于飞[1]2003年在《荧光定量PCR在缺失型DMD携带者检测中的应用》文中研究指明目的：探索应用荧光定量PCR的方法检测缺失型DMD携带者。方法：（1）应用定量PCR的原理，采用内参照共同扩增PCR方法及剂量系数分析法，在定量PCR产物的检测中应用荧光染料（SYBR GREEN I ），从而建立“荧光定量PCR”方法。（2）整个实验的基本步骤为：应用9对引物进行PCR筛查33例DMD家系中先证者有否外显子缺失，然后应用荧光定量PCR对缺失型DMD先证者的21例女性亲属相应的外显子区域进行扩增，并同时扩增正常对照组DNA标本，扩增产物应用SYBR GREENⅠ标记，再根据剂量系数分析的原理，在凝胶成像分析仪上对扩增产物进行分析，得出剂量系数值。（3）应用统计学原理对正常对照组剂量系数值进行分析，得出剂量系数的正常参考值范围，并以此作为判断标准，对缺失型先证者的女性亲属进行判断。（４）实验结果与系谱分析、CK值作比较。结果：携带者、正常女性剂量系数±S分别为0.5208±0.0524、 0.9882±0.0688。21例女性亲属中15例被证实为携带者,6例被排除为携带者。结论：（1）荧光定量PCR对缺失型DMD携带者检测较应用系谱分析、CK值准确。（2）对于检测缺失型DMD携带者，荧光定量PCR是一种灵敏、安全、可行的方法。
牛国辉[2]2005年在《PCR技术在缺失型DMD患者及携带者诊断中的应用研究》文中认为目的 杜氏型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是儿童最常见的致死性神经肌肉系统疾病,为X连锁隐性遗传,发病率约为活产男婴的1/3500,进行性肌萎缩和肌无力伴小腿腓肠肌假性肥大是其典型的临床特征,平均2～6岁发病,通常7～10岁即无法行走,多于20岁左右因心肺合并症死亡,严重影响了青少年男性的健康成长,也给患者家庭及社会带来沉重的精神和经济负担。但本病目前尚无有效的治疗方法,DMD患者中1/3是新生突变,2/3由遗传而来,因此携带者的检测对遗传咨询具有十分重要的意义。 Dystrophin基因定位于Xp21,由79个外显子和78个内含子构成,它具有突变频率高且突变形式多样之特点,约1/3突变为新生突变,突变方式中基因缺失所占比例最高,占55%～65%,并且存在两个缺失热区,利用此特点,Chamberlain等设计的9对引物可检测出80%的缺失型患者,Beggs等增设了另9对引物使缺失型患者的检出率达到98%。 对缺失型携带者的检测目前国外多采用荧光定量PCR方法,检出率可达98%,然而费用昂贵,国内尚未见用此种方法检测的报道,应用定量PCR方法只有少量报道,可靠性需要进一步验证。 本文首先利用多重PCR方法检测缺失型DMD患者,然后应用定量PCR方法对缺失型患者的母亲进行携带者检测,旨在建立一种简便、可靠、临床实用性较强的缺失型DMD患者及携带者的基因检测方法,为DMD产前诊断的开展奠定基础。
林齐防[3]2011年在《基于MLPA技术的假肥大型肌营养不良症患者及携带者研究》文中认为目的:1、探讨MLPA技术在假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)患者基因诊断中的应用价值,完善其基因诊断体系。2、深入分析DMD/BMD患者基因型与临床表型之间的关系,为判断疾病预后及基因治疗提供参考。3、探讨MLPA定量技术在DMD/BMD携带者检测中的优势,为遗传咨询提供可靠的依据。方法:1、应用MLPA技术对355例DMD/BMD患者进行Dystrophin基因检测,对于单一外显子缺失或峰面积比值偏低的外显子采用PCR及测序进行验证。2、用SPSS13.0统计软件包对患者Dystrophin基因阅读框是否移码与临床表型之间的相关性及基因突变大小范围、突变类型与临床表型之间的相关性进行统计分析。3、应用MLPA技术对46名缺失型患者的母亲及8名重复型患者的母亲进行携带者检测,并比较两组患者母亲携带者频率。结果:1、355例患者的Dystrophin基因经MLPA技术检测,发现其中187例为1个或多个外显子缺失,34例为外显子重复突变,5例为微小突变,129例患者未见缺失及重复。2、患者的基因阅读框是否移码与临床表型具有相关性,91.55%的DMD患者及86.27%的BMD患者符合“阅读框规则”;而患者Dystrophin基因突变大小范围、突变类型与临床表型之间的关系无统计学意义。3、46名缺失型患者的母亲经MLPA检测发现28名母亲为缺失型携带者,8名重复型患者的母亲中,6名为重复型携带者,两组患者母亲携带者频率经卡方检验证明无统计学差异(χ2=0.135,P=0.713)。结论:1、MLPA技术可检测出患者Dystrophin基因全长外显子的缺失或重复,提高了基因检测的效率、敏感性和稳定性,单外显子缺失或峰面积比值偏低的外显子,须结合PCR及测序,可以使结果更为精准。2、绝大部分DMD/BMD患者基因型与表型的关系遵循“阅读框规则”,为基因治疗提供了理论依据;Dystrophin基因突变大小范围、突变类型与临床表型无关。3、应用MLPA技术可以对Dystrophin基因的拷贝数进行准确定量,适于携带者判定,为遗传咨询提供了可靠的依据。
文曙[4]2003年在《荧光PCR定量技术在遗传病诊断中的应用》文中进行了进一步梳理荧光PCR定量技术(Quantitative PCR)是一种新兴的分子生物学技术。这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通过测序仪的自动识别即可对待测DNA进行定量分析。在遗传病，特别是一些以大片段缺失为主要突变类型的遗传病中，荧光PCR定量技术发挥了很重要的作用。在本研究中，我们对荧光PCR定量技术在以下两种遗传疾病中的应用进行了研究和探讨： (一)诊断不同基因型α地中海贫血患者 a．比较不同PCR循环次数时的结果，找出使结果易判断，所需时间短的最佳循环次数。b．检测一定样本量的正常人、α~0型患者、HbH贫血患者和Bart水肿胎DNA模板，比较定量结果。 (二)诊断儿童型脊肌萎缩症携带者 a．比较正常人，SMNt 7号、8号外显子缺失患者和SMNt 7号、8号外显子缺失携带者PCR扩增结果。b．比较ABI Prism 377型测序仪和ABI Prism 3100型测序仪进行定量分析时的差异。 通过以上实验，我们得出如下结果： 1．荧光PCR进行22个PCR循环比较合适，因为此时所用时间较短，且能够获得足够的PCR产物用于定量分析 2．荧光PCR定量技术用于α地中海贫血的诊断中，可以迅速有效地区分正常人、α~0型患者、HbH贫血患者和Bart水肿胎硕士毕业论文 中文摘要 3．荧光PCR定量技术用于儿童型脊肌萎缩症，可以迅速有效地区分正常人，S们t 7、8号外显子缺失携带者和 SMNt 7、8号外显子缺失患者 4．分析荧光KR产物时，ABI Prism 3100型叙序仪比ABI Pns。377型测序仪有更高的敏感性
钟昌高[5]2003年在《单基因遗传病的基因诊断及其应用研究》文中研究表明单基因遗传病种类多,发病率高,不仅对患者的健康造成了严重危害,而且也给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。应用遗传病的基因诊断技术,可对不同发育时期的个体进行遗传病的基因诊断,既可诊断出生后的遗传病患者和症状前患者,又可诊断出生前的胎儿(产前诊断),甚至对着床前胚胎也可作出诊断(胚胎植入前遗传学诊断)。因此能对患者和症状前患者及时采取治疗措施和婚姻生育指导。而根据高危妊娠的产前基因诊断结果,选择性地终止异常胚胎妊娠,可防止遗传病患儿的出生。而通过胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis,PGD),在妇女怀孕前筛选正常胚胎移植,诞生健康的婴儿,可使妇女避免因反复选择性流产所引起的身心痛苦。对有生育遗传病患儿风险的夫妇而言,他们又多了一种可供选择的预防手段。为了全方位地防止单基因遗传病患儿的出生,本研究旨在丰富和完善我所现有的一般基因诊断及产前基因诊断技术,并以我室成熟的辅助生殖技术为依托,建立以软骨发育不全和β-地中海贫血为代表的单细胞PCR诊断单基因遗传病的技术平台,在此基础上,进一步将该技术推向临床,开展单基因病的PGD,并为众多单基因遗传病PGD的开展打下基础。不断丰富遗传病的预防手段,不仅从出生后诊断遗传病患者和症状前患者,而且从产前水平,甚至从植入前水平阻断遗传病的传递,减少遗传病患儿的出生。1.联合运用St14(DXS52)位点VNTR和FⅧ基因内的(CA)n重复多态性对甲型血友病进行基因诊断及产前基因诊断由于甲型血友病基因结构庞大,基因缺陷复杂多变,迄今已发现756种基因突变,且散布于基因内,缺乏突变热点,给直接基因诊断带来了一定的困难。因此,建立基于甲型血友病基因内外的(CA)n重复和VNTR多态性的连锁分析方法将成为该病的简捷、有效的基因诊断手段。我们采用上述2个串联重复多态位点进行连锁分析完成了对HA家系的间接基因诊断。分析表明单用上述2个多态位点中的1个对9个HA家系进行连锁分析,可诊断率均为66.7%,联合2个多态位点,则可诊断率提高到88.9%,完成了4个家系的产前基因诊断,并利用(CA)n多态分析监测到了St14位点分析时发生的重组事件,纠正了单用St14位点的VNTR多态
钟敏[6]2009年在《DMD基因缺失突变及连接片段应用于基因诊断的研究》文中认为DMD基因突变是假肥大型肌营养不良症的分子病理基础,其中大片段缺失约占所有突变类型的65%。依据阅读框学说,通常DMD基因移码突变导致Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD),而整码突变导致Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BMD)。DMD基因缺失的机制甚为复杂,但在DMD基因发生断裂缺失后大都通过非同源末端连接进行修复。DMD基因缺失连接片段即为DMD基因断端重接形成的一段变异的DNA序列。对连接片段进行克隆和序列特点分析,可以为研究DMD基因缺失重组机制提供帮助;同时采用PCR技术扩增这段变异的DNA序列可以考虑用于缺失型DMD/BMD携带者检测和产前诊断。我们进行的研究工作分为叁个部分:一、DMD基因缺失和5例中国人连接片段序列分析;二、利用连接片段进行缺失型DMD/BMD携带者检测;叁、连接片段在缺失型DMD/BMD产前诊断的应用和评价。一、DMD基因缺失和5例中国人连接片段序列分析1.研究目的通过阅读框规则分析所选缺失型DMD/BMD患者基因型与表型的关系;通过进行DMD基因缺失连接片段测序,分析中国人连接片段序列的一些特点并探讨DMD基因缺失和修复的机制。2.方法研究对象:6例经证实的缺失型DMD/BMD患者。其中病例1、病例2、病例3、病例4为DMD,病例5、病例6为BMD,来自同一家系,故实际互相无血缘关系的研究对象为5例。抽提制备以上患者外周血基因组DNA。DMD基因缺失突变的阅读框检测:通过外显子PCR检测确定病例1为DMD基因第46～50外显子缺失,病例2为第51～55外显子缺失,病例3为第31～43外显子缺失,病例4为第45～54外显子缺失,相同家系的病例5、病例6为第3～5外显子缺失。采用在线程序对以上6例研究对象进行外显子缺失的阅读框检测,判断其缺失突变所致可读框改变类型。连接片段的克隆和测序:在研究对象DMD基因缺失断裂点所在的相应内含子上每间隔一定距离(一般为3 kb)设计1对引物,通过PCR步移的方法定位相应内含子上的断裂点位点。对5例研究对象内含子上断裂点位点成功定位后,分别在靠近其上下游断裂点处各设计1对配对引物,以直接对各例连接片段进行长片段PCR扩增,将扩增成功的PCR产物纯化后测序。连接片段的序列特点分析:对所测5例中国人连接片段5'端和3'端断裂点两侧的序列进行重复序列、基质附着区(matrix attachment regions,MARs)、回文序列、TTTAAA序列以及基因缺失后修复方式的分析。3.结果6例病例基因型和表型的关系:经检测病例1、病例2、病例3、病例4的缺失突变均属框外缺失(out-of-frame deletion),为改变遗传信息可读框的移码突变,其相应的临床表型均为DMD。同一家系的病例5、病例6的缺失突变属框内缺失(in-frame deletion),为缺失下游仍然保持正常可读框的整码突变,其相应的临床表型为BMD。5例中国人连接片段的序列特点:分析发现JUNCTION 1的5'端断裂点位于第45内含子LINE/L1序列内,邻近MAR,附近存在回文序列,其3'端断裂点邻近第50内含子的MAR;JUNCTION 2的5'端断裂点附近存在回文序列,其3'端断裂点位于第55内含子LINE/L1序列内;JUNCTION 3的5'端断裂点位于第30内含子LINE/L1序列内,附近存在回文序列;JUNCTION 4的5'端断裂点位于第44内含子LINE/L1序列内,邻近MAR,其3'端断裂点两旁存在回文序列;JUNCTION 5的5'端断裂点位于第2内含子SINE/Alu序列内,其3'端断裂点邻近第5内含子的MAR,附近有TTTAAA序列。5例DMD基因缺失相连接的序列均无广泛同源性。发现JUNCTION 1具有5 bp的微小同源序列连接断裂点两端;JUNCTION 2为平端连接,另外在其5'端断裂点上游39 bp位置发现一处A→G点突变;JUNCTION 3插入7 bp序列连接断裂点两端;JUNCTION 4具有4 bp的微小同源序列连接断裂点两端;JUNCTION 5插入26 bp序列并在连接点周围形成3个13 bp的重复连接断裂点两端,且在其5'端断裂点上游20 bp位置发现一处A→G点突变。4.结论6例假肥大型肌营养不良症病例基因型和表型的关系均符合阅读框规则,其中4例为out-of-frame缺失突变导致DMD,2例为in-frame缺失突变导致BMD。DMD基因的一些二级结构特点促进其断裂重组。5例中国人连接片段序列总体上具备容易导致DMD基因缺失重组的所有分子结构特点,包括重复序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。并且5例中国人连接片段均采取非同源末端连接进行修复,其连接特点包括微小同源性、小的插入、重复、平端连接。二、利用连接片段进行缺失型DMD/BMD携带者检测1.研究目的依据DMD基因缺失后断端重接可形成的一段变异的DNA序列,提出一种利用连接片段进行缺失型DMD/BMD携带者检测的新方法。2.方法研究对象:2个DMD/BMD家系和1个散发病例家庭的女性亲属。其中家系1为一个BMD家系,家系中Ⅲ_1、Ⅲ_4为确诊的患者,先证者Ⅲ_1(病例5)已证实为第3～5外显子缺失并已克隆其连接片段JUNCTION 5,Ⅲ_1的母亲Ⅱ_2、Ⅲ_4的女儿Ⅳ4为肯定携带者,Ⅲ_1的妹妹Ⅲ_3为可能携带者;家系2为一个DMD家系,其中先证者Ⅲ_2(病例3)已证实为第31～43外显子缺失并已克隆其连接片段JUNCTION 3,Ⅲ_2的母亲Ⅱ_3为肯定携带者;病例4为一DMD散发病例,已证实为第45～54外显子缺失并已克隆其连接片段JUNCTION 4,其母亲待检测排除为携带者。抽提制备以上检测对象外周血基因组DNA。携带者检测:在连接片段序列已被成功测序的情况下,对扩增以上JUNCTION 5、JUNCTION 3、JUNCTION 4的引物进行重新设计减短PCR产物长度,以提高常规PCR扩增连接片段的成功率。然后以相应的新设计3对引物D4-F/R、D31-F/R2、D6-F/R分别对以上2个家系中女性待检测对象和病例4母亲可能存在的连接片段进行PCR扩增和测序,同时扩增患者的连接片段作对照。3.结果家系1检测结果:对家系1的3例女性Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ4的连接片段PCR反应均为扩增出与患者Ⅲ_1、Ⅲ_4一致的阳性结果,同时比较Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ_4与Ⅲ_1、Ⅲ_4的连接片段的测序结果无差异,诊断家系1的Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ4均为BMD女性携带者。家系2检测结果:对家系2的1例女性Ⅱ_3的连接片段PCR反应为扩增出与患者Ⅲ_2一致的阳性结果,同时比较Ⅱ_3与Ⅲ_2的连接片段的测序结果无差异,诊断家系2的Ⅱ_3为DMD女性携带者。病例4的母亲检测结果:对病例4的母亲的连接片段PCR反应结果为扩增阴性,而对照的病例4扩增出阳性结果,可以排除病例4的母亲为DMD女性携带者。4.结论在对DMD/BMD先证者的连接片段的进行克隆和测序后,利用常规PCR技术直接检测待诊女性亲属是否带有连接片段,可以达到准确进行携带者检测的目的。通过测序分析表明相同家系中患者和女性携带者连接片段的序列完全一致,因此尽管不同家系患者的DMD基因缺失情况各异,但一般而言同一家系DMD基因缺失的基因型相同。叁、连接片段在缺失型DMD/BMD产前诊断的应用和评价1.研究目的探讨利用连接片段进行缺失型DMD/BMD产前诊断的方法,通过实施评价其优势和不足。2.方法研究对象:在家系1的Ⅲ_3确诊为女性携带者之后,在知情同意的情况下将其作为实施产前诊断的对象。携带者Ⅲ_3共妊娠3次,其中Ⅳ_1、Ⅳ_2为先后两次人工流产的绒毛。Ⅳ_3为第叁次妊娠待诊胎儿,分别在孕11周绒毛取样和孕20周取羊水标本进行产前诊断。抽提制备以上标本基因组DNA。人流绒毛的基因诊断方法:以新设计引物D4-F/R分别对以上2例人流绒毛Ⅳ_1、Ⅳ_2可能存在的连接片段进行PCR扩增和测序,同时扩增先证者Ⅲ_1的连接片段作为对照;以引物ex3-F/R分别检测Ⅳ_1、Ⅳ_2是否有相应外显子缺失;以扩增SPY基因的引物分别对Ⅳ_1、Ⅳ_2作性别鉴定。产前诊断方法:以新设计引物D4-F/R分别对携带者Ⅲ_3在不同孕期所取绒毛组织和羊水可能存在的连接片段进行PCR扩增和测序,并扩增先证者Ⅲ_1的连接片段作为对照;以引物ex3-F/R分别检测2次所取样品的DMD基因第3外显子,并以引物ex6-F/R扩增未缺失的第6外显子作为正常对照,判断是否有外显子缺失;以扩增SRY基因的引物分别对2次所取样品作性别鉴定。3.结果家系1的Ⅲ_3两次人流绒毛的基因诊断结果:对第一次人流绒毛Ⅳ_1的连接片段PCR反应为扩增出与先证者Ⅲ_1一致的阳性结果,对Ⅳ_1第3外显子的PCR检测结果为扩增阳性无缺失,对Ⅳ_1性别鉴定结果为女性。同时比较Ⅳ_1与本家系先证者Ⅲ_1的连接片段的测序结果无差异,诊断携带者Ⅲ_3第一次人流绒毛Ⅳ_1为BMD女性携带者。对第二次人流绒毛Ⅳ_2的连接片段PCR反应结果为扩增阴性,对Ⅳ_2第3外显子的PCR检测结果为扩增阳性无缺失,对Ⅳ_2性别鉴定结果为男性。诊断携带者Ⅲ_3第二次人流绒毛Ⅳ_2为正常男胎。家系1的Ⅲ_3第叁次妊娠产前诊断结果:对孕11周所取绒毛组织基因组DNA的连接片段PCR反应结果为扩增出与先证者Ⅲ_1一致的阳性结果,对其第3外显子的PCR检测结果为扩增阳性无缺失,性别鉴定结果为男性。男性胎儿出现检测到DMD基因缺失连接片段而相应外显子无缺失的矛盾结果,提示所取的绒毛样品受到母体细胞污染。对孕20周羊水细胞基因组DNA的连接片段PCR反应结果为扩增出与先证者Ⅲ_1一致的阳性结果,对其第3外显子的PCR检测结果为扩增阴性(经验证第4外显子同为PCR扩增阴性结果),存在相应的DMD基因缺失,性别鉴定结果为男性。同时比较该连接片段与本家系先证者Ⅲ_1的连接片段的测序结果无差异,诊断胎儿Ⅳ_3为BMD患病男胎并指导引产,取引产胎儿组织进行复查结果无误。4.结论在缺失型DMD/BMD产前诊断上通过PCR扩增连接片段和检测是否有相应的外显子缺失,可以准确判断男性胎儿是否为患病胎儿,并能有效鉴别检测标本是否受到母体细胞污染。不足之处是比较繁琐和耗时,且仅能应用于缺失型DMD/BMD。总结:1.6例缺失型DMD/BMD研究对象在DNA水平均符合阅读框规则。2.报道了迄今为止数量最多的东方亚洲人DMD基因缺失连接片段序列资料,共完成5例中国人连接片段的测序。3.DMD基因的一些二级结构特点促进其断裂重组。5例中国人连接片段序列总体上具备容易导致DMD基因缺失重组的所有分子结构特点,包括重复序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。4.5例中国人连接片段均为采取非同源末端连接进行修复,其连接特点包括微小同源性、小的插入、重复、平端连接。5.首次对相同DMD/BMD家系中多个患者和携带者的DMD基因缺失连接片段进行测序分析。6.发现尽管不同家系患者的DMD基因缺失情况各异,但一般而言同一家系DMD基因缺失的基因型相同。7.成功利用常规PCR扩增连接片段的方法对3个不同缺失型DMD/BMD家庭进行携带者检测。8.该方法与目前常用携带者检测方法的主要区别是不对DMD基因进行定量分析,只要对女性被检者检测出与先证者一致的连接片段即可确认为携带者,方法直观、准确。9.首次将连接片段应用于1例BMD女性携带者产前诊断,实现了利用连接片段进行缺失型DMD/BMD产前诊断的设想。10.连接片段应用于DMD/BMD基因诊断的技术缺点是首先需要分析先证者的基因型,比较繁琐和耗时,且仅能应用于缺失型DMD/BMD。创新点:1.克隆了5例新的DMD基因缺失突变序列。2.首次将基于常规PCR技术扩增连接片段的方法应用于缺失型DMD/BMD携带者检测和产前诊断。3.突破了以往认为常规PCR技术不能检测DMD/BMD携带者的观点。4.在缺失型DMD/BMD产前诊断上通过PCR扩增连接片段和检测是否有相应的外显子缺失,可以准确判断男性胎儿是否为患病胎儿,并能有效鉴别检测标本是否受到母体细胞污染。5.该方法对检测样品需求量小,具有应用于植入前遗传学诊断可行性。
张婷[7]2013年在《实时荧光定量PCR和STR连锁分析在遗传病基因诊断及产前诊断中的应用》文中进行了进一步梳理遗传病的分子致病机制包括点突变,基因内或整个基因的拷贝数异常,微小的插入或缺失。实时荧光定量PCR技术,能通过荧光信号实时监测整个PCR进程,通过特定的数学原理对未知模板进行基因剂量分析。实时荧光定量PCR已经广泛用于多种遗传病的基因拷贝数检测,它因为具有经济、易行、快速且准确等特点而深受用户喜爱。连锁分析是利用与基因紧密相连的分子标志,通过比较家系成员单倍型来调查遗传方式、确立单基因遗传病携带者状态并能用于产前诊断的分子检测方法。短串联重复序列STR (Short tandem repeats, STR)是一种广泛存在于人类基因组,以2-6个碱基为单位、串联重复排列的序列。它们在人群中多达十几个等位基因片段,具有高度多态性,并按照孟德尔共显性遗传的方式传递,具有杂合度高和多态信息量大特点,可以作为一种遗传标记用于遗传病的诊断。本文采用实时荧光定量PCR和STR连锁分析对杜氏进行性肌营养不良、脊髓性肌萎缩以及先天性肾上腺皮质增生进行基因诊断和产前诊断,旨在强调这两种传统的分子诊断方法的实用性并探讨它们的局限和不足之处。
杜文津[8]2002年在《DNA微阵列技术对DMD基因缺失检测的基础与临床研究》文中进行了进一步梳理DMD和BMD是一组X连锁隐性遗传的神经肌肉系统疾病，特点是进行性加重的肌肉萎缩与无力。发病率为活产男婴的1/3500。该病发病率高，危害大，为遗传病研究中的重点之一。至今尚无有效的治疗方法，故及时确诊患者、检出携带者和进行产前诊断成为降低本病的最重要措施。 DMD基因定位于人类X染色体短臂Xp21上，长度为2500kb，由79个外显子和78个内含子构成。基因的编码产物为抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，是一种分子量为427kD的糖蛋白，位于骨骼肌细胞膜内，对于维持肌细胞的骨架结构、保持膜内外钙离子的正常浓度至关重要。DMD基因具有突变频率高且突变形式多样之特点。早期研究发现，基因突变中缺失占55％-65％，点突变占25％左右，重复占5％-10％，其它微小缺失和微小重复占8％左右。可见DMD基因的部分或全部缺失为该病的重要病因之一。该基因通常断裂发生于内含子中，而导致断裂点之间一个或几个外显子的缺失。DMD基因缺失集中在两个热点区域：一个在该基因的5’端，包括外显子2-20，占总缺失的30％；另一个在中央区，包括外显子44-53，占总缺失的70％。基因缺失的位置和大小无固定规律。鉴于这种特点，其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。 目前国内外许多单位均已开展了DMD基因诊断，对基因缺失的检 第四军医大学硕士学位论文测主要是通过用cDNA探针的Southern印迹或用经典引物的PCR方法进行的。尽管这些方法应用很广泛，但它们也有一定的局限性，不能对大量可能缺失的片段同时进行检测。DNA微阵列技术则可以用来同时检测大量外显子信息。微阵列所包含的外显子信息量越大，其优越性越明显，突出表现为检出率的提高和克服了PCR选择引物的盲目性。 本实验分为基础研究和临床研究两部分。基础研究致力于外显子探针的制备（基因工程的方法）和DNA微阵列的研制（合成后点样法）；临床研究则应用DNA微阵列技术检测临床患者的DMD基因缺失倩况。具体实验方法和结果如下： 1．由健康人外周静脉血白细胞提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，应用 Chamberlain等和 Beggs等设计的 18对引物，对 DMD基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGE炉1 E卿载体连接，转化ECOli JM109感受态细胞。通过平板培养，挑选阳性克隆。提取重组质粒，Not酶切，获得完整的克隆片段，并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。克隆和测序结果说明，扩增到的产物确为DMD基因外显子 4、44、12、8、sl、17、19、48、45、52、60、47、6、13、50、43、3、49片段，与己报道的序列具有极高的相似性。这些片段长度分别为196、268、331、360． 388、416、459、506、547、113、139。181、202、238、271、357、410、439hp。通过上述基因工程的方法可以大量制备这些外显子片段，并为DNA微阵列的研制做好了探针方面的准备。 2．以此克隆产物作为检测DMD基因常见易缺失外显子的核昔酸探针。在NC膜上固定探针，标记扩增待检样品，进行传统的反向斑点杂交试验。初步验证了探针的特异性。 3．用APESs＊yLyS对普通载玻片进行处理（分别用APESIOlyLyS单独处理，以及用APES和POlyLyS共同处理）后，固定FITC荧光标记的人类基因组 DNA随机扩增样品，以不同浓度的盐溶液（dHO，PBSpH7．4，0＊XSSC，ZXSSC，SXSSC）冲洗。测定玻片的不同处理方式和洗涤方式对固定的核酸样品牢固性的影响程度。结果表明，核酸样品都 一6一 第四军医大学硕士学位论文会在洗涤过程中有所脱落，其程度随着溶液盐浓度的增加而增大：不同处理的玻片在核酸固定效率上略有差别，以APES和POlyLyS联合处理的玻片固定效率最高。 4．以 APES和 POly－LyS联合处理的玻片为固相支持物，以克隆得到的 18个 DMD基因常见易缺失外显子片段为探针，利用点样法制备简易微阵列。另设 8－acin的 DNA片段为阳性对照，pUC gffiCORI的 DNA片段为阴性对照。共 20个点，组成 5 X 4阵列。对待检的核酸样品进行ienow法随机引物扩增，同时掺入FITC荧光标记dUTP。用荧光显微镜观察微阵列杂交后荧光信号的分布，缺乏荧光信号的点提示该点所包含的基因片段在待检样品中缺失。 5．应用DNA微阵列技术对临床收集的30例DMD＄MD、l例面肩肪型肌营养不良、2例强直性肌营养不良、二例遗传性痉挛性截瘫患者和5例正常人进行DMD基因缺失型突变检测。结果显示：30例DMD用MD患者中有 ZI例至少存在一个外显子片段缺失，占 70％；9例未被检测到缺失。ZI例缺失型突变中单个外显子缺失和多个外显子连续型缺失分别为二例和 10例，非连续型缺失为 9例。具有外显子缺失的患者中，11例缺失部位集中于第44－53号外显子，5例集中于第2－20号外显子，5例在以上两个区域均有缺失。其中 45、sl号外显子缺失频率最高，44、48
杜文津[9]2001年在《DMD基因突变检测技术的回顾与展望》文中指出DMD是一类发病率较高的 X连锁隐性遗传病。DMD基因突变机制复杂 ,探索更直接、简便、准确的基因突变检测技术是目前对 DMD研究的热点。随着分子生物学的发展 ,DMD基因诊断技术取得了一定的进展 ,本文探讨了各项技术的优势与缺陷 ,并展望了生物芯片等新技术的应用前景
郝好英[10]2011年在《多重置换扩增联合单倍体分析对DMD行植入前诊断的可行性研究》文中提出植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD)是与辅助生殖技术相结合进行的一种遗传学诊断技术。PGD在遗传诊断后将无遗传缺陷的胚胎植入母体子宫,诊断在妊娠发生之前,因此防止了遗传病的发生。杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是神经肌肉系统中最常见的X-连锁隐性遗传病,具有较高的发病率和死亡率,目前尚无有效治疗方法,主要通过产前诊断防止DMD患儿的出生。对DMD进行PGD不仅可以防止DMD患儿的出生,而且能够避免反复流产、引产对孕妇造成的身心伤害,是一种优于产前诊断的孕前诊断。由于PGD的分析材料极其有限,通常只有1-2个细胞,限制了DMD-PGD的开展,而常用的FISH'性别鉴定又导致正常男性胚胎的销毁,因此开展DMD-PGD,需建立有效的单细胞扩增方法和更安全的诊断技术。目的：本文旨在通过多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA)及单倍体分析(haplotyping)的联合运用,探讨MDA和单倍体分析在DMD-PGD中应用的可行性,拟建立一种更为高效、安全的DMD-PGD方法。方法：选择高杂合度的8个STR位点及3个性别鉴定位点,对12对无DMD家族史的ICSI/IVF-ET夫妇的胚胎行MDA后的植入前单体型分析(Preimplantation genetic haplotyping, PGH)(其中3对仅用4个STR及1个性别鉴定位点)。首先采用MDA对单卵裂球细胞进行全基因组扩增,然后对胚胎及其亲本进行单倍体分析。在随机假设母本某一单体型为致病单体型的前提下,对胚胎进行遗传分析。结果：共收集胚胎19枚,其中双原核胚胎11枚,单原核胚胎1枚,叁原核胚胎2枚,不明受精胚胎5枚。共取卵裂球51枚,1枚MDA发生污染,6枚MDA失败,单卵裂球MDA成功率86.3%(44/51)。44枚MDA成功的卵裂球单体型均获成功分析,单倍体分析成功率100%(44/44),MDA-PGH成功率86.3%(44/51)。33枚双原核胚胎卵裂球中,28枚MDA成功,MDA-PGH成功率84.9%(28/33),平均ADO (allele dropout)和AF (amplification failure)分别为25.3%和3.2%。在假设母亲某一单体型携带DMD3-11号和44-45号外显子缺失突变的前提下,25枚卵裂球单倍体分析结果示胚胎为正常男性或DMD女性携带者,另外3枚卵裂球为单倍体,示胚胎异常。取自异常受精胚胎的18枚卵裂球中,16枚MDA成功,MDA-PGH成功率88.9%(16/18)。结论：1.本实验MDA成功率86.3%,比文献报道稍低,单倍体分析成功率达100%,可联合用于临床PGD。2.对DMD行植入前单倍体分析,各单体型针对突变选择的STRs中,≥2个为有效位点时,选择4个和选择8个STRs的单倍体分析成功率均可达100%。3.单倍体分析联合性别鉴定,不仅可鉴定DMD女性携带者,还可鉴定正常男性胚胎,避免FISH性别鉴定造成正常男性胚胎的销毁。
参考文献：
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[4]. 荧光PCR定量技术在遗传病诊断中的应用[D]. 文曙. 中南大学. 2003
[5]. 单基因遗传病的基因诊断及其应用研究[D]. 钟昌高. 中南大学. 2003
[6]. DMD基因缺失突变及连接片段应用于基因诊断的研究[D]. 钟敏. 南方医科大学. 2009
[7]. 实时荧光定量PCR和STR连锁分析在遗传病基因诊断及产前诊断中的应用[D]. 张婷. 浙江大学. 2013
[8]. DNA微阵列技术对DMD基因缺失检测的基础与临床研究[D]. 杜文津. 第四军医大学. 2002
[9]. DMD基因突变检测技术的回顾与展望[J]. 杜文津. 国外医学.遗传学分册. 2001
[10]. 多重置换扩增联合单倍体分析对DMD行植入前诊断的可行性研究[D]. 郝好英. 中南大学. 2011
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