党永军[1]2003年在《微管相关蛋白1轻链蛋白3家族翻译后修饰方式的研究》文中指出自噬现象是一种高度保守的细胞行为，几乎在所有的物种中都存在。已经在细胞的胁迫反应，细胞的凋亡和死亡以及很多疾病组织中都发现了自噬囊泡异常的现象，大鼠微管相关蛋白轻链3(Mapllc3)蛋白是第一个在哺乳动物细胞中鉴定的定位在自噬体膜上的蛋白。它在体内同时以两种不同分子量的形式存在。其中18KDa的Mapllc3蛋白是微管相关蛋白1的轻链亚基，称为Lc3-Ⅰ；另一种16KDa的Mapllc3蛋白则是自噬体膜的必须组分，称为Lc3—Ⅱ。Lc3—Ⅰ和Lc3—Ⅱ都是一系列翻译后修饰的产物，其中特征性的修饰是在保守Gly120后发生的羧基端切割，此切割修饰对Lc3-Ⅱ定位于自噬体膜尤为重要。我们研究发现在大鼠，小鼠和人中MAP1LC3主要以两种型存在，LC3A型和LC3B型。在HEK293细胞中分别表达这叁个物种中的所有的A型、B型以及人MAP1LC3C分子，发现除了人的MAP1LC3B外其它同源物的修饰方式与已知的酵母Apg8和大鼠的LC3修饰方式相类似，均发生了羧基端的切割反应而且羧基端保守的甘氨酸是它们发生翻译后修饰的活性位点。而人的MAP1LC3B明显的与它们不同，用抗Myc表位的单抗进行western blot分析时仅检测到一条单一的16KDa蛋白条带。进一步分析表明人MAP1LC3B并没有发生羧基端的切割反应而且羧基端的赖氨酸代替了保守的甘氨酸成为人MAP1LC3B发生修饰的活性位点。我们通过超速离心和免疫荧光技术证明人的叁个基因均定位在自噬体膜上。人LC3A的膜定位与Gly120位点的切割和修饰紧密相关，而人LC3B的膜定位是与Lys122相关，进一步证明了修饰方式的特异性，对人LC3B的进一步研究表明参与其修饰的分子也与其它基因不同，并且饥饿可以诱导其修饰的发生。这些结果提示尽管这些基因都定位在自噬体上，但是它们可能在自噬体的形成过程中有着不同的生理功能。
吴家雪[2]2003年在《大鼠Map1LC3家族两个新基因的克隆及功能初步研究》文中认为大鼠微管相关蛋白轻链3(Map1lc3)蛋白在体内同时以两种不同分子量的形式存在。其中18KDa的Map1lc3蛋白是微管相关蛋白1的轻链亚基，称为Lc3-Ⅰ；另一种16KDa的Map1lc3蛋白则是自噬体膜的必须组分，称为Lc3-Ⅱ。Lc3-Ⅰ和Lc3-Ⅱ都是一系列翻译后修饰的产物，其中特征性的修饰是在保守Gly120后发生的羧基端切割，此切割修饰对Lc3-Ⅱ定位于自噬体膜尤为重要。我们通过生物信息学方法克隆到大鼠LC3的两个新的同源基因，分别命名为大鼠Map1LC3A和Map1LC3B，其中Map1LC3B是原Map1lC3的一个可变剪接本。分析大鼠Map1lC3家族两个新成员的组织表达谱，结果显示它们的组织表达谱有所差异，提示这两个新基因可能在不同的组织发挥功能。二个同源基因的推导蛋白与大鼠Map1lc3蛋白高度保守。分别在人的HEK293细胞中表达大鼠Map1lc3A和Map1lc3B，western blotting结果显示两者在体内皆以18KD和16KD两种大小不同的蛋白形式存在(LC3A-Ⅰ和LC3A-Ⅱ；LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ)，而且18KD的LC3A/B—Ⅰ蛋白的表达量明显多于相应的16KD的LC3A/B—Ⅱ蛋白。进一步的突变分析表明，Gly(120)是两个蛋白在体内发生翻译后修饰的关键位点。另外，通过荧光定位以及与MDC的共定位分析发现两个基因与大鼠的LC3相似，也是定位在自噬体上。这两个基因的克隆将有助于揭示自噬体在生物体内的形成过程及功能。
沈以红[3]2003年在《家蚕几种组织的EST及基因表达特征分析》文中指出本实验室选择家蚕12种不同组织器官和细胞，构建5′端非偏性cDNA文库，对每个文库大规模EST测序。本文在获得的大规模EST数据基础上进行数据分析、挖掘，以期发现家蚕的重要功能相关基因，并获取基因表达的组织差异和特异信息。这些基因的功能和表达信息获得，对家蚕有用基因资源的深度开发及鳞翅目害虫的有效控制有重要价值。 1 基于EST数据的基因表达谱聚类方法 本文采用基于大规模EST数据的基因表达谱聚类法，探讨在测序数据大量获得时从中提取有价值信息的数据分析方法。利用两两基因(contig)或样本(文库)的相关系数定义基因或样本间的距离，构建中高丰度表达基因和所有测序文库的进化树。从contig的进化树中获得具有一致表达特征的成组基因。文库进化树反映了构建文库的组织间的亲疏关系。 利用Audic和Cleaverie取得的一个新的适用于分析标签抽样数据显着性检验的成对状况比较法分析组织间差异表达基因，获得在两种组织间和同一组织不同时期基因表达显着不同的基因。 2 大规模EST特征 2．1 文库构建及初步分析 本实验室以家蚕品种“大造”为材料，选取五龄幼虫重要组织丝腺、中肠、脂肪体、体液、生殖腺和发育期胚胎共构建12个非偏性cDNA文库，5′端方向大规模测序，获得81625个合格的EST序列，Phrap软件拼接获得24678个非冗余序列(UniGene)，其中包括11627个重迭群(contig)，13051个独立EST(Singleton)。 同源分析共检索到7944个UniGene与GeneBank等数据库的数据同源，同源且有功能注释的已知基因有3899个UniGene(32605个EST)；同源但没有功能注释的已知序列有4045个UniGene(16087个EST)；新序列有16734个UniGene，(32933个EST)。本次测序共有60％的EST为未知功能序列。 2．2 基因表达谱聚类 对3064个contig(EST≥5)和12个文库分别聚类，构建树形图。Contig聚类结果，各文库中表达趋势一致的contig在树形图中构成相邻的一群，从中获取在本测序范围内文库(或组织)特异表达的contig以及组织间协同表达的contig，并作进一步研究。文库聚类结果，培养细胞、中肠和非受精卵与其它组织基因表达谱差异很大。脂肪体雌与雄、血液雌与雄、丝腺与卵巢表达谱很相似。丝腺与卵巢表达谱相似是一个有趣又值得探讨的现象。 2．3 所有文库中普遍表达基因分析 对所有测序组织中都有表达的UniGene分析，这部分有12个已知基因和7个已知序列。已知基因包括膜蛋白tetraspanin D107、翻译调控肿瘤蛋白同源物(TCTP)、热激相关蛋白、泛素融合蛋 西南农业大学博士学位论文生.目里典.里奥.月.目里巨口口目目典目目里县口白、鸟氨酸脱梭酶抗酶;、Y盒蛋白c卜妙。、核糖体蛋白、蛋白合成起始因子和翻译延长因子、丝素轻链、丝·J·蛋白P25和30kD蛋白等蛋白基因，在维持家蚕正常生命活动中它们有重要作用。特别是丝素轻链、丝…蛋白P25和30kD蛋白，该结果表明它们参与了家蚕重要的基础代谢过程。2.4所有文库中极高表达基因分析 对所有侧序组织中极高表达基因分析，有64个UniGene(EST)100)，代表巧个已知基因和7个已知序列。已知基因按表达量高到低依次是贮藏蛋白30kD，核糖体蛋白，丝心蛋白丝素轻链前体，丝氨酸蛋白酶，翻译控制肿瘤蛋白同源物(T叮P)，跨膜蛋白(tetrasP8nin D107)、P25、贮藏蛋白SPZ和SPI、热激蛋白、溶菌酶、成虫翅盘生长因子、泛素等基因。除丝氨酸蛋白酶基因是中肠特异表达，贮藏蛋白和成虫翅盘生长因子基因主要在脂肪体表达外，其余基因在各个组织中均表达。这些家蚕生理功能重要蛋白基因的高表达，显示五龄盛时期蛋白质旺盛合成的生产特性和为发育变态作物质准备这一生理特点3.家蚕脂肪体组织基因表达谱3.1脂肪体特异表达基因 幼虫脂肪体特异表达基因包括已知基因23个，未知功能序列52个。其中贮藏蛋白、抗菌蛋白和类IDGF基因居表达量前叁位，显示脂肪体合成贮藏蛋白、抗菌蛋白及参与发育的盆要生理功能。此外，保幼激素结合蛋白基因少量表达。检索silkBase数据库进一步确定其中叁个未知功能序列coatig是脂肪体特异表达. 蛹脂肪体特异表达基因包括7个己知基因(共5.52%)，未知功能序列108个(94.5%).已知基因有抗菌物hemofin、微管蛋白、表皮蛋白、转座酶、载脂蛋白基因低表达量表达。此外，特异表达的未知功能序列有早期卵壳基因的非编码区及相关的重复序列以较高水平表达。3.2雌雄差异表达基因 贮藏蛋白SPI和SPZ基因、与发育调控有关的蛋白基因、与能量代谢和卵形成有关的磷酸甘油酸脱氢酶基因在雌表达均比雄高;而贮藏蛋白3OkD蛋白、蛋白代谢有关的酶基因和胰蛋白酶抑制剂基因在雄表达高于雌，显示在mRNA合成阶段，就决定了性差别的特性，家蚕利用蛋白质方面雌雄可能有差别。3.3幼虫蛹差异表达基因 幼虫脂肪体内活跃进行多种物质代谢相关蛋白基因的表达，特别是贮藏蛋白和组织发育有关的调控蛋白、蛋白酶抑制剂和抗菌肤等基因;蛹脂肪体主要表达热激蛋白、表皮蛋白、微管和微
张金阳[4]2011年在《狂犬病毒感染的神经细胞差异蛋白质组学研究及伴侣素CCTγ的功能分析》文中认为狂犬病毒(Rabies virus, RV)属于弹状病毒科狂犬病毒属的单股不分节段的负链RNA病毒,具有高度嗜神经性和致死性。基因组全长约为12kb,分别编码糖蛋白(G)、核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)。目前对该病毒与宿主细胞相互作用的机制认识相对有限,致病机制仍不甚明了。本研究对RV感染的宿主细胞差异表达蛋白进行分析,旨在为探讨RV对宿主细胞的致病作用和寻找潜在的药物靶标奠定基础。单克隆抗体是疾病诊断、预防、治疗以及免疫机制研究的有力武器,除商业化的糖蛋白单克隆抗体,无针对RV其他蛋白的单克隆抗体。本研究将RV核蛋白重组表达载体pET32a-NP和糖蛋白重组表达载体pET32a-GP分别诱导表达,用变性纯化的表达蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备了9株抗RV核蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞和1株抗RV糖蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞。同时,通过以自制的狂犬病毒感染乳鼠脑组织悬液为抗原免疫小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞融合,成功获得了7株为抗RV磷蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞。为了探索病毒与宿主细胞的相互作用,本研究选择鼠成神经瘤细胞N2a为感染模型,采用二维凝胶电泳技术结合质谱鉴定的经典比较蛋白组学方法,分析了N2a细胞在感染RV后24h、48h和96h的差异蛋白表达谱。PDQuest软件分析结果显示,RV感染N2a细胞后,共出现了97个差异表达的蛋白点,差异表达的蛋白点主要出现在感染后48h和96h,且多数蛋白点呈现上调表达趋势。串联质谱MALDI-TOF/TOF对差异蛋白点进行鉴定,成功鉴定出对应49种差异蛋白的53个蛋白点。这些差异蛋白的功能涉及蛋白合成与加工、能量代谢、信号转导、应激反应／伴侣蛋白、基因调控、免疫反应和泛素——蛋白酶体通路。设计引物,并通过适时荧光定量PCR对其中的27个差异蛋白对应基因转录本的变化进行了验证,一定程度上确证了质谱鉴定结果的可靠性。免疫印迹实验验证了HSP90和CCTγ在感染组和对照组中上调表达的差异。针对差异表达蛋白,基于Ingenuity生物网络分析软件IPA绘制了这些差异蛋白的相互作用网络。上述差异表达蛋白信息和蛋白相互作用网络为进一步解析狂犬病发病机制提供了重要的蛋白组学信息。依据比较蛋白组学信息,采用间接免疫荧光双标技术进一步分析了RV感染细胞CCTα、CCTβ、CCTγ、HSP90、PFDN1和DLC8的亚细胞分布。结果表明,病毒感染引起了细胞CCTα和CCTγ蛋白在内氏小体部位的高度募集,PFDN1和DLC8在该部位的部分聚集,CCTα和CCTγ与病毒N、P蛋白能够很好的共定位；而CCTβ和HSP90则无明显的内氏小体部位募集现象。共转染RVN和P的细胞内也形成类似内氏小体的结构,且在该结构中出现与感染细胞类似的现象,CCTγ、CCTα、PFDN1和DLC8与内氏小体中N、P蛋白发生共定位。单独转染N或P的细胞中也出现不同程度的CCTγ和CCTα与N或P的共定位。荧光定量结果表明感染细胞中DLC8、CCTγ和HSP90均呈现出转录上调,而CCTα、 CCTβ、PFDN1则变化不明显；而P质粒单转以及与N质粒共转N2a细胞引起了DLC8的转录水平上调,这可能与P和DLC8的相互作用有关,而其他蛋白则变化不显着。这都说明,这些宿主细胞蛋白主动或被动的参与了病毒的生命活动。鉴于CCTγ在蛋白组学上的表达差异及亚细胞定位上的分布变化,有必要对其在狂犬病毒生命周期中的具体功能进行探索。本研究通过慢病毒介导的shCCTγ、shCCTα和无义序列shcoo2v(?)勺转导建立了稳定表达shCCTγ、shCCTα的RNA干扰细胞系,通过病毒接种,TCID50测定以及适时荧光定量PCR分析,发现CCTγ和CCTα的敲除能够降低狂犬病毒的复制以及病毒各基因的转录水平,表明CCTγ和shCCTα对于狂犬病毒的复制和转录是重要的。
王叁应[5]2013年在《传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的研究》文中研究表明传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属成员,主要侵害雏鸡体液免疫中枢器官法氏囊中的B淋巴细胞前体。IBDV基因组由分节段的A、B片段组成,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶VP1、衣壳蛋白VP2与VP3、病毒自身的蛋白酶VP4以及非结构蛋白VP5五种蛋白。目前VP4蛋白除作为一种病毒蛋白酶被认识外,其他一无所知,本研究分析了IBDV感染细胞内VP4蛋白的磷酸化修饰及功能。以杆状病毒表达的IBDV-VP4蛋白为免疫原,免疫6-8周龄雌性BALB/C小鼠,以HAT筛选培养基进行选择培养,以相应的偶联多肽和IBDV感染细胞进行ELISA和IFA筛选,结果获得6株稳定分泌的单克隆抗体细胞株4A8、5B2、5C7、5C9、7A4和7H8。亚型鉴定结果显示它们都是IgGl亚类,轻链为K型。结合表位预测与合成肽技术,鉴定出4A8、5B2、5C7叁株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体共同识别磷酸化抗原表位VP4-Ser26,而杂交瘤细胞5C9分泌的单克隆抗体识别非磷酸化抗原表位12FQVPQNPVVDGILASPGVLRGAHNLDCVLREGATL46;杂交瘤细胞7A4和7H8分泌的单克隆抗体共同识别非磷酸化抗原表位18PVVDGIL24,18P和21DGIL24是维持该表位的关键氨基酸。为了深入分析IBDV感染细胞内磷酸化修饰的VP4蛋白,借助识别磷酸化Ser26和非磷酸化位点的VP4蛋白单克隆抗体,分析了IBDV感染和VP4基因转染细胞内的VP4蛋白,结果显示,细胞内存在Ser26磷酸化和非磷酸化两种不同形式的VP4蛋白,VP4蛋白主要存在于细胞骨架组分中,而胞质、膜以及核组分中VP4蛋白含量相对较少。在此基础上,我们通过构建VP4蛋白中已鉴定的四个磷酸化位点S26、S65、Y99和T162的丙氨酸、天冬氨酸单点和多点突变载体以及多聚蛋白VP243突变体,观察了VP4蛋白在细胞中的表达分布和这些位点的突变对于VP4蛋白剪切功能的影响,VP4蛋白分布实验结果显示,S26和Y99位点的突变对VP4蛋白的分布没有影响,S65D(不是S65A)位点的突变会导致VP4蛋白的弥散分布,T162A(不是T162D)的突变会明显延迟VP4蛋白聚集的发生；VP4蛋白酶的活性分析结果显示,S26、S65、Y99和T162的磷酸化与去磷酸化修饰对VP4蛋白酶的活性没有影响,但Y99或T162位点的突变会严重影响VP4蛋白剪切功能的发挥。IBDV感染过程中病毒蛋白相互关系的解析对于病毒粒子的组装和成熟的研究至关重要。为此,以DF-1细胞模型,借助免疫荧光双标记技术分析了VP4蛋白与IBDV其它编码蛋白之间的相互关系。激光共聚焦观察结果显示,在IBDV感染的DF-1细胞内以针状或棒状存在的是VP4蛋白,呈团块状的VP4蛋白与VP1蛋白、VP2、VP3蛋白存在共定位关系；而在转染的细胞中,VP4与VP1蛋白、VP2、VP3蛋白不存在共定位关系。免疫共沉淀实验进一步显示,在IBDV感染情况下VP4与VP1、VP3蛋白存在相互作用。然而,在基因转染的细胞中这种互作关系不存在。以上结果说明,在IBDV感染细胞中出现的VP4与VP1、VP2、VP3蛋白共定位和相互作用现象是IBDV多聚蛋白VP243造成的。
吴家雪[6]2006年在《人LC3B-β的鉴定及其对LC3B-α的负反馈调节机制》文中研究说明大鼠微管相关蛋白1轻链3(LC3)经过一系列翻译后修饰，最后定位到自噬体膜上，目前已经作为自噬体的分子标记广泛应用于自噬过程和与之相关的许多生理，病理过程的研究中。我们以前报道了3个人LC3家族的新成员，LC3A，LC3B和LC3C。LC3A和LC3C与酵母Atg8和大鼠LC3相类似，经历了一系列的翻译后修饰，包括羧基末端的切割；但LC3B羧基末端不被切割，产生了一种不同于大鼠LC3的依赖于羧基末端未被切割的赖氨酸(Lys122)的新的翻译后修饰方式。最近日本学者报道人LC3B的羧基末端也能被切割，并进一步在Gly120产生修饰，与大鼠LC3类似。 为了阐述清楚这个问题，我们首先证明人LC3B由于可变剪接产生了两种亚型，LC3B-α和LC3B-β，分别具有或缺失Arg70。LC3B-α和LC3B-β在人的多种组织中都广泛表达。LC3B-α发生了典型的羧基末端切割反应，而且定位到自噬体膜上；LC3B-β不能。当LC3B-α的Gly120突变时，其羧基末端不能切割，此时LC3B-α的电泳行为与LC3B-β相同，且都受Lys122／121的影响。通过质谱分析，我们发现尽管LC3B-β和LC3B-β-K121A在电泳上表现为相差2KD，但它们的分子量几乎相同，也就是说LC3B-β上没有发生修饰。我们还对LC3B-α和LC3B-β的结构进行同源模拟，结果表明LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的结构：LC3B-α的羧基末端游离于其蛋白主体之外，不停的运动；而LC3B-β的羧基末端与其蛋白主体紧密结合在一起，是固定不动的，进一步从结构水平上解释了为什么LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的切割反应。GST pull-down实验证明ATG4B与LC3B-α和LC3B-β都能相互作用，而且ATG4B能在体外切割LC3B-α的羧基末端。将LC3B-α和LC3B-β同时转染细胞，发现LC3B-β能抑制LC3B-α羧基末端的切割，并影响LC3B-α的修饰和自噬体膜定位，提示LC3B-β在体内可能具有负调节自噬体形成的功能。 此外，本文还对本实验室以前克隆的大鼠LC3A和LC3B的翻译后修饰方式进行了进一步的研究。发现大鼠LC3A和LC3B经过了与大鼠LC3相同的翻译后羧基末端切割和修饰反应，并且都能定位到自噬体膜上。而且羧基末端保守的甘氨酸(Gly120)是大鼠LC3A和LC3B翻译后羧基末端切割和修饰，以及自噬体膜定位所必须的。因此我们认为大鼠LC3A和LC3B能作为新的自噬体分子标记，广泛应用于对自噬过程以及与之相关的生理和病理过程的研究之中。
冯同富[7]2008年在《卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究》文中研究说明卵巢上皮癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。临床上,以铂类为基础的联合化疗是其最重要和最主要的治疗方法。尽管在化疗的最初阶段,卵巢上皮癌对抗癌药物表现出较好的敏感性,但是随着化疗的进行其逐渐获得多药耐药性,因而其五年生存率一直徘徊在30—50%。为了更好的认识卵巢癌的多药耐药机制,我们用卡铂对卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3进行间断、大剂量冲击,建立了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CB,并且从蛋白和基因两个水平筛选、鉴定了两种细胞间的差异分子。第一部分:卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证研究目的:对铂类耐药细胞株SKOV3/CB进行相关生物学指标的检测验证。方法:MTT法检测SKOV3/CB对卡铂的耐药指数及对CTX、5-FU、ADM、VP-16、泰素和DDP的交叉耐药性;采用21天细胞计数法绘制细胞的生长曲线并计算其倍增时间;流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布。结果:SKOV3/CB对卡铂的RI为3.09,对CTX、VP-16、泰素和DDP有不同程度的耐药性,但对5-FU和ADM仍然敏感;同SKOV3相比其凋亡率和S期细胞明显增加,但生长速度却显着降低。结论:SKOV3/CB表现出典型的多药耐药特征,该耐药模型十分稳定达到了后续的蛋白和基因实验的实验要求。第二部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的蛋白表达差异,并进行相关蛋白的筛选和鉴定。方法:提取卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3的总蛋白,用蛋白二维液相分离色谱技术(ProtemeLab~(TM)PF-2D)总蛋白进行分级分离,然后用其自带的Proteovue和Deltavue分析软件进行两种细胞间差异蛋白的筛选;用电喷雾离子化串联质谱(ESI-MS/MS)结合数据库比对进行差异蛋白的鉴定。结果:共分离筛选出差异蛋白54个,其中SKOV3/CB表达上调的34个,SKOV3表达上调的20个。鉴定出SKOV3/CB比SKOV3表达上调的差异蛋白15个,即人假想镁离子转运体(humanputative magnesium transporter protein,HPT)、人亮氨酸拉链样蛋白(Leucinezipper-like protein)、超氧化物歧化酶-1(Superoxide dismutase,SOD-1)、硫氧还原蛋白(Thioredoxin,Trx)、Immunoglobulin heavy chain variable region、SMYD2、周期蛋白依赖激酶6抑制因子(cyclin-dependent kinase 6 inhibitor)、MYL9(Myosinregulatory light polypeptide 9)、垂体腺苷酸环化酶促多肽(pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide,PACAP)、stanniocalcin homolog、G蛋白信号通路的调节因子(human regulator of G-protein signalling,RGS)、T cell receptor betachain、TADAl protein和AX887247 NID。这些蛋白涉及离子转运、信号转导、氧化还原、增殖分化、免疫、甲基化、周期和凋亡调控等多方面。结论:PF-2D结合ESI-MS/MS是一种进行能够差异蛋白筛选、鉴定的有效方法。鉴定出的蛋白通过多种复杂机制介导了卵巢癌对铂类的耐药性的产生,这些蛋白有可能成为疗效预测分子或新的治疗靶标。第叁部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的基因表达差异,并进行相关基因的筛选和鉴定。方法:采用人类全基因组表达谱芯片对卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3进行差异基因的筛选和分析;用半定量逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)对芯片结果进行核对验证。结果:共分离筛选出差异基因3506个,SKOV3/CB比SKOV3上调的差异基因共有1712个,其中上调10倍以上的共有163个,SKOV3比SKOV3/CB上调的差异基因共有1794个,其中上调10倍以上的共有70个。SKOV3/CB比SKOV3上调10倍以上的6个差异基因,即ANXA6、UGDH、ZNF198、ERCC5、TWIST2和BIRC3经半定量RT-PCR验证,表明上述6个基因在耐药细胞株中的表达的确高于敏感细胞株,证明基因芯片的结果是可信的。结论:基因芯片是分析肿瘤差异基因的一种高通量的强有力工具。卵巢癌的多药耐药是一个多种基因参与的复杂过程。
姚志斌[8]2009年在《人正常晶状体蛋白质表达谱的构建和生物信息学分析》文中指出前言眼晶状体几乎是完全透明的器官,它能够让足够的光通过。晶状体呈双凸透镜状,能使光线准确地聚焦在视网膜上,就像照相机镜头一样,通过睫状肌的收缩或放松使我们清楚地看远和看近。晶状体还能过滤一部分紫外线来保护视网膜。因此,晶状体在眼屈光系统中发挥着重要的作用。晶状体的主要成分是蛋白质,晶状体蛋白受到干扰时很容易使晶状体变为不透明。晶状体蛋白质保持其正常的生理机制仍然是不解之谜。以往对晶状体的研究往往集中在在单个蛋白质上。但是蛋白质不是孤立的、静止的,它们需要复杂的信号,复杂的蛋白质相互作用网络来适应内部和外部的环境变化。各种高通量蛋白质组技术的出现使获知晶状体蛋白质的完整信息成为可能。液相色谱联合串联质谱法(LC-MS/MS)是高通量蛋白质组学研究的最流行方法之一,特别是LTQ线性离子阱串联质谱仪,它已成为公认的功能强大的质谱仪,具有高的扫描率,高容量和高的离子捕集效率。信息科学已应用于生物学领域,所产生的学科称为生物信息学。生物信息学将生物数据和计算机技术有机地结合起来,这为分析蛋白质组中庞大而复杂数据带来极其便利的条件。因此,近年来,先进的生物信息学工具已经迅速发展成为用于蛋白质组学领域中数据分析的一个重要的助手,其中许多生物信息学工具可通过万维网获得。方法首先将完整的晶状体样品(包括完整的晶状体囊膜)进行预分离来减少样品复杂程度。将晶状体样品加液氮反复研磨成粉末。晶状体粉末中加入Tris-HCL缓冲液50mM(调PH值为7.4),并加入0.01%DTT、广谱蛋白酶抑制剂(ProteaseInhibitor Cocktail Set I,含500uM AEBSF-Hcl;150nM Aprotinin;1uM E-64;0.5MmEDTA Na_2;1uM Leupeptin)匀浆,以30000g离心60min,收集上清液;剩余沉淀仍按上述步骤进行操作,如此反复叁次,合并叁次上清液主要为晶状体水溶性蛋白质成分。剩余的沉淀物将其再溶于裂解缓冲液(7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,50mM Tris-HCL pH 7.4)中,超声匀浆(超声180s),依然按上述方法离心,收集上清液,重复上述步骤叁次,合并叁次上清液主要为晶状体水不溶性蛋白质成分1,剩余沉淀物再溶于4%SDS,3%巯基乙醇,50mM Tris-Cl(pH8.8)的缓冲液中煮沸5分钟,超声匀浆,依然按上述方法离心,收集上清液,重复上述步骤叁次,合并叁次上清液主要为晶状体水不溶性蛋白质成分2,最终将剩余的少量沉淀物弃去。应用BradFord法(使用牛血清白蛋白BSA作为标准蛋白)对晶状体水溶性蛋白质成分、水不溶性蛋白质成分1进行蛋白定量后,加入SDS-PAGE上样缓冲液(50mmol/l Tris-HCl,pH 8.3,2%SDS,5%β-巯基乙醇和5%甘油)95℃加热5min。配置12%SDS-PAGE不连续聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶5%,分离胶12%)初步分离晶状体蛋白质:晶状体水溶性蛋白质成分和晶状体水不溶性蛋白质成分1,每泳道各上样量为15μg。水不溶性蛋白溶液2直接上样。电泳电流30—45mA,电压80—120mV,溴酚蓝到达胶的底端附近(0.5-1cm)停止电泳。采用考马斯亮蓝R-250染色,染色后SDS-PAGE胶图及切胶位点见附图3,将每个条带的胶分别切成约1mm的小块,分别放于微量离心管中(碳酸氢氨:乙腈1:1)脱色,加乙腈使胶块脱水,然后加DTT在56℃下加热30分钟还原样品,再加碘乙酰胺烷基化在暗处30分钟,冻干,加入测序级胰蛋白酶溶液(0.1mg/ml),于37℃水浴酶解16个小时,以叁氟乙酸(TFA)水溶液提取酶解肽段。酶解肽段分别用辅助泵以30μL/min的流速由自动采样器首先进样到300μmi.d.×5mm Zorbax 300SB-C18预柱(Agilent Technologies,Wilmington,DE)上除盐20min,然后切换到75μm i.d.×150mm RP-C18分析柱(毛细管反相柱,ColumnTechnology Inc.)进行线性梯度洗脱,流速设定为2.0μL/min,流动相A液为0.1%甲酸的水溶液,流动相B液为0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84%);0～45分钟,4%～50%B液;45～54分钟,50%～100%B液;54～120分钟,B液维持在100%。分离后的馏分通过ESI源进行LTQ线性离子阱串联质谱分析,ESI源喷雾电压:3.0kV,毛细管温度:160℃,采用正离子模式,离子阱特有的自动增益控制(AGC),可以有效控制阱内离子的数目,MS全扫描A GC设定为3×10~4,MS/MS扫描A GC设定为1×10~4,最高离子累积时间:MS模式为50ms,MS/MS模式为100ms。采用标准化35%的碰撞能量,一次全扫描选定10个最丰富的碎片离子检测。得到的原始数据处理采用TurboSEQUEST算法(存在于BIOWORKS3.1软件包中)搜索相应的人类数据库。除了具有两个或两个以上的独特的肽段被认为是鉴定的结果,具有一个独特的肽段也被认为是鉴定的结果。搜索使用的数据库为IPI HUMAN v3.36蛋白库,采用TurboSEQUEST算法筛选结果,过滤参数为:当肽段所带的Charge为+1,Xcorr≥1.9,当肽段所带Charge为+2,Xcorr≥2.2,当肽段所带Charge为+3,Xcorr≥3.75:DeltCn≥0.1。利用反转库估计蛋白质组数据假阳性率,假阳性率FPR＜0.05。采用基因本体论GO(http://www.geneontology.org)对经鉴定的晶状体蛋白质功能进行分类,晶状体蛋白质在分子功能(Molecular function)、生物过程(Biological process)与细胞组成(Cellular component)叁个部分的功能注释与人体总的蛋白功能注释大背景作(IPI_Human,versions 3.36,50145 protein sequences)比对,使用Gossip软件包来确定鉴定出的蛋白一些功能表达是否独立于人体总的蛋白功能注释大背景之上而为特定组织的功能表达。采用日本京都基因和基因组百科全书KEGG Pathway研究经鉴定的晶状体蛋白质参与的生物学通路。数据库为(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)。采用晶状体蛋白质相互作用的信息是来自人类蛋白质相互作用数据库中实验已验证直接(物理)的相互作用,采用相互作用数据库为BIND(Webpage URL:http://www.bind.ca),BioGRID(Webpage URL:http://www.thebiogrid.org),EcoCyc(Webpage URL:http://www.ecocyc.org),HPRD(Webpage URL:http://www.hprd.org).结果共鉴定出人正常晶状体蛋白质及其亚基939个,具有两个或两个以上的独特的肽段蛋白质及其亚基有214个,具有一个独特的肽段鉴定的蛋白质及其亚基有725个。在鉴定的939个晶状体蛋白质及其亚基中,酶蛋白173个,鉴定出许多参与内源性抗氧化系统的酶类,氧化还原酶类,蛋白激酶类,磷酸酶类,转移酶类,异构酶,水解酶类。许多蛋白亚型如14-3-3蛋白(α/β,γ,η,ε,ζ/δ),过氧化物酶基因(-1,-2,-4,-6),泛素蛋白连接酶(UBR1,UBR2)等被鉴定。本实验鉴定出一些多功能蛋白,如β-连环蛋白,14-3-3蛋白,谷胱甘肽S转移酶,网格蛋白,3-磷酸甘油醛脱氢酶等。本实验鉴定出多种细胞骨架蛋白:肌动蛋白,肌球蛋白,微管蛋白,网格蛋白,钙结合微丝蛋白,中心体肌动蛋白,filensin,phakinin,波形蛋白(vimentin),筑丝蛋白,[肌动蛋白]抑制蛋白,驱动蛋白,动力蛋白激活蛋白,锚蛋白,细丝蛋白,膜联蛋白,膜突蛋白,膜收缩蛋白,冠蛋白,微管相关蛋白,微管蛋白-肌动蛋白交联因子,β-连环蛋白,根蛋白,β-内收蛋白等。分子量和等电点的信息来自蛋白质鉴定结果。分子量在20～40kDa范围内,晶状体蛋白质显示的数量最多,有212个,在40～60kDa范围内显示有189个,在0～20kDa范围内显示有113个;大于60kDa,晶状体蛋白质显示的数量逐渐递减,但在大于220kDa晶状体蛋白质显示的数量又出现一个小高峰,为63个;晶状体蛋白质分子量主要集中在20～60kDa范围内。鉴定出晶状体蛋白质等电点主要分布在5～7之间,为527(56.1%)个,其次8～10之间为295(31.5%)个,等电点在小于4和大于11,晶状体蛋白质亦有分布,为9(0.9%)和1(0.1%)。从SWISS-RPOT数据库中提取了蛋白质定位信息,定位在细胞质上183个,定位在核上118个,定位在细胞膜上48个,定位在细胞上38个,与分泌有关的35个,定位在线粒体18个,定位在内(胞)浆的15个,定位在高尔基体上8个,定位在过氧化物酶体上4个,定位在中心体上2个,定位在溶酶体上1个,定位在空泡上1个,贯穿细胞膜1个,未知228个。鉴定的晶状体蛋白质根据亲水性总平均值(grand average hydrophobicity,GRAVY)确定为亲水性还是疏水性蛋白,GRAVY值根据Kyte和Doolittle方法确定。870(92.7%)晶状体蛋白质GRAVY值为负值,69(7.3%)晶状体蛋白质GRAVY值为正值。GRAVY值为负值通常是亲水性蛋白,GRAVY值为正值通常是疏水性蛋白。鉴定出的晶状体蛋白质有29项功能表达是独立于人体总的蛋白功能注释大背景之上而为特定表达。鉴定出的晶状体蛋白质参与细胞组成显示富集结果有:细胞内,细胞内部件,细胞质,细胞骨架,细胞溶质,细胞外基质,基膜,眼晶状体结构组成。鉴定出的晶状体蛋白质参与分子功能显示富集结果有:蛋白结合功能,结构分子活性。鉴定出的晶状体蛋白质参与生物过程显示富集结果有:分解代谢过程,细胞的分解代谢过程,细胞骨架结构和生物合成,细胞大分子分解代谢过程,碳水化合物代谢过程,乙醇代谢过程,细胞的碳水化合物代谢过程,单糖代谢过程,己糖代谢过程,细胞碳水化合物分解代谢过程,碳水化合物分解代谢过程,葡萄糖代谢过程,单糖分解代谢过程,乙醇分解代谢过程,己糖分解代谢过程,葡萄糖分解代谢过程,糖酵解,肌动蛋白丝长度调节,NADP代谢过程。本次研究数据未显示缺失的注释。经鉴定的晶状体蛋白质参与的生物学通路(KEGG pathway):鉴定的晶状体蛋白质主要参与糖酵解代谢途径、磷酸戊糖代谢途径、果糖-甘露糖代谢途径、谷胱甘肽代谢途径、促分裂原活化蛋白激酶信号传导、磷脂酰肌醇信号系统、泛素介导的蛋白酶体系统和细胞周期。在晶状体蛋白质相互作用网络图中:蛋白质有3个或以上节点的可能是晶状体蛋白质相互作用中重要蛋白,它们是网格蛋白,肌动蛋白,膜收缩蛋白(α,β),波形蛋白,14-3-3 protein(β/α,ζ/A,S,γ,η),TSC2蛋白,层粘连蛋白(γ-1),分裂原活化蛋白激酶,alpha-A-晶状体蛋白,热休克蛋白质(α,β),3-磷酸甘油醛脱氢酶,鸟嘌呤核苷释放蛋白-1,胶原蛋白Ⅳα-2。结论1、将人晶状体样品分为水溶性和水不溶性蛋白质两种组分,减少样品的复杂程度而有利于其在1D SDS-PAGE凝胶的分离而显示出清晰条带,并有助于后续质谱鉴定。2、12%1D SDS-PAGE凝胶电泳对人正常晶状体蛋白质水溶性和水不溶性蛋白分离效果最佳。人正常晶状体中含有大量水溶性蛋白质。3、通过液相色谱-新型线性离子阱串联质谱法对人正常晶状体蛋白质的分离检测,鉴定出大量人正常晶状体内低丰度蛋白、蛋白质亚基和未知蛋白,其中包含许多功能性蛋白,如酶类、多功能蛋白、细胞骨架蛋白等,一些蛋白质及蛋白质亚基为本实验首次从人正常晶状体中得到鉴定,极大丰富了人晶状体蛋白质数据库。1D SDS-PAGE-反相液相色谱-新型的线性离子阱串联质谱法是鉴定人晶状体蛋白质的理想方法。4、应用基因本体论(Gene Ontology,GO)对鉴定出人晶状体蛋白功能分析显示:晶状体结构组成,细胞骨架,细胞质,基膜,蛋白结合功能,结构分子的活性,糖酵解和NADP辅酶代谢等在人正常晶状体突出表现。5、本研究通过KEGG pathway分析发现经鉴定的晶状体蛋白质参与的主要代谢通路为糖酵解代谢途径、磷酸戊糖代谢途径、谷胱甘肽代谢途径、促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇信号系统、泛素介导的蛋白酶体系统、细胞周期等。6、本研究通过构建晶状体蛋白质相互作用网络图发现一些重要的蛋白质,它们是网格蛋白,肌动蛋白,膜收缩蛋白(α,β),波形蛋白,14-3-3蛋白(β/α,ζ/δ,ε,γ,η),TSC2蛋白,层粘蛋白γ-1,有丝分裂原激活蛋白激酶,alpha-A-晶状体蛋白,热休克蛋白(α,β),鸟嘌呤核苷释放蛋白,胶原蛋白Ⅳα和甘油三磷酸脱氢酶。7、基因本体论(Gene Ontology,GO)和KEGG pathway等生物信息学工具有助于人晶状体蛋白质功能、代谢通路、相互作用等全面、快速、准确的分析。
赵晓峰[9]2005年在《局灶性脑缺血模型大鼠脑皮质蛋白质组差异表达图谱构建及针刺影响》文中指出研究意义 脑血管病是导致人类死亡的叁大疾病之一,也是中老年人致残的主要原因,其中缺血性脑血管病占75%-80%,且随着世界人口老龄化进程的加快,其威胁及危害将会越来越严重,因此,对本病病理机制和防治措施的研究受到高度重视。 新近出现的蛋白质组学可以比较不同样品之间蛋白质整体表达水平,是揭示疾病分子机制,发现疾病标志蛋白,寻找新的药物靶标的理想工具,也是生命科学进入后基因组时代的标志之一。大脑中动脉是人类卒中的多发部位,大脑皮质是脑缺血易损伤主要部位之一,但迄今为止尚没有发现针对缺血脑皮质组织进行蛋白质组研究的报道。 由于临床研究的局限性,动物实验成为研究脑血管疾病的重要途径。其中采用线栓法阻断大鼠大脑中动脉(MCAO)建立局灶性脑缺血模型是研究缺血性脑血管病的常用方法,在科研中应用广泛。 石学敏院士经过20余年的艰苦探索,提出中风的病机关键为“窍闭神匿,神不导气”,并针对这一根本病机创立了“醒脑开窍”针刺法,临床治疗数十万例,经对9005例脑中风患者进行总结,痊愈占59.27%;总有效率达98.56%。在基础实验研究方面分别证实了“醒脑开窍”针刺法可改善中风患者的血液流变性、提高SOD活性、抑制MDA含量、抑制钙离子细胞内流、调节中枢神经递质代谢、促进缺血区侧枝循环的建立、对异常的颅底血流动力学具有良性调节作用。 本研究采用蛋白质组学技术对MCAO模型大鼠脑皮质进行研究,旨在发现脑缺血早期相关蛋白,并寻找有效的针刺治疗靶蛋白,进一步揭示该针法的脑保护作用及抗损伤修复机制。 研究方法 健康成年雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、“醒脑开窍”针刺组和传统针刺组,各组又分为6h、24h两个时间段。动物模型参照Longa(1989年)线栓法并加以改进,醒法针刺组选内关、人中穴,传统针刺组选曲池、足叁里穴,均施以电针各10分钟。各组大鼠在规定时间快速断头取脑,提取脑皮质蛋白质,双向电泳展示后,以ImageMaster 2D Elite v3.01软件对2-DE图谱进行分析,寻找差
姚良玉[10]2012年在《生长素和赤霉素诱导棉花纤维起始发育的转录组学和蛋白质组学研究》文中研究说明棉花是世界纺织工业的重要原料,具有重要的经济价值。其发育可以分为起始、延伸、次生壁加厚和成熟四个时期。起始期是决定棉花纤维数量的关键时期,同时这一时期植物激素的调控起到关键作用。因此从转录水平和蛋白质水平同时研究激素对于纤维起始发育的调控对于揭示纤维起始发育的分子机制具有重要意义。本试验以陆地棉徐州142开花前1天胚珠为起始材料,分别将胚珠培养在不加任何激素、添加0.5μMGA3、5μMIAA口0.5μM GA3+5μM IAA的BT液体培养基(Beasley and Ting's Medium)培养1天和3天。以无激素培养胚珠为对照,采用高通量Illumina测序技术进行转录组测序,筛选(p<0.001,|log2Ratio≥1)后共获得显着差异表达基因10,057个。GO功能注释和代谢路径的分析表明,这些差异表达基因参与DNA合成、糖代谢、次生代谢、脂肪酸代谢、叁羧酸循环、糖酵解及碳固定多个代谢途径(p<0.05,q<0.05)。其中,参与植物激素合成和信号转导的候选基因2,330个,占总差异表达基因的23.2%。共有371个差异表达基因参与多个激素合成和信号转导路径。1,670个差异表达基因涉及67个转录因子家族。主要有bHLH家族(103个)、MADS家族(100个)、MYB-related家族(100个)、AP2-EREBP家族(99个)、FAR1家族(85个)、HB家族(76个)、C3H家族(73个)、MYB家族(73个)、WRKY家族(70个)、PHD家族(63个)、NAC家族(59个)、C2H2家族(52个)和AUX/IAA家族(51个)。且各转录因子在不同激素诱导和生长阶段下的响应也是各有不同。同时,Mapman分析发现,在细胞壁合成中差异表达基因包括编码阿拉伯半乳糖、果胶多糖、纤维素、半纤维素合成的重要酶类；在淀粉和蔗糖代谢途径中有蔗糖磷酸合成酶1个、蔗糖转运体2个、UDP-糖基转移酶5个、中性蔗糖酶7个、pfkB型糖激酶家族蛋白3个、已糖激酶1个、1-磷酸葡萄糖磷酸转移酶4个淀粉合酶3个、淀粉分支酶2个、淀粉磷酸化酶2个、淀粉裂解酶4个、淀粉运输1个。采用iTRAQ(isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation)定量蛋白质组学分析技术进行差异蛋白质鉴定,筛选(Ratio>1.3或Ratio<0.7,FDR<0.05)后共获得显着差异表达蛋白1,299个。GO功能注释和代谢路径的分析表明,差异表达蛋白主要参与核糖体组装、氧化磷酸化作用、次生代谢、脂肪酸代谢、叁羧酸循环及碳固定代谢路径(p<0.05,q<0.05)。利用蛋白网络分析软件Pathway studio5.0预测激素诱导下差异表达蛋白间的相互作用,根据构建蛋白相互作用网络调节图发现,激素诱导下差异蛋白间的相互作用主要集中在：蛋白质合成/折迭/分解、RNA生物进程、翻译起始/延伸调控、电子传递、糖酵解、应激反应和运输。通过KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析鉴定细胞骨架蛋白类蛋白15个,其中肌动蛋白3个、肌动蛋白结合蛋白4个、微管蛋白2个、微管蛋白结合蛋白2个、膜联蛋白4个；细胞色素P450类蛋白5个,包括CYP73A家族2个,CYP75B家族2个,CYP98A家族1个；蛋白激酶类蛋白13个,包括5'-AMP活化蛋白激酶-催化α亚基1个、钙依赖型蛋白激酶2个、酪蛋白激酶1个、酪蛋白激酶Ⅱ-α亚基6个、细胞外信号调节激酶1个、丝裂原活化蛋白激酶1个、调节激酶1个。
参考文献：
[1]. 微管相关蛋白1轻链蛋白3家族翻译后修饰方式的研究[D]. 党永军. 复旦大学. 2003
[2]. 大鼠Map1LC3家族两个新基因的克隆及功能初步研究[D]. 吴家雪. 华南热带农业大学. 2003
[3]. 家蚕几种组织的EST及基因表达特征分析[D]. 沈以红. 西南农业大学. 2003
[4]. 狂犬病毒感染的神经细胞差异蛋白质组学研究及伴侣素CCTγ的功能分析[D]. 张金阳. 浙江大学. 2011
[5]. 传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的研究[D]. 王叁应. 浙江大学. 2013
[6]. 人LC3B-β的鉴定及其对LC3B-α的负反馈调节机制[D]. 吴家雪. 复旦大学. 2006
[7]. 卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究[D]. 冯同富. 广西医科大学. 2008
[8]. 人正常晶状体蛋白质表达谱的构建和生物信息学分析[D]. 姚志斌. 中国医科大学. 2009
[9]. 局灶性脑缺血模型大鼠脑皮质蛋白质组差异表达图谱构建及针刺影响[D]. 赵晓峰. 天津中医学院. 2005
[10]. 生长素和赤霉素诱导棉花纤维起始发育的转录组学和蛋白质组学研究[D]. 姚良玉. 南京农业大学. 2012
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