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Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统蛋白核酸复合物的表达纯化及功能的初步研究

2020-12-08阅读(778)

Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统蛋白核酸复合物的表达纯化及功能的初步研究

论文摘要

目前已经被开发的基因编辑工具按先后顺序依次为:锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关基因系统（CRISPR-Cas systems）,它们有各自的优缺点及适用范围。其中CRISPRCas9系统因其使用简单便捷、成本低等优势,是当前使用最多的基因编辑工具。但同时它也存在不足之处:其一,适用范围受原间隔邻近基序（PAM）严格限制;其二,脱靶率比较高。所以现在很多学者立志于解决有关这两方面的问题。本课题即针对III-A型CRISPR-Cas系统相关核酸-蛋白复合物进行研究,其优势主要在于它是CRISPR-Cas系统中唯一既能切割DNA又能切割RNA的,并且该系统不受PAM识别范围的限制。该系统是由多个Csm蛋白以及CRISPR RNA（crRNA）组成的复合物,但目前其结构和功能方面的信息还有很多未知。本课题主要利用多种层析方法纯化高纯度野生型Csm-crRNA复合物研究其结构,根据冷冻电镜技术解析出来的结构方面的信息对Cas10蛋白某些位点进行突变。通过纯化突变型Csm-crRNA复合物和转录回收含有部分错配的ssRNA研究复合物的脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶功能及二者之间的关系,期望能为后续研究该系统的功能机制和开发新型CRIPSPR-Cas系统基因编辑工具提供一定的支撑。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 课题研究的背景及意义
  •   1.2 CRISPR-Cas系统研究现状
  •     1.2.1 CRISPR-Cas系统的发现
  •     1.2.2 CRISPR-Cas系统的作用机制
  •   1.3 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统的研究现状
  •     1.3.1 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统的分类与功能
  •     1.3.2 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统的组成
  •     1.3.3 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统效应复合物的核糖核酸酶活性
  •     1.3.4 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统效应复合物的脱氧核糖核酸酶活性
  •     1.3.5 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统中两种酶活性的协调机制
  •     1.3.6 Ⅲ型 CRISPR-Cas系统区分自我和非我的方式
  •   1.4 Ⅲ-A型 CRISPR-Cas系统的研究现状
  •   1.5 主要研究内容
  • 第2章 实验试剂与方法
  •   2.1 实验材料
  •   2.2 实验试剂
  •   2.3 实验仪器
  •   2.4 实验方法
  •     2.4.1 表达载体的获得
  •     2.4.2 目的Csm-crRNA复合物的表达
  •     2.4.3 目的Csm-crRNA复合物的纯化
  •     2.4.4 野生型Csm-crRNA复合物晶体筛选
  •     2.4.5 野生型Csm-crRNA复合物透射电镜负染制样
  •     2.4.6 T7 RNA聚合酶的纯化
  •     2.4.7 底物ssRNA的转录及回收
  •     2.4.8 底物ssDNA的获得
  •     2.4.9 Csm-crRNA复合物功能的研究
  • 第3章 Csm-crRNA复合物的表达及纯化
  •   3.1 引言
  •   3.2 表达载体的获得
  •     3.2.1 野生型表达载体的获得
  •     3.2.2 突变型表达载体的获得
  •   3.3 Csm-crRNA复合物的表达
  •   3.4 Csm-crRNA复合物的纯化
  •     3.4.1 野生型Csm-crRNA复合物的纯化
  •     3.4.2 突变型Csm-crRNA复合物的纯化
  •   3.5 本章小结
  • 第4章 Csm-crRNA复合物的核酸酶功能研究
  •   4.1 引言
  •   4.2 Csm-crRNA复合物核糖核酸酶的功能研究
  •   4.3 Csm-crRNA复合物脱氧核糖核酸酶的功能研究
  •     4.3.1 利用点突变的Cas10 蛋白亚基进行研究
  •     4.3.2 利用含有两个核糖核苷酸错配的ssRNA进行研究
  •   4.4 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 唐子云

    导师: 黄志伟

    关键词: 型系统,复合物,脱氧核糖核酸酶功能,核糖核酸酶功能

    来源: 哈尔滨工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 哈尔滨工业大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.003601

    总页数: 67

    文件大小: 1997K

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