呼吸道合胞病毒F蛋白在原核细胞中表达及免疫原性评价

论文摘要

呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿和易感成人呼吸道感染的最主要病原体之一。它能够引起严重的毛细支气管炎和间质性肺炎等。2岁以下的婴幼儿基本都感染过呼吸道合胞病毒,而且出现反复感染的现象。呼吸道合胞病毒每年导致20多万人死亡,死亡主要发生在发展中国家。帕丽珠单抗是唯一特异性的预防和治疗用药,但其造价昂贵,仅限用于患有严重呼吸道疾病的婴儿。疫苗是预防病毒感染的有效手段,自20世纪60年代福尔马林灭活疫苗的失败以来,直到今天仍然没有被批准上市的疫苗。因此急需开发安全有效的RSV疫苗来预防病毒感染。呼吸道合胞病毒F蛋白是病毒感染所必须的,其序列高度保守是中和抗体的主要靶标,基于此设计研发的疫苗最多。大部分蛋白疫苗以真核表达的糖基化的F蛋白为主要抗原,少有针对于原核表达的去糖基化的F蛋白的研究。佐剂与蛋白的结合使用能产生更好的免疫原性。细菌样颗粒(BLP)是一种鼻滴佐剂,能够诱导局部的粘膜免疫,可以在病原体的入侵部位发挥防御作用。AL佐剂是可用于人的安全有效的佐剂。尚不清楚BLP佐剂与传统的AL佐剂对原核表达的F蛋白免疫效果的影响。本文旨在对比真核表达糖基化F蛋白与原核表达去糖基化F蛋白的免疫原性和攻毒保护力差异。本论文基于一个安全有效的以BLP为佐剂滴鼻免疫的真核表达的呼吸道合胞病毒F蛋白疫苗,设计了一个大肠杆菌原核表达的呼吸道合胞病毒F蛋白疫苗。以pET28a为载体构建F蛋白重组质粒并进行了表达和纯化,进而对比了真核表达的F蛋白(eRSV F)和原核表达的F蛋白(pRSV F)在BLP佐剂鼻滴免疫和AL佐剂皮下免疫两种不同的免疫策略下的免疫原性和攻毒保护力的差异。结果发现,在鼻滴免疫和皮下免疫中eRSV F都能诱导产生显著高于pRSV F的结合抗体和中和抗体水平,皮下免疫组又整体高于鼻滴免疫组。eRSV F皮下组免疫原性最好,只有eRSV F鼻滴组能诱导粘膜免疫产生。eRSV F能够保护RSV攻毒而pRSV F保护性差。表明原核表达的呼吸道合胞病毒F蛋白免疫原性低保护力差。

论文目录

摘要

abstract

缩略词表

第1章前言

1.1 RSV简介

1.1.1 RSV的危害

1.1.2 RSV的临床表现

1.1.3 RSV的流行病学

1.1.4 RSV结构

1.1.5 RSV的感染机制

1.2 RSV疫苗研究进展

1.3 原核表达系统

1.4 佐剂

1.5 论文立题依据与实验设计

1.5.1 立题依据

1.5.2 实验设计

1.5.3 技术路线图

第2章实验材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 主要仪器

2.1.2 常用酶与试剂盒

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 pRSV F蛋白目的基因的获得及密码子优化

2.2.2 pEASY-pRSV F的构建

2.2.3 转化及质粒小提

2.2.4 pET28a-pRSV F的构建

2.2.5 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

2.2.6 Western Blot检测

2.2.7 pRSV F在大肠杆菌的表达

2.2.8 pRSV F蛋白纯化

2.2.9 pRSV F-BLP的制备

2.2.10 动物免疫实验

2.2.11 空斑法测定RSV病毒滴度

2.2.12 ELISA检测法

2.2.13 空斑试验检测中和抗体

2.2.14 肺部组织病理

2.2.15 空斑法检测肺部病毒滴度

第3章实验结果与分析

3.1 pET28a-pRSV F表达质粒的构建

3.1.1 pEASY-pRSV F的构建

3.1.2 pET28a-pRSV F的构建

3.2 pRSV F在大肠杆菌菌中的表达与纯化

3.2.1 pRSV F在大肠杆菌中的表达

3.2.2 SP阳离子层析蛋白纯化

3.3 pRSV F-BLP的制备

3.4 免疫原性评价

3.4.1 结合抗体Ig G效价检测

3.4.2 结合抗体Ig G浓度检测

3.4.3 粘膜抗体Ig A检测

3.4.4 中和抗体的检测

3.5 保护力评价

3.5.1 肺部组织病理学

3.5.2 肺部病毒载量

分析讨论

全文结论

参考文献

作者简历

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴帆

导师: 侯阿澧

关键词: 呼吸道合胞病毒,蛋白,原核表达,免疫原性

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R392

总页数: 63

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呼吸道合胞病毒F蛋白在原核细胞中表达及免疫原性评价

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