易激综合征(PI-IBS)大鼠肠粘膜屏障的作用机制研究目的：本实验研究从机械屏障、免疫屏障、粘膜通透性叁方面观察肠安Ⅱ号方对PI-IBS大鼠肠粘膜屏障的作用。主要从细胞免疫和体液免疫的调控来研究肠安Ⅱ号方对免疫屏障的作用机制,以CD4/CD8比值,L-4/IL-1β比值,SIgA浆细胞活化程度,至分泌到肠腔的SIgA含量水平为观察指标,明确肠安Ⅱ号方对免疫屏障的作用机制。材料与方法：采用新生母子分离+叁硝基苯磺酸结肠灌注+慢性束缚刺激建立PI-IBS大鼠模型,实验动物分为模型组、肠安Ⅱ号高剂量组、中剂量组、低剂量组、痛泻要方组、白术内酯Ⅰ组、得舒特组、正常对照组。每日上午09：00,正常对照组及模型组分别给予生理盐水进行灌胃,治疗组分别给予白术内酯Ⅰ、痛泻要方和肠安Ⅱ号煎剂,按照大鼠体重0.8ml/100g进行灌胃给药,连续14d。结果：(1)对各组实验大鼠基本情况和肠粘膜组织形态观察可见：①造模后大鼠活动度、皮毛光泽度明显降低,用药后皮毛洁白光亮,活动度增加。②对大鼠进食量的影响,用药前(造模后),模型组及各用药组进食量比正常组显着减少(P<0.001,p<0.01)；用药后模型组进食量比正常组显着减少(p<0.01),各用药组进食量与正常组进食量相当(P>0.05)。③对大鼠体重的影响,用药前(造模后),模型组及各用药组大鼠体重比正常组较轻(P<0.01,p<0.05)；用药后模型组及各用药组体重比正常组轻(p>0.05),用药后模型组大鼠体重增长量比正常组少(P<0.01),各用药组大鼠体重增长量与正常组增长量相当(P>0.05)。④对各组实验大鼠大便含水量的影响,用药前(造模后)模型组及各用药组大便含水量比正常组高,但尚未达到统计学差异(P>0.05)；用药后,肠安Ⅱ号中、低剂量、白术内酯Ⅰ、痛泻要方大便含水量比模型组明显降低(P<0.01,p<0.05)。⑤结肠组织HE染色观察情况,正常组、用药组及模型组均未发现3分及3分以上病变,模型组在不同视野中有2分病变,肠安Ⅱ低剂量、痛泻要方、白术内酯Ⅰ、得舒特组视野观察中,有评分表现为轻度炎症1分,通过对HE评分进行统计分析可以看出,模型组评分比正常组显着升高(P<0.001),肠安Ⅱ中剂量、低剂量组与正常组相比无明显差异(P>0.05),其余各用药组HE评分比模型组降低,但未达到统计学差异(P>0.05),各用药组治疗后HE评分仍比正常组高(P<0.01)。⑥活化肥大细胞(MC)计数,肠安Ⅱ号中剂量组与正常组无明显差异(P>0.05),模型组及其余各用药组MC计数比正常组显着增多(P<0.001,P<0.01)。⑦嗜铬细胞(EC)计数,肠安Ⅱ号中剂量组与正常组无明显差异(P>0.05),模型组及其余各用药组比正常组显着增多(P<0.001)。(2)对PI-IBS大鼠疾病特征和证候特征的疗效情况：①对模型大鼠内脏敏感性的影响,用药前模型组及各用药组AWR注水量比正常组显着降低(P<0.001),用药后模型组AWR注水量比正常组显着降低(P<0.001),模型组用药后比用药前降低(P<0.05),各用药组在治疗后AWR注水量比治疗前明显提高(P<0.001,P<0.01)。②对血清中髓过氧化物酶(MPO)活力水平的影响,用药前(模成功后)模型组血清中MPO活力较高,与用药后模型组MPO活力水平无差异(p>0.05),用药后模型组血清中MPO活力水平比各用药组和正常组高,但没有达到统计学意义(p>0.05)。③糖水偏好实验,模型组糖水偏好值比正常组显着降低(P<0.001),肠安Ⅱ号中、高剂量组、白术内酯Ⅰ、得舒特组糖水偏好值明显升高与正常组无差异(p>0.05)。④旷场试验观察对大鼠活动度的影响,穿格数用药前(造模完成后)模型组与各用药组比正常组显着减少(P<0.01,P<0.05),用药后模型组穿格数比正常显着减少(P<0.01),站立数用药前各组站立数比正常组显着减少,用药后肠安Ⅱ号中剂量组与正常组无差异(P>0.05),其余各用药组站立数增加,但与正常组比较仍存在显着差异(P<0.001-0.05),修饰数用药前肠安Ⅱ号中剂量组、痛泻要方组、得舒特组修饰数比正常组显着减少(P<0.05),其余各组修饰数比正常组减少,但未达到统计学意义(P>0.05),用药后肠安Ⅱ号中剂量、高剂量组修饰数增多。⑤对大鼠D-木糖代谢的影响,用药前各组大鼠的尿D-木糖含量比正常组显着降低(P<0.001),模型组大鼠在用药前、用药后无变化,用药后各用药组大鼠尿D-木糖含量与正常组相比无明显差异(P>0.05)。(3)对PI-IBS大鼠肠粘膜屏障的作用机制：①从机械屏障角度,在1.2万倍透射电镜下观察各组大鼠结肠上皮粘膜观察紧密连接状态,可见模型组结肠上皮细胞膜局部缺如,胞质肿胀,线粒体肿胀空泡化,紧密连接打开；肠安Ⅱ号高剂量、中剂量组结肠上皮细胞紧密连接完整,连接紧密；肠安Ⅱ号低剂量组结肠上皮细胞有紧密连接,连接缝隙略增宽；痛泻要方组结肠上皮细胞有紧密连接,紧密连接缝隙正常；白术内酯Ⅰ组肠上皮紧密连接可见连接缝隙较宽；得舒特组肠上皮可见紧密连接复合体完整,连接缝隙较宽松；正常组结肠上皮细胞完整,细胞间细胞膜完整,紧密连接复合体(紧密连接、缝隙连接及桥粒)完整,连接紧密。②对粘膜通透性的影响,模型组血清中血浆内毒素(LPS)水平比正常组显着升高(P<0.001)；用药后各用药组LPS水平比模型组显着降低(P<0.05,P<0.01)比正常组略高(P<0.05,P<0.01)。③对肠粘膜免疫屏障的影响,用药前模型组与各用药组CD4计数比正常组低(P<0.001)；各用药组CD4计数组间比较,肠安Ⅱ号高剂量=中剂量>低剂量=痛泻要方=白术内酯Ⅰ=得舒特,各用药组和正常组CD8计数比模型组显着降低(P<0.001)；肠安Ⅱ号高、中、低剂量与正常组无差异(P>0.05),各用药组及正常组CD4/CD8比值均比模型组显着升高(P<0.001)；痛泻要方组CD4/CD8比值与正常组比较无显着性差异(P>0.05),肠安Ⅱ号各剂量组、白术内酯Ⅰ及得舒特比正常组略低,并有统计学差异(P<0.05)。正常组及各用药组IL-4水平比模型组显着升高(P<0.001),用药干预后可使IL-4水平升高,肠安Ⅱ号高、中、低剂量比其他用药组水平高,但未达到统计学差异(P>0.05),正常组及各用药组IL-1β水平比模型组显著降低(P<0.001,P<0.05),用药干预后可使IL-1β水平降低,各用药组中IL-1β水平肠安Ⅱ号高、中、低剂量比其他用药组低,但未达到统计学差异(P>0.05)。用药组及正常组中活化的SIgA浆细胞数目比模型组显着增多(P<0.001)达2倍余；各用药组中活化的SIgA浆细胞计数比正常组略低(P<0.001)；各用药组组间比较可见,肠安Ⅱ号中、低剂量、痛泻要方、白术内酯Ⅰ组中活化的SIgA浆细胞计数比肠安Ⅱ号高剂量组、得舒特组略高(P<0.01)。肠安Ⅱ号中剂量、高剂量组肠管内壁粘液中SIgA水平比模型组显着升高(P<0.05),其他各用药组SIgA水平比模型组升高,但未达到统计学差异(P>0.05)。正常组、肠安Ⅱ号高、中、低剂量组PGE2水平比模型组显着升高(P<0.001,P<0.05),各组PGE2水平组间比较,肠安Ⅱ号中剂量>正常组>肠安Ⅱ号高剂量=肠安Ⅱ号低剂量=痛泻要方>白术内酯Ⅰ=得舒特组(P<0.05)。[研究结论]肠安Ⅱ号方具有药效学作用,具体为其高、中、低剂量组有调节胃肠动力和对迟发型变态反应显着抑制的作用,中、高剂量有抗炎和镇痛作用,并能延长镇痛的时间,高、中、低剂量有明显增强正常小鼠碳粒廓清指数的趋势。通过新生母子分离+叁硝基苯磺酸结肠灌注+慢性束缚刺激后,可以建立符合PI-IBS疾病特点和脾虚肝郁型证候特点的动物模型,主要体现在造成模型大鼠的内脏高敏感、抑郁状态、大便含水量增加、无炎症或轻度炎症的结肠组织病理形态等疾病特点,并有进食量减少、D-木糖代谢降低、活动度减少、抑郁等肝郁脾虚型的证候特点。给予肠安Ⅱ号方干预治疗后,出现疾病、证候特征的明显改善,并且对模型大鼠结肠粘膜上皮屏障具有良好的作用,可使得肠上皮细胞间紧密连接嵌合紧密,降低结肠粘膜的通透性,阻止外界大分子(细菌、病毒等)的入侵,并且通过提高保护因子,降低炎症损坏因子水平,激活免疫SIgA浆细胞,促其活化分泌SIgA到肠腔,从而激活细胞免疫到体液免疫的自我免疫保护机制,最终降低肠道炎症,降低内脏高敏感和大便含水量等,起到肠粘膜屏障的保护作用,从而达到治疗PI-IBS的目的。
毕珺辉[8]2009年在《水浸应激型胃溃疡寒热证模型的建立与相关性方剂对其影响的研究》文中指出目的：将水浸应激型胃溃疡疾病模型与中医寒、热证相结合，探讨应激型溃疡寒、热证形成机制，揭示应激型溃疡寒、热证候实质；观察寒性方剂大黄黄连泻心汤、热性方剂理中丸对应激型溃疡寒、热证模型的作用机理及方证相应规律。方法：采用寒因素(冰水、0．3mol／L氢氧化钠)及热因素(8％辣椒粉、60％乙醇)建立胃寒、胃热证模型，结合国内外较为公认的束缚水浸应激法创建应激型溃疡寒、热证结合模型，寒性方剂大黄黄连泻心汤、热性方剂理中丸灌胃治疗。1、束缚水浸应激7h后处死各模型及给药组大鼠，测定各模型及给药组大鼠溃疡指数及血清中肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素-8(IL-8)、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(INOS)含量；2、胃组织匀浆检测表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-a)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量；3、脑组织匀浆检测5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)含量。结果：1、在溃疡指数方面，寒水组、热水组与单水组比，明显升高(P＜0．01)；寒水理、热水大分别与寒水、热水组比，明显降低(P＜0．01)。2、在SOD、EGF及TGF-a方面，寒水、热水与空白组比较，均有不同程度的下降(P＜0．01)，热水组TGF-a含量低于寒水组(P＜0．01)；寒水理与寒水、热水大与热水比较，含量均明显升高(P＜0．01或P＜0．05)。3、在MDA、NO、INOS、IL-8、TNF-a及NE方面，热水与空白、寒水组比较，含量升高(P＜0．01或P＜0．05)；大黄黄连泻心汤治疗后，热水大与热水比较，含量降低(P＜0．05或P＜0．01)。4、在ET、5-HT方面，寒水组与空白、热水组比较，升高明显(P＜0．01)；理中丸治疗后，寒水理与寒水比较，含量明显降低(P＜0．01)。结论：1、水浸应激型溃疡寒、热证的发病机制既与整体因素如神经-内分泌失调有关，又与局部因素如胃黏膜保护功能减弱和损伤因素增强有关。2、水浸应激型溃疡热证与超氧化物歧化酶(SOD)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-a)含量降低有关；与丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(INOS)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素-8(IL-8)、去甲肾上腺素(NE)含量升高有关。3、水浸应激型溃疡寒证与超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-a)含量降低有关；与内皮素(ET)、5-羟色胺(5-HT)含量升高有关。4、寒性方剂大黄黄连泻心汤预防水浸应激型溃疡热证的作用机制可能与提高SOD活性、降低MDA含量、减少NO、INO S的炎性反应、刺激胃黏膜EGF、TGF-a释放、抑制炎性因子IL-8、TNF-a产生、降低交感-肾上腺髓质机能活动而减少NE含量有关。5、热性方剂理中丸预防水浸应激型溃疡寒证的作用机制可能与提高SOD活性、提高NO含量、降低ET含量而改善胃黏膜血流量、刺激胃黏膜EGF、TGF-a释放、提高交感-肾上腺髓质机能活动而降低5-HT含量有关。
钱梦[9]2018年在《肝郁证雌性大鼠乳腺的癌前基因表达及柴胡疏肝散的干预作用》文中认为目的:现代医学认为乳腺增生与癌变之间存在一定的关联,肝郁证是乳腺增生性疾病重要的中医证型之一。临床和实验显示,疏肝解郁方-柴胡疏肝散防治乳腺增生性疾病有一定的疗效。本文提出肝郁、乳腺增生与乳腺癌变之间可能存在某种的关联的推测,拟在束缚肝郁证雌鼠模型复制的基础上,观察该模型大鼠性腺轴以及乳腺的变化,在分子层面上探查了其乳腺增生及其相关癌前基因的表达;进一步基于方证相关原理,观察了因证治方柴胡疏肝散对该模型雌鼠肝郁证候和性腺轴的影响及对乳腺增生的防治作用机制。论文包括文献综述和实验研究两个部分。文献综述主要围绕中医对乳腺增生症的防治和乳腺增生与乳腺癌之间的关系进行了相关文献的搜集与整理。实验研究探查了束缚肝郁模型雌鼠中医证候、乳腺增生及其癌前病变的分子机制及柴胡疏肝散的相关作用。方法:大鼠随机分为正常对照组、肝郁模型组(以下简称模型组)、柴胡疏肝散大剂量组(柴大组)、柴胡疏肝散小剂量组(柴小组)。除正常组外,其余叁组按慢性束缚应激法连续造模4周。造模第2周末,柴大组和柴小组分别按相当于药材1.24g/kg、0.31g/kg的剂量(相当于成人用量的2倍和0.5倍)给予柴胡疏肝散灌胃,每日1次,连续2周;正常组和模型组给予等量的蒸馏水。于造模第27天制备各组大鼠阴道涂片观察动情周期情况,选择动情前期/动情间期(实验第28-30d)进行麻醉处杀,经腹主动脉取血,分离血清和血浆;低温下取下丘脑和乳腺组织,待测。观测指标:(1)肝郁证相关外观行为指标:1)造模期间观察并记录各组大鼠每周外观行为和体重的变化,于2周末和4周末做糖水偏嗜试验,4周末做旷场试验;2)肝郁证相关实验室指标:下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、血清促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮/肾上腺酮(CORT)、血浆5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE);(2)性激素及其调节轴指标:下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)、血清促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)、孕酮(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2);(3)乳腺器官:乳腺病理组织学观察;(4)癌前基因指标:血清叁叶因子1(TFF1)、叁叶因子3(TFF3),乳腺基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)、存活素(Survivin);(5)PRL介导的信号通路相关指标:泌乳素受体(PRLR)、AKT、BAD、Bcl-2、MDM2、P53。数据处理:所得数据均以x±S表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验后,多组间比较采用Student Newman Keuls Test检验。全部数据采用SPSS 20.0 for windows软件统计处理。所有图表均用GraphPad Prism 7软件制作。结果:(1)肝郁证相关指标:1)一般外观行为学的变化:与正常组相比,模型组大鼠第2周～第4周各组行为评分明显升高(p<0.01),体重明显降低(p<0.01);第2周糖水偏嗜度明显升高(p<0.01),第4周糖水偏嗜度明显降低(p<0.01);第4周旷场试验中央区停留时间、爬格数、爬格里程数均明显降低(p<0.01)。与模型组比较,柴大组大鼠第3～4周各组行为评分明显降低(p<0.01),第4周体重明显增加(p<0.01);柴大组大鼠第4周糖水偏嗜度明显升高(p<0.01),旷场试验中央区停留时间、爬格数、爬格里程数明显升高(p<0.01);柴小组大鼠上述指标未见明显变化。2)实验室指标的变化:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑CRH、血中ACTH、CORT、E表达明显升高(p<0.01 或p<0.05)、血中 5-HT、NE、DA 含量明显降低(p<0.01 或p<0.05)。与模型组比较,柴大组大鼠下丘脑CRH、血中ACTH和CORT表达明显降低(p<0.01或p<0.05)、血中5-HT、NE含量明显升高(p<0.01或p<0.05),柴小组大鼠血中CORT表达降低(p<0.05),NE、DA表达明显升高(p<0.01);与柴大组比较,柴小组大鼠下丘脑CRH、血中DA表达明显升高(p<0.01或p<0.05)、血中5-HT明显降低(p<0.01)。(2)性激素及其调节激素的变化:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑GnRH、血清FSH、LH、PRL、T、E2、P表达明显升高(p<0.01)。与模型组比较,柴大组大鼠下丘脑GnRH,血清LH、PRL、T、P表达明显降低(p<0.01或p<0.05),柴小组血清LH、PRL、T、E2表达明显降低(p<0.01或p<0.05)。与柴大组比较,柴小组下丘脑GnRH表达明显升高(p<0.01);E2/P的比值在四组间均无明显差异(p>0.05)。(3)乳腺器官的变化:镜下观察到正常组大鼠乳腺腺泡形状规则,腺导管管腔无扩张,腺泡和导管内无分泌物。与正常组比较,模型组大鼠乳腺腺泡形状不规则,腺导管管腔扩张,腺泡和导管内分泌物增加。与模型组比较,柴大组大鼠乳腺腺泡形状见规则,但仍伴有不规则腺泡,腺泡和导管内分泌物见少,柴小组大鼠乳腺腺泡见规则,以不规则腺泡居多。(4)乳腺癌前基因的变化:与正常组比较,模型组大鼠乳腺Survivin和TIMP-2表达明显升高(p<0.01)、血清TFF1、TFF3表达明显降低(p<0.05)。与模型组比较,柴大组大鼠乳腺Survivin和TIMP-2表达均明显降低(p<0.01),柴小组TIMP-2表达明显降低(p<0.01)。与柴大组比较,柴小组大鼠乳腺Survivin表达明显升高(p<0.01)。(5)PRL介导的信号通路相关指标的变化:与正常组比较,模型组大鼠乳腺PRLR、AKT、BAD、Bcl-2表达明显升高(p<0.01或p<0.05),MDM2和P53未见明显变化。与模型组比较,柴大组和柴小组大鼠乳腺PRLR、AKT、BAD表达明显降低(p<0.01),柴小组Bcl-2表达降低(p<0.05)。与柴大组比较,柴小组Bcl-2表达降低(p<0.05)。结论:慢性束缚法复制的肝郁证模型雌性大鼠呈现中医证候相关的外观行为和实验室指标的改变,并伴有性腺轴功能的亢进、乳腺病理增生;乳腺组织伴有相关癌前基因表达及其PRL相关信号通路的异常,提示肝郁证乳腺增生可能存在癌前病变的分子机制。柴胡疏肝散不仅对肝郁证雌性大鼠的中医证候和实验室指标具有较好的改善作用,而且对模型大鼠的性腺轴异常和乳腺增生也有一定的防治作用,其在改善模型大鼠乳腺增生和降低血清PRL的同时,调节模型大鼠乳腺促癌/抑癌基因的表达,涉及对PRL相关信号通路的调节。研究结果为中医“肝郁证—血清PRL↑—乳腺增生—相关癌基因异常表达—柴胡疏肝散调节作用”的推测提供了 一定的生物学证据。该研究为认识中医“肝郁”与女性乳腺增生性疾病关联和中医辨证论治“未病防变”的科学内涵提供了现代病生理及分子生物学基础,为柴胡疏肝散防治乳腺癌的效用机制提供了一定的实验依据。
参考文献：
[1]. 基于数据挖掘的肝郁脾虚证研究[D]. 薛飞飞. 北京中医药大学. 2008
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