王翔宇[1]2004年在《卵黄免疫球蛋白亲和配基分离蛇毒Gln49-PLA_2的研究》文中进行了进一步梳理免疫亲和层析是一种非常有效的生物大分子纯化方法，特别是应用在纯化过程的第一步。本论文根据卵黄免疫球蛋白(IgY)产量大、易于分离等特点，将其作为免疫亲和配基分离相应抗原。 选用长白山白眉蝮蛇蛇毒中的Gln49磷脂酶A_2(Gln49-PLA_2)为抗原免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，以天数和ELISA数值(OD值表示IgY相对活性)为坐标绘制免疫滴定曲线，结果表明叁次加强免疫后可持续获得抗体，在免疫后51天相对活性达到最高(0.654)，一年后抗体的相对活性维持在0.614，证明特异性抗体的含量至少在一年内基本不变。 几种PEG6000沉淀法粗分IgY的结果显示卵黄液采用PEG6000-乙醇沉淀法，得到的IgY纯度最高，特异活性强，卵磷脂去除较彻底，利于长期保存；用偶联Gln49-PLA_2的Sepharose 4 Fast Flow的亲和介质从卵黄液中一步分离得到特异性抗体，抗体活性提高39倍；以抗GIn49-PLA_2-Sepharose 4 Fast Flow的特异性IgY重复上样，收集相应组分，根据Langmuir-type吸附等温曲线，测定免疫亲和介质的最大载量qm为0.59 mg/mlgel，解离常数K_d为4.4×10~(-5)mg/ml；Western-blot显示抗原与抗体特异性结合。 以抗GIn49-PLA_2特异性IgY为配基偶联到溴化氰活化的Sepharose 4 Fast Flow介质上，一步分离长白山白眉蝮蛇粗毒中的Gln49-PLA_2，所得目的蛋白纯度高达95％，回收率大于83％，产率约为13％，与实验室四步分离Gln49-PLA_2相比，步骤简单，产率提高6.5倍；Anti-Gln49-PLA_2-IgY-Sepharose 4 Fast Flow亲和介质的最大载量qm为0.49mg/ml gel，解离常数K_d为1.66×10~(-7)mg/ml，表明以anti-Gln49-PLA2特异性IgY为配基时不需要苛刻的洗脱条件，是比较理想的生物亲和配基；配基使用60次后，性质仍保持稳定无泄漏情况发生。 以Anti-Gln49-PLA2特异性IgY作为配基纯化大肠杆菌中表达的重组Gln49-PLA2，目的蛋白纯度从4.98％提高到11.5％。
包永明[2]2005年在《白眉蝮蛇新磷脂酶A_2同源物的研究》文中提出长白山白眉蝮蛇(Agkisttvdon blomhoffii ussurensis)属于蝰蛇科蝮蛇亚科白眉蝮乌苏里亚种,俗名目本本蝮蛇(Manushi),主要分布于我国东北部、朝鲜及俄罗斯的部分地区;蛇毒中的磷脂酶A_2同源物(phospholipaseA_2,PLA_2)除了酶活性外,具有多种生物学活性,是蛋白质结构与功能研究的理想天然蛋白。 本研究以小白鼠的腹腔注射给药,无出血致死作为检测指标,采用Hitrap SP阳离子交换、Superdex 75凝胶过滤层析、Source Q阴离子交换层析叁步纯化方法,从长白山白眉蝮蛇蛇毒中纯化神经毒素,得率是3.25%;同时建立的抗毒素特异性IgY配基一步亲和层析纯化神经毒素,得率可达12.9%,是叁步纯化方法的4倍。该蛋白质经变性聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)检测为一条带,与凝胶过滤测定的分子量相符,是单链多肽;质谱检测分子量为13881.854±0.33 Da;等电聚焦测定等电点约为8.56。 通过对分离白眉蝮蛇神经毒素进行的氨基酸组成分析,N-端氨基酸测定,肽质谱指纹图谱分析,结合cDNA序列测定,确定了该毒素的一级结构,具有典型的第二类磷脂酶A2结构特征,第49位是Gln,是PLA_2数据库中一个新的磷脂酶A_2同源物,命名为Gln49-PLA_2,它含有122个氨基酸残基,14个Cys,可能形成7对二硫键,与Asp49-PLA_2s的同源性(93%-61%)高于Lys49-PLA_2s(60%-56%),进化树分析结果表明,Gln49-PLA_2和Asp49-PLA_2s的亲缘关系要近于Lys49-PLA_2s。 Gln49-PLA_2的体外卵磷脂为底物的PLA_2酶活性检测、红细胞的直接和间接溶血活性检测、寓含血小板血浆的抗凝血活性检测,大肠杆菌的抑菌实验,结果表明该蛋白质没有PLA_2活性、溶血活性、抑菌活性,但具有抗凝血作用,浓度高于0.2mg/ml时,随物浓度的增加,复钙时间显着延长;氨基酸序列分析和叁级结构模拟结果表明一级结构氨基酸残基序列的变化,特别是49位Gln残基取代Asp是PLA_2水解活性丧失的主要原因,同时证明抗凝血活性位点与水解活性位点相互独立。
参考文献：
[1]. 卵黄免疫球蛋白亲和配基分离蛇毒Gln49-PLA_2的研究[D]. 王翔宇. 大连理工大学. 2004
[2]. 白眉蝮蛇新磷脂酶A_2同源物的研究[D]. 包永明. 大连理工大学. 2005