人乳头瘤病毒52型病毒样颗粒研究

论文摘要

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）是一种嗜上皮性病毒,主要引起尖锐湿疣和宫颈癌。其中HPV52是引起尖锐湿疣的主要型别,HPV52预防性疫苗的研制具有广阔的前景、一定的社会和经济效益。研究表明,HPV类病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）可以通过HPV L1蛋白在体外自组装形成,保留了天然构象,且具有免疫原性,是理想的HPV预防性疫苗形式,目前所上市的HPV预防性疫苗均为这种形式。本研究利用大肠杆菌可溶性表达HPV52 L1蛋白,体外解组装,重组装成VLPs,具有良好免疫原性。首先从GenBank中获得HPV52 L1全基因序列,根据大肠杆菌偏好性进行密码子优化,合成全基因序列,构建表达载体pET-30a-HPV52 L1和pCold-HPV52 L1,双酶切鉴定成功后转入四种感受态细胞ER2566、Tuner、BL21（DE3）、BL21 StarTM（DE3）,经SDS-PAGE鉴定筛选最佳表达菌株为BL21 StarTM（DE3）,最佳表达条件,温度为16℃,20℃,25℃,IPTG浓度为0.025 mmol/L,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,表达时间为16 h,经SDS-PAGE鉴定结果最终确定表达条件为25℃,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为16 h。通过POROS 50HS阳离子交换层析柱纯化HPV52 L1重组蛋白,以含1.25 mol/L NaCl洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,获得了高纯度的L1重组蛋白。通过用odyssey近红外激光成像系统扫描并测得,洗脱液中获得的重组蛋白纯度高达90%以上。通过体外解组装,重组装获得均一、稳定VLPs。VLPs免疫68周龄雌性BALB/c小鼠,通过动物实验表明,该VLPs疫苗具有良好免疫原性,能诱导产生高滴度的HPV52中和抗体。本研究利用大肠杆菌可溶性表达了高纯度HPV52 L1蛋白,获得了廉价、有效的HPV52 L1 VLPs,本研究建立了实验室水平的VLPs制备,为HPV52预防性疫苗研究奠定了基础。

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Abstract

第1章绪论

1.1 HPV概述

1.1.1 HPV简介

1.1.2 HPV分类与型别

1.1.3 HPV感染机制

1.1.4 HPV相关疾病

1.2 VLPs简介

1.3 HPV疫苗研究进展

1.3.1 HPV治疗性疫苗

1.3.2 HPV预防性疫苗

1.4 重组HPV L1表达系统

1.4.1 真核表达系统

1.4.2 原核表达系统

1.5 本实验研究意义

第2章材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 质粒、载体、菌株及细胞株

2.1.2 抗体及培养基

2.1.3 实验动物

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.2 主要溶液及配制方法

2.3 实验方法

2.3.1 重组表达质粒构建及鉴定

2.3.2 目的蛋白的表达

2.3.3 目的蛋白阳离子交换层析

2.3.4 SDS-PAGE检测方法

2.3.5 Western-blot检测方法

2.3.6 VLPs的解组装和重组装

2.3.7 VLPs形态鉴定

2.3.8 蛋白浓度的测定

2.3.9 动物免疫实验

2.3.10 假病毒的制备及滴度的确定

2.3.11 体外中和实验

第3章实验结果

3.1 重组质粒pET-30a-HPV52 L1和pCold-HPV52 L1的构建及鉴定

3.2 重组质粒pET-30a-HPV52 L1表达条件优化

3.2.1 不同表达载体对目的蛋白表达影响

3.2.2 不同表达菌株对目的蛋白表达影响

3.2.3 不同表达温度对目的蛋白表达影响

3.2.4 不同诱导剂浓度对蛋白表达的影响

3.3 重组L1蛋白SDS-PAGE和Western-blot鉴定

3.4 组装条件优化的动态光散射

3.4.1 类病毒样颗粒体外解组装

3.4.2 盐浓度对组装的影响

3.4.3 pH值对组装的影响

3.4.4 Tween-80对组装的影响

3.5 HPV52 L1VLPs透射电镜检测

3.6 免疫活性检测

第4章讨论

第5章结论

致谢

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭晶

导师: 殷玉和

关键词: 可溶性表达,蛋白,类病毒样颗粒

来源: 长春工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 长春工业大学

分类号: R373

DOI: 10.27805/d.cnki.gccgy.2019.000181

总页数: 57

文件大小: 2036K

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