唾液乳杆菌膜外蛋白间接促进金葡菌黏附机制及效应蛋白的表达

论文摘要

目前,食源性致病菌依然是危害公共卫生的一大因素,已经引起社会各界的广泛重视,金葡菌就是最为常见的食源性致病菌之一。黏附是宿主中致病菌定植和感染的第一步,被认为是重要的威胁因素之一。通常认为益生菌可以通过空间位阻抑制致病菌的黏附并减少其在体内的积累。然而,有研究表明,一些乳杆菌能促进致病菌黏附,有人认为这可能是因为益生菌一方面与肠道黏附,另一方面与致病菌黏附,但具体机制尚不清楚。因此本研究采用前期筛选的益生性唾液乳杆菌与金葡菌为研究对象,试图从膜外蛋白角度研究益生菌是否通过膜外蛋白促进金葡菌黏附。首先我们研究了唾液乳杆菌与金葡菌的直接黏附效果。将菌株分别离心稀释,唾液乳杆菌与金葡菌共同作用4小时后,通过显微镜观察了唾液乳杆菌与金葡菌是否直接黏附,进一步提取唾液乳杆菌膜外蛋白,通过电镜和蛋白包被法研究其与金葡菌黏附效果。培养Caco-2细胞,通过结晶紫染色和涂板计数两种方法验证膜外蛋白是否间接促进金葡菌对细胞的黏附作用。为了分析基于唾液乳杆菌膜外蛋白促进金葡菌黏附的分子机制,通过前期质谱结果选取评分最高的细菌底物结合蛋白ABC transporter substrate-binding protein进行基因克隆与表达,采用Ni柱法进行目的蛋白纯化。采用包被法验证纯化的蛋白对金葡菌的黏附性。再培养Caco-2细胞,通过涂板计数法验证纯化蛋白是否间接促进金葡菌对细胞的黏附。最后控制温度,pH值的不同,研究纯化蛋白与金葡菌黏附的影响因素。结果显示,通过显微镜观察证明唾液乳杆菌与金葡菌存在共聚集,在电镜下观察到去除膜外蛋白的唾液乳杆菌黏附金葡菌数量减少,重新加入膜外蛋白后,金葡菌黏附数量增多,证明起到黏附的主要作用是膜外蛋白。将金葡菌接种于包被膜外蛋白的96孔板中,金葡菌黏附数量增加。细胞试验表明,在Caco-2细胞中先加入唾液乳杆菌膜外蛋白,金葡菌的黏附性提高了20%。试验进一步表达并纯化了ABC transporter substrate-binding protein,纯化后的蛋白大小为30 kDa。在蛋白包被法与细胞试验中,纯化的蛋白增加金葡菌黏附值分别为40%和26.7%。当温度在37℃时,纯化蛋白促进金葡菌的黏附作用最强。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王迪

导师: 任大勇

关键词: 唾液乳杆菌,膜外蛋白,金葡菌,黏附

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 吉林农业大学

基金: 唾液乳杆菌表面S-层蛋白介导的黏附及免疫调节分子机制研究,国家自然科学基金青年科学基金项目(31401475)

分类号: TS201.3

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000482

总页数: 59

文件大小: 3225K

下载量: 33

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