导读:本文包含了桔青霉论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:核酸酶P1,黑曲霉,SYBR,Green实时荧光定量PCR,拷贝数
桔青霉论文文献综述
陈筱仪,王斌,潘力[1]（2019）在《18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析》一文中研究指出本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。(本文来源于《现代食品科技》期刊2019年06期）
陈筱仪[2]（2019）在《桔青霉来源的核酸酶P1在黑曲霉系统中的重组表达研究》一文中研究指出来源于桔青霉的核酸酶P1隶属于核酸酶S1/P1家族,其家族成员中的核酸酶P1和核酸酶S1均是单链特异性核酸酶,能够催化单链DNA或RNA生成核苷酸,生成的5’-核苷酸及其衍生物广泛应用于制药、食品和核酸结构的研究中。在生物制药方面,其可用于制造各种生化药物。在食品保健方面,在酵母自溶过程中添加核酸酶P1促进RNA转变为5’-GMP及5’-AMP的速率,这两种物质是制作各种食品调味剂的原料。在核酸研究方面,核酸酶P1的主要功能有促进核酸结构的研究和碱基组成的分析。目前国内核酸酶P1供不应求,核酸酶P1的生产菌主要为桔青霉,而桔青霉生产的核酸酶P1具有纯度不高,杂蛋白过多且有毒素掺杂影响后续的分离纯化等问题。核酸酶P1异源表达的宿主有大肠杆菌和酵母细胞,表达的核酸酶P1活力较低。而本研究在黑曲霉中实现了核酸酶P1的高效重组表达,并将其应用于核苷酸的生产中。本文以一株低蛋白背景的无孢黑曲霉Bdel4(LB3ang02D4,在黑曲霉SH-2菌株基础上敲除了糖化酶glaA、淀粉酶aamA、An05g02100和An12g06930)为宿主菌,构建了不同表达策略的核酸酶P1的黑曲霉表达质粒,转化黑曲霉筛选出了一株核酸酶P1表达最优的转化子,发酵酶液经His亲和层析纯化后,进行了核酸酶P1酶学性质的研究,并探索了其在核苷酸的生产中的应用。主要研究的内容如下:(1)根据Uniprot公布的NP1的蛋白序列,经过密码子优化后人工合成Nuc P1基因。将6xHis标签加在Nuc P1基因的C末端,以用于后续的His亲和层析获得核酸酶P1的纯酶液。构建采用Kexlinker(糖化酶自带的信号肽切割位点)、2A肽、融合蛋白等不同表达策略的核酸酶P1的表达框,基于同源重组原理定点整合核酸酶P1的表达框到黑曲霉基因组糖化酶glaA基因位置、18S rDNA和28S rDNA的多拷贝位置,通过测定转化株的酶活水平筛选出酶活最高的一株黑曲霉转化株Bpnu-18S-2,其发酵至144 h时酶活达到89.2 U/mL。(2)通过His亲和层析纯化重组核酸酶P1菌株产生的发酵液,纯化后核酸酶P1的分子量大小为38kDa,之后用糖苷酶PNGase F去糖基化后得到核酸酶P1大小为30 kDa,与PDB数据库预测的核酸酶P1分子量一致。基于纯化所得的核酸酶P1研究其酶学性质,测定得到重组核酸酶P1反应最适pH为5.3,最适温度为65°C,加入2 mmol/L的Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)能够提高核酸酶P1的酶活,同时也显着提高了核酸酶P1的耐热性,Ni~+约降低20%酶活力,但却能提高核酸酶P1的耐热性,K~+、EDTA使核酸酶P1的酶活力约降低40%。将黑曲霉转化株Bpnu-18S-2的发酵上清液加入酵母自溶体系中以提高核苷酸的产量,添加75 U的核酸酶P1可生产出14.13 mg/mL的核苷酸,比不添加核酸酶P1时产生的单位核苷酸的产量提高了4.51 mg/mL。(本文来源于《华南理工大学》期刊2019-04-23）
倪赛,刘银春,李健,李肖鹤,朱向东[3]（2019）在《响应面法优化桔青霉PA-33菌株的发酵工艺》一文中研究指出【目的】优化桔青霉Penicillium citrinum PA-33发酵培养基和发酵条件,以提高桔青霉PA-33的抗菌活性。【方法】采用单因素试验确定桔青霉PA-33发酵所需最适基础培养基、碳氮源和无机盐,并利用响应面法设计确定最适发酵培养基配方;在发酵条件单因素试验基础上,采用叁元二次通用旋转组合设计和频率分析法优化其最适发酵条件组合。【结果】经优化后,最佳发酵培养基配方为马铃薯汁液219.91 g·L-1、甘露醇34.11 g·L-1、黄豆粉6.25 g·L-1;最适发酵条件为装液量50 mL、接种量3.5%(φ)、发酵温度28℃,摇床转速150 r·min-1、发酵时间12 d。优化后发酵液对大肠埃希菌Escherichia coli的抑菌圈直径为28.99 mm,较优化前抑菌圈直径(18.73 mm)增加了10.26 mm。【结论】采用响应面法、叁元二次通用旋转组合设计和频率分析法优化发酵工艺,显着提高了桔青霉PA-33发酵液的抗菌活性,为该菌株的抗菌活性物质的分离以及工业化生产提供依据。(本文来源于《华南农业大学学报》期刊2019年02期）
倪赛,刘银春,李健,李肖鹤,朱向东[4]（2018）在《具广谱抗菌活性桔青霉PA-33的诱变育种》一文中研究指出为增强产抗生素桔青霉(Penicillium citrinum) PA-33的抗菌活性,提高所产抗生素的产量。以桔青霉PA-33菌株为出发菌株,以大肠杆菌为指示菌,分别采用紫外诱变、紫外-Li Cl诱变、紫外-亚硝酸复合诱变、微波诱变以及微波-超声波-3%硫酸二乙酯(diethyl sulfate,简称DES)复合诱变等技术对桔青霉PA-33菌株孢子悬液进行诱变,筛选出抗菌活性增强的突变菌株,并测定突变菌株的遗传稳定性。筛选得到5株高产抗生素突变菌株Li-1、N-25、H-14、WB-6、D-11,它们的抗菌活性提高率分别为39. 51%、39. 19%、40. 26%、32. 29%、20. 83%;其中突变菌株Li-1、H-14、N-25遗传稳定性较好,突变菌株WB-6、D-11遗传稳定性相对较差。桔青霉PA-33诱变育种效果明显,抗菌活性明显增强,能为其进一步工业化应用提供基础和依据。(本文来源于《江苏农业科学》期刊2018年20期）
郑美娟,郭金玲,田毅红,雷生姣,吕育财[5]（2018）在《桔青霉产核酸酶P1菌种高效选育方法研究》一文中研究指出为了提高产核酸酶P1菌种的筛选效率,研究了甲苯胺蓝-RNA(TB-RNA)平板筛选方法 ,考察了溶剂体系、甲苯胺蓝浓度、底物RNA浓度等对TB-RNA平板上核酸酶P1酶解圈的影响。结果表明,在甲苯胺蓝浓度为2.0×10~(-4)mol·L~(-1)、底物RNA浓度为0.1%时,于超滤水体系中29℃恒温培养,紫外诱变12h,核酸酶P1的酶活与酶解圈直径呈正相关关系。以酶解圈与菌落直径比1.71为指标,从116株诱变菌株中筛选出10株菌株;经过后期发酵验证,选育出6株优势菌株;通过发酵及遗传稳定性考察,6#菌株的酶活最高,为390U·mL~(-1),比原始菌株提高了29%。为工业化生产快速选育菌株提供了高效方法。(本文来源于《化学与生物工程》期刊2018年02期）
黄浦,肖瑜,刘以清,覃妍,陈菊清[6]（2016）在《桔青霉降解茶皂素的实验研究》一文中研究指出茶皂素是油茶饼粕中重要的组成成分,是影响油茶粕作为饲料利用的主要原因。为了得到桔青霉降解茶皂素的最佳发酵条件,对发酵前后产物进行了研究,以茶皂素(tea saponin)标准品为原料,以茶皂素降解率为指标,利用桔青霉液态发酵降解茶皂素。通过对培养时间、培养温度、摇床转速、接种量等单因素的研究,确定其最佳的发酵条件为:发酵时间13 d,发酵温度31℃,转速150 r/min,接种量6 m L,在此条件下,茶皂素的降解率达到了36.71%,并用GC-MS对发酵前后产物进行了分析。(本文来源于《桂林理工大学学报》期刊2016年03期）
金航[7]（2015）在《金属离子胁迫海洋真菌桔青霉合成多样性次生代谢产物的研究》一文中研究指出从我国东海海水和海泥中分离到6株霉菌,对获得的菌株进行了抗肿瘤细胞活性的筛选,选择了一株抗肿瘤活性较好的菌株,对其进行金属离子胁迫培养,分析胁迫培养下其代谢产物的多样性,在对胁迫培养条件下新合成的次生代谢产物进行分离纯化,利用核磁共振法对它们的结构进行鉴定,最后对分离得到的单体化合物做抗肿瘤活性评价,得到结果如下:(1)采用稀释平板分离法,从我国东海海域的海水和海泥样品分离到5株菌落形态有明显差别的海洋真菌。利用体外抗肿瘤模型对上述5株霉菌和1株实验前期研究分离的桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101进行活性筛选,结果表明:桔青霉菌株MNP12010101发酵总浸膏对人肺腺癌细胞(A549)有较好的抑制活性,200μg·mL-1浓度时对A549的抑制率为55.37%,IC50为141.12μg·mL-1,其次是菌株JHBL-1,其发酵浸膏在200μg·mL-1时,对A549的抑制率为33.46%。依据形态学特征和18S rDNA序列分析,确定JHBL-1菌株是一株毛霉(Mucor sp.)。(2)对桔青霉MNP12010101进行金属离子胁迫培养,采用HPLC指纹图谱法分析代谢产物的多样性,结果表明:在人工海水培养基中,添加10 mmoL·L-1的Co2+胁迫培养后,MNP12010101菌株的代谢产物种类与常规培养产物差异较大,有较多的新化合物出现,且活性检测结果显示其总浸膏抗肿瘤活性明显增强,IC50值由胁迫前的141.12μg·mL-1降低至61.23μg·mL-1,说明桔青霉MNP1201010在10 mmol·mL-1Co2+的胁迫培养下,原有的活性代谢产物的浓度提高,或合成了新的活性代谢产物。(3)对桔青霉MNP12010101进行大批量培养,获得80 L培养液,制备得到发酵液和菌体混合总浸膏16 g。通过柱层析方法分离出11个化合物,经过核磁共振分析,确定了其中7个化合物的结构,它们分别为:十八烯酸(1)、cladospolide E(2)、过氧麦角甾醇(3)、环(甘-脯)二肽(4)、环(丙-脯)二肽(5)、环(异亮-脯)二肽(6)和环(丙-缬)二肽(7)。化合物3,4,5,6,7首次从桔青霉中分离得到。抗肿瘤活性研究表明:化合物3具有较好的抗肿瘤活性,其对人前列腺癌(PC-3)细胞的IC50值为33.12μg·mL-1,化合物2和4具有弱的抗肿瘤活性,它们对PC-3肿瘤细胞的IC50值分别为199.34μg·mL-1和146.22μg·mL-1;对A549肿瘤细胞的IC50值分别为256.22μg·mL-1和178.56μg·mL-1。所有化合物均未发现对人结肠癌细胞(HCT116)细胞有抑制作用。除化合物3外,其他化合物对PC-3,A549和HCT116肿瘤细胞的活性的报道也属首次。(本文来源于《浙江工业大学》期刊2015-04-01）
文超[8]（2014）在《海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分离纯化与特性研究》一文中研究指出植物致病真菌是造成主要粮食和经济作物减产的头号杀手,目前大量使用的化学农药已经对环境和人类健康造成了巨大的负面影响。同时开发新型化学农药的高成本及耐药微生物的迅速出现等因素,引起我们对生物农药的关注。其中,抗真菌蛋白因其来源广泛及其独特的作用机制,为新型抗真菌活性物质的研究提供了重要信息,并成为了研究热点。此外,陆地生物资源已被大量开发,发现新型抗菌物质的可能性不断下降,迫切需要寻找新的来源。海洋提供了非常特殊的生态环境,使海洋微生物能够进化出特殊的代谢途径,产生更多新型的抗菌活性物质,将在植物病原菌治理及活性物质开发方面发挥重要作用,因此,从海洋微生物中分离抗真菌蛋白具有重要的研究意义。为了从海洋中寻找具有高效抗菌活性的天然产物,本研究首先采用平板稀释法和平板扩散法从深海中筛选活性菌株。通过使用不同配方的培养基,对采集自各种海洋环境(大洋、北极和南极)的深海样品进行微生物菌株的分离筛选,筛选到了300余株真菌以及大量的细菌,其中包括了许多具有抗菌活性的微生物。接着以7株植物病原真菌和7株致病细菌为指示菌进一步筛选并鉴定出具有高效抗菌活性的菌株,植物病原真菌包括宛氏拟青霉、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、绿色木霉、立枯丝核菌、长柄链格孢和核盘菌,致病细菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气假单胞菌和黄单胞菌。本研究共分离到57株具有抗植物病原菌活性的菌株,包括53株活性真菌和4株细菌,分别鉴定种属并统计活性情况和样品来源,为研究海洋抗菌微生物资源以及开发新型抗菌活性物质奠定了良好的基础。更重要的是,本研究从西南印度洋底泥样品中分离并鉴定出一株桔青霉,命名为W1。该菌株的发酵上清对多株植物病原菌具有拮抗活性,并通过采用盐析、透析、冻干、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、超滤浓缩等方法,最终从海洋桔青霉W1发酵液上清中分离纯化到一种抗真菌蛋白,将它命名为PcPAF。 SDS-PAGE电泳结果表明,PcPAF的分子量大小约为10kDa。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定以及N端测序分析该蛋白的序列,根据分析结果判断PcPAF可能为一种新的抗真菌蛋白,并检测了该抗真菌蛋白的理化性质。结果表明PcPAF对4株植物病原菌真菌,绿色木霉、宛氏拟青霉、长柄链格孢和胶孢炭疽菌具有较强的抑制活性,纸片法检测PcPAF对绿色木霉、尖孢镰刀菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢的最低抑制浓度分别为1.52μg/disc、6.08μg/disc、3.04μg/disc和6.08μg/disc.PcPAF在80℃条件下处理20min其活性不受影响；能够耐受多种金属离子处理,经过20mM的Mn2+处理后,能保持75%的抗菌活性；可以耐受酸性环境,并在弱酸环境中显示出最好的抗菌活性；此外,PcPAF对紫外辐射,多种有机溶剂、表面活性剂以及蛋白酶都有较好的耐受能力,在一般条件下都能保持较好的抗菌活性。PcPAF与已经报道的真菌来源的抗真菌蛋白在序列和性质上都存在一定差异,可能是一种新的真菌来源的抗真菌蛋白。通过在发酵培养基中加入甘氨酸能够明显挺高海洋桔青霉W1发酵上清的抗菌活性,抗菌活性提高约62%。此外,PcPAF在盆栽试验中都表现出较好的抗病效果,其中对小麦赤霉病的防效达到了52%。总之,本研究发现了一种抗真菌蛋白并命名为PcPAF,该蛋白具有较好的抗真菌活性和较广泛的抗菌谱,对外界环境具有较好的耐受力,通过添加营养源提高了发酵产物的抗菌活性,并在实际应用中具有一定的抗病效果,具有作为生物农药的潜在能力,为抗真菌蛋白PcPAF在作物抗真菌感染方面的应用奠定了基础。(本文来源于《厦门大学》期刊2014-04-01）
宋璨,周峰,胡昌华[9]（2013）在《美伐他汀产生菌桔青霉表观遗传调控基因RpdA的克隆及生物信息学解析》一文中研究指出为从表观遗传调控的角度对美伐他汀产生菌桔青霉进行分子操作和遗传育种,克隆桔青霉表观遗传调控基因组蛋白去乙酰化酶基因RpdA,对多种真菌的组蛋白去乙酰化酶编码基因序列比较分析,设计简并引物,以桔青霉cDNA和DNA为模板,结合3-race技术,克隆获取RpdA基因的全长序列,并对其蛋白结构进行生物信息学分析.研究发现:RpdA基因长2 072bp(GenBank登录号:KC417298),含4个外显子和3个内含子,cDNA开放阅读框长为1 092bp(GenBank登录号:KC417296),编码639个氨基酸,蛋白结构显示了较为保守的组蛋白去乙酰化酶ClassI家族结构特征.(本文来源于《西南大学学报(自然科学版)》期刊2013年06期）
宋璨[10]（2013）在《桔青霉组蛋白去乙酰化酶基因Pci-RpdA和Pci-HdaA的克隆表达及特征分析》一文中研究指出背景：丝状真菌产生的次生代谢产物是新药的重要来源之一,很多有重要应用价值的抗生素、免疫抑制剂、抗癌药物等都是由真菌产生。其中,由桔青霉产生的聚酮类化合物美伐他汀是第一个被发现的他汀类化合物,它是HMG-CoA还原酶的有效的竞争抑制剂,从而抑制胆固醇的生物合成。美伐他汀通常作为微生物转化的底物,进一步合成普伐他汀,普伐他汀主要用于治疗高胆固醇血症,具有广泛的市场前景与消费需求。由于他汀类药物对人类经济和健康的巨大影响,桔青霉作为重要药用微生物资源,其代谢产物及其代谢调控机制被广泛研究。真菌的次生代谢是一个复杂的多层次调控过程。次生代谢产物的生物合成不仅受到途径特异转录因子的调控,还受到全局性调控因子的调控。近年来对一些真菌物种进行的研究结果显示,染色体的表观遗传状态也直接调控真菌次生代谢相关基因簇的表达。染色体的表观遗传状态又被称为染色体异构现象,受到“组蛋白密码”操控,包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等。其中,组蛋白氨基酸末端的乙酰化与去乙酰化作为基因活化和抑制过程中的主要调控机制,成为表观遗传学的研究热点之一。乙酰化和去乙酰化分别由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶进行可逆修饰,两类酶是组蛋白乙酰化和转录活性的调节者。组蛋白去乙酰化酶能够将染色体上的乙酰化位点去除,从而改变染色体的表观遗传状态,调控次生代谢产物基因簇的表达。近年以组蛋白去乙酰化酶为靶点的微生物育种和微生物沉默基因挖掘引起了科学家的关注：通过使用小分子表观遗传抑制剂对真菌中组蛋白去乙酰化酶活性进行抑制,或者在基因水平上对真菌组蛋白去乙酰化酶编码基因进行分子操作(如基因敲除),真菌的次生代谢行为发生明显变化,多种已知次生代谢产物表达得以提高,甚至激活了基因组中的沉默基因,使真菌产生了新的化合物,为发现新的具有药学研究价值的先导化合物提供物质基础。目的：本实验选取桔青霉野生菌株ATCC38065,从ATCC38065中克隆得到两个分属不同分类家族的组蛋白去乙酰化酶编码基因Pci-RpdA和Pci-HdaA,并对其进行了体外表达的初探和生物信息学解析,为从表观遗传调控的角度对桔青霉进行分子操作提供候选基因和作用靶点,以期提高其主要代谢产物产量或激活沉默基因；检测Pci-RpdA和Pci-HdaA两个基因在不同发酵时期的相对表达情况,从而揭示两基因的转录表达特征,为研究其功能奠定基础；比较组蛋白去乙酰化酶编码基因在美伐他汀高产工业菌株IMB002中的序列差异,推断由序列差异所引起的酶蛋白高级结构的差异。方法：本实验通过对多个真菌物种的组蛋白去乙酰化酶编码基因序列进行比较分析,设计简并引物,以桔青霉cDNA和DNA为模板,结合3'-race技术及套式PCR方法,克隆获取Pci-RpdA和Pci-HdaA的全长DNA序列和全长cDNA序列,使用大肠杆菌表达系统对编码基因进行体外表达,并通过在线分析工具及生物软件进行蛋白结构分析；采用实时荧光定量PCR检测Pci-RpdA和Pci-HdaA两基因在桔青霉野生菌株ATCC38065发酵过程中的转录表达特征；克隆工业菌株IMB002中Pci-RpdA和Pci-HdaA两基因DNA和cDNA全长序列,使用序列分析软件对两基因的核酸序列和蛋白产物进行序列对比与差异分析。结果：本文成功从桔青霉野生菌株ATCC38065中克隆得到与Rpd3同源基因Pci-RpdA和与Hdal的同源基因Pci-HdaA。Pci-RpdA基因长2072bp,含4个外显子和3个内含子,cDNA开放阅读框长为1092bp,理论分子量为71.12kDa,预测等电点为4.61,编码639个氨基酸,与产黄青霉中Rpd3在蛋白水平的一致性达95%,蛋白结构显示了较为保守的组蛋白去乙酰化酶ClassⅠ家族结构特征；Pci-HdaA基因长3053bp,含15个外显子和14个内含子,cDNA开放阅读框长为2295bp,理论分子量为84.80kDa,预测等电点为5.38,编码764个氨基酸,与产黄青霉中Hdal在蛋白水平的一致性达89%,蛋白结构显示了较为保守的组蛋白去乙酰化酶ClassⅡ家族结构特征。成功构建基于pET-28(+)的Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的体外重组表达载体pET-28(+)-RpdA和pET-28(+)-HdaA。初步探讨了重组RpdA和重组HdaA在大肠杆菌中的表达形式,并成功纯化出重组RpdA蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,在桔青霉野生菌株发酵的不同阶段,Pci-RpdA基因的转录水平具有显着性差异,特别是在发酵前期转录水平相对较高,而在发酵中后期转录水平相对下调；基因Pci-HdaA在不同的发酵阶段转录水平也具有显着性差异,在发酵中后期基因处于相对较高转录水平,而在发酵前期基因的转录水平相对较低。两基因在野生菌株ATCC38065和工业菌株IMB002中序列差异分析显示,由于Pci-RpdA基因序列在第170位和1786位核酸序列的突变,使得桔青霉野生菌株ATCC38065中第57位精氨酸和第596位脯氨酸,在桔青霉工业菌株IMB002中分别突变成了赖氨酸和丝氨酸。将两株菌中的Pci-RpdA进行二级结构预测,发现由于57位氨基酸的突变,在野生菌株ATCC38065中Pci-RpdA蛋白的第59-60位氨基酸残基所形成的卷曲结构,在IMB002菌株中形成了一个小的B-折迭结构；596位氨基酸的突变,对蛋白二级结构没有造成影响。由于基因序列在第718位和1141位核酸序列的突变,使得桔青霉野生菌株ATCC38065中第240位缬氨酸残基和第381位丙氨酸残基,在工业型菌株IMB002分别突变成了异亮氨酸和苏氨酸。240位氨基酸的突变,对蛋白二级结构没有造成影响。由于381位氨基酸的突变,在野生菌种ATCC38065中Pci-HdaA蛋白的第366-380位氨基酸残基所形成的α-螺旋结构,在IMB002菌株中缩短至366-377位。结论：克隆了桔青霉的组蛋白去乙酰化酶基因Pci-RpdA和Pci-HdaA,为后续对桔青霉进行表观遗传育种奠定基础。得到了在大肠杆菌中重组表达的RpdA蛋白,为后续酶活表征该蛋白提供物质基础。详细了解了Pci-RpaA和与Pci-HdaA及其编码产物的结构特征,发现了Pci-RpdA在发酵前期相对高表达、Pci-HdaA在发酵中后期相对高表达的重要特征,为进一步研究两基因的功能提供理论依据。比较了两基因在野生菌株和工业菌株中的序列差异,为探讨组蛋白去乙酰化酶与菌株高产代谢产物的相关性提供研究线索,也为揭示真核生物中复杂的表观遗传调控机制提供研究素材。(本文来源于《西南大学》期刊2013-05-12）
桔青霉论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
来源于桔青霉的核酸酶P1隶属于核酸酶S1/P1家族,其家族成员中的核酸酶P1和核酸酶S1均是单链特异性核酸酶,能够催化单链DNA或RNA生成核苷酸,生成的5’-核苷酸及其衍生物广泛应用于制药、食品和核酸结构的研究中。在生物制药方面,其可用于制造各种生化药物。在食品保健方面,在酵母自溶过程中添加核酸酶P1促进RNA转变为5’-GMP及5’-AMP的速率,这两种物质是制作各种食品调味剂的原料。在核酸研究方面,核酸酶P1的主要功能有促进核酸结构的研究和碱基组成的分析。目前国内核酸酶P1供不应求,核酸酶P1的生产菌主要为桔青霉,而桔青霉生产的核酸酶P1具有纯度不高,杂蛋白过多且有毒素掺杂影响后续的分离纯化等问题。核酸酶P1异源表达的宿主有大肠杆菌和酵母细胞,表达的核酸酶P1活力较低。而本研究在黑曲霉中实现了核酸酶P1的高效重组表达,并将其应用于核苷酸的生产中。本文以一株低蛋白背景的无孢黑曲霉Bdel4(LB3ang02D4,在黑曲霉SH-2菌株基础上敲除了糖化酶glaA、淀粉酶aamA、An05g02100和An12g06930)为宿主菌,构建了不同表达策略的核酸酶P1的黑曲霉表达质粒,转化黑曲霉筛选出了一株核酸酶P1表达最优的转化子,发酵酶液经His亲和层析纯化后,进行了核酸酶P1酶学性质的研究,并探索了其在核苷酸的生产中的应用。主要研究的内容如下:(1)根据Uniprot公布的NP1的蛋白序列,经过密码子优化后人工合成Nuc P1基因。将6xHis标签加在Nuc P1基因的C末端,以用于后续的His亲和层析获得核酸酶P1的纯酶液。构建采用Kexlinker(糖化酶自带的信号肽切割位点)、2A肽、融合蛋白等不同表达策略的核酸酶P1的表达框,基于同源重组原理定点整合核酸酶P1的表达框到黑曲霉基因组糖化酶glaA基因位置、18S rDNA和28S rDNA的多拷贝位置,通过测定转化株的酶活水平筛选出酶活最高的一株黑曲霉转化株Bpnu-18S-2,其发酵至144 h时酶活达到89.2 U/mL。(2)通过His亲和层析纯化重组核酸酶P1菌株产生的发酵液,纯化后核酸酶P1的分子量大小为38kDa,之后用糖苷酶PNGase F去糖基化后得到核酸酶P1大小为30 kDa,与PDB数据库预测的核酸酶P1分子量一致。基于纯化所得的核酸酶P1研究其酶学性质,测定得到重组核酸酶P1反应最适pH为5.3,最适温度为65°C,加入2 mmol/L的Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)能够提高核酸酶P1的酶活,同时也显着提高了核酸酶P1的耐热性,Ni~+约降低20%酶活力,但却能提高核酸酶P1的耐热性,K~+、EDTA使核酸酶P1的酶活力约降低40%。将黑曲霉转化株Bpnu-18S-2的发酵上清液加入酵母自溶体系中以提高核苷酸的产量,添加75 U的核酸酶P1可生产出14.13 mg/mL的核苷酸,比不添加核酸酶P1时产生的单位核苷酸的产量提高了4.51 mg/mL。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
桔青霉论文参考文献
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标签：核酸酶P1; 黑曲霉; SYBR; Green实时荧光定量PCR; 拷贝数;