草鱼GPATCH3基因的克隆表达及其在先天免疫中的作用

论文摘要

G-patch结构域广泛存在于与RNA结合相关的蛋白中,该结构域约48个氨基酸残基,以富含甘氨酸（Gly）为主要特征。包含G-patch结构域的这些蛋白在不同组织中均有广泛表达,而且参与到先天免疫、mRNA转录后加工、发育和肿瘤增殖等生命活动中。其中,GPATCH3是一种在408-456位氨基酸包含此结构域,并在人体各组织广泛表达的蛋白。近年来,有研究发现人GPATCH3蛋白对RLR信号通路起着负调控的作用。此通路中,RIG-I和MDA5识别病毒的RNA并激发下游的一系列信号传递,使IRF3被磷酸化并入核,最终诱导I型干扰素（IFNI）的大量表达。之后,IFN作为信号分子可以诱导若干ISGs表达,发挥抗病毒功能。在对鱼类的研究中,与GPATCH3的相关报道仍十分稀少,多存在于基因组预测结果中。在对斑马鱼的研究中,发现敲除GPATCH3的个体在发育中出现了颅部畸形和眼部畸形。鱼类GPATCH3在先天免疫中的功能还没有报道。本实验以草鱼为材料,借由预测软件的辅助,在以脾脏组织为模板建立的cDNA文库中,成功克隆并获得了CiGPATCH3的mRNA序列。该基因mRNA全长为1646nt,其中CDS区1221nt,编码407个氨基酸,5′UTR含303nt,3′UTR有122nt。与多个物种的G-patch结构域对比,草鱼的GPATCH3有着与G-patch结构域特征十分吻合的序列,共48个氨基酸残基,位于299-347位,含有8个Gly保守氨基酸位点,N-端则含有2个低复杂性区段。与其它物种的G-patchcontaining蛋白结构相比,除保守位点外,其它序列则不尽相同。系统进化树分析的结果表明,在多数硬骨鱼中,GPATCH3有较近的亲缘关系,草鱼与鲤鱼和鲫鱼的亲缘关系最为接近。用qRT-PCR法分析组织模板,发现草鱼GPATCH3在脑、眼、心、鳃、肠、肝、脾和肾组织中均有表达。其中,在肝和脑中的表达量较高。经过poly（I:C）刺激后,该基因在眼、肠、肝和肾组织都出现了两次明显上调,分别是12h和48h;而脑、心和鳃组织的表达量趋势均先下降后上升;相比其他组织,脾组织中GPATCH3的mRNA水平则没有明显的变化。同样的方法分析poly（I:C）梯度时间刺激的CIK细胞模板,GPATCH3表达情况与组织定量基本吻合。用转染poly（I:C）的方式模拟RNA病毒入侵细胞,并在CIK细胞中过表达GPATCH3,24h后转染poly（I:C）,12h后提取总RNA检测。经qRT-PCR检测,相比仅转染poly（I:C）刺激的细胞,有过表达GPATCH3的细胞中IFN和ISG15的mRNA水平表达量有明显上升;而孵育poly（I:C）的两个实验组无论是否过表达GPATCH3,IFN和ISG15的mRNA水平也仅表现为倍数相近的上调。细胞活性实验中表现出的结果与qTR-PCR结果吻合,过表达GPATCH3可显著增强受内源poly（I:C）胁迫的细胞的活性。由此认为,GPATCH3有可能参与了RLR信号通路。选取IRF3作为关键蛋白,观察其核质分布变化。在CIK细胞中过表达GPATCH3,24h后转染poly（I:C）,并选取不同的时间梯度作为检查点。结果表明,过表达GPATCH3的实验组细胞核中的IRF3蛋白量相对更多。进一步的实验表明,在受到poly（I:C）刺激之后,过表达GPATCH3可以使IRF3更早地活化并入核发挥作用。综合以上实验结果,GPATCH3作为新发现的与先天免疫相关的蛋白,在草鱼先天免疫应答中起着增强作用,并能提高细胞活性。通过本研究丰富了草鱼先天免疫应答体系的信息,为草鱼疾病防控和培育新种提供了理论依据,填补了部分空白;同时也从不同物种的研究丰富基础科学研究成果。

论文目录

摘要

Abstract

第一章引言

1.1 鱼类先天免疫简介

1.2 干扰素及其相关蛋白

1.2.1 干扰素

1.2.2 草鱼IRF3

1.2.3 草鱼ISGs

1.3 模式受体信号通路

1.3.1 模式受体概述

1.3.2 RLR信号通路

1.3.3 RIG-I样受体介导的信号转导

1.4 G-patch结构域的发现与功能

1.4.1 G-patch结构域的发现

1.4.2 G-patch-containing蛋白的功能

1.4.3 GPATCH3的相关研究

1.5 本课题的研究意义

第二章材料与方法

2.1 试剂与引物

2.2 实验材料

2.3 相关软件

2.4 草鱼GPATCH3基因克隆

2.4.1 相关基因组数据的获取

2.4.2 PCR反应

2.4.3 草鱼基因组数据库（GCGD）预测片段克隆

2.4.4 RACE获得 5′和 3′末端序列

2.5 表达载体构建

2.5.1 表达载体构建

2.5.2 感受态细胞制备

2.5.3 转化

2.5.4 TA克隆

2.5.5 菌液PCR

2.5.6 琼脂糖凝胶电泳

2.6 在CIK细胞中过表达GPATCH3

2.6.1 细胞复苏

2.6.2 细胞传代

2.6.3 细胞冻存

2.6.4 质粒提取

2.6.5 转染

2.7 q RT-PCR分析

2.7.1 RNA提取

2.7.2 c DNA合成与SMART c DNA文库

2.7.3 q RT-PCR反应

2.8 制备GPATCH3多克隆抗体

2.8.1 原核蛋白诱导表达

2.8.2 超声破碎

2.8.3 包涵体收集

2.8.4 割胶回收蛋白

2.8.5 抗原蛋白注射

2.8.6 抽血与血清收集。

2.8.7 抗体检测

2.9 SDS-PAGE凝胶电泳

2.9.1 制胶

2.9.2 电泳

2.9.3 考马斯亮蓝染色

2.10 Western blot

2.10.1 细胞蛋白抽提

2.10.2 转膜

2.10.3 洗膜与抗体孵育

2.10.4 显影

第三章结果与分析

3.1 Ci GPATCH3 m RNA全长及序列分析

3.2 G-patch结构域分析

3.3 系统进化树分析

3.4 组织和细胞模板的q RT-PCR定量分析

3.5 多克隆抗体制备

3.6 过表达GPATCH3上调IFN-1 与ISG15的表达量

3.7 过表达GPATCH3对细胞活性的影响

3.8 过表达GPATCH3对IRF3核质分布的影响

第四章讨论与展望

致谢

参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘昌鑫

导师: 毛慧玲

关键词: 草鱼,结构域,先天免疫

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q953

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000716

总页数: 58

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草鱼GPATCH3基因的克隆表达及其在先天免疫中的作用

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