姜伯乐[1]2004年在《野油菜黄单胞菌hrp基因簇的功能鉴定和表达调控分析》文中进行了进一步梳理野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(TTSS)在动植物病原细菌和寄主互作过程中起着极其重要的作用。尽管组装TTSS的蛋白保守性很高，每一种病原菌仍有一些Ⅲ型蛋白同源性不高。为研究野油菜黄单胞菌野油菜致病变种hrp基因编码的蛋白的功能，用转座子Tn5gusA5诱变其野生型菌株Xcc 8004，获得一系列hrp基因的Tn5插入突变体，对这些突变体的致病性、胞外酶、胞外多糖产量等表型进行检测。研究发现，hrp或hrc基因的任一突变，致病性都完全或大部分上丧失，而hpa基因突变体致病性不受影响。利用同源标记置换构建了整个hrp基因簇(约23kb)的缺失突变体Xcc 8004△27，利用自杀质粒pT18mob作为同源单交换整合质粒，对Xcc 8004△27的hrpG进行了突变。研究发现，不含hrp基因簇的8004△27仍然具有部分致病性，但将其hrpG突变后致病性完全丧失。推测hrp基因簇内存在抑制另一致病系统的基因。为研究hrp基因簇的调控，构建了hrp基因Tn5正向插入突变体的hrpG双突变体，在植物诱导培养基XVM2上检测hrpG突变前后GUS酶活变化。研究发现，Xcc 8004的hpa2、hrpB1、hrcV、hrpD6、hrpE、conserved hypothetical genes、hrpF以及hrpX等hrp基因受hrpG基因调控。
韦珂[2]2005年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病相关基因的鉴定及分析》文中研究表明野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris;简称Xcc)是十字花科植物重要的病原细菌,能广泛的引起十字花科作物的黑腐病。Xcc侵染寄主植物的过程是非常复杂的,一般经过吸附-识别-侵入-繁殖-定殖-扩展-显症7个过程,而且每一个过程都有相应的基因参与;Daniels预测大约有20～100个基因参与Xcc的致病过程,而目前已经实验证实的致病相关基因大约有60多个。可是根据野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株基因组数据,预测的致病相关基因有250多个。由此可见在该病原菌中,尚有许多未知的致病相关基因有待人们去鉴定。目前,寻找致病相关新基因的方法主要有3种:一是构建突变体的方法,该方法是通过构建病原菌基因组中每一个基因的突变体,然后进行致病性检测;二是基因差别表达的方法,该方法是通过GUS报告系统或通过DNA芯片杂交检测在丰富培养基中和寄主体内或模仿寄主体内环境条件的培养基的基因表达差异,一般将那些受寄主诱导的基因作为致病相关基因的候选基因;叁是生物信息学分析法,该方法通过在病原菌基因组中寻找和已报道的其他病原菌的致病相关基因的同源基因作为该病原菌的致病相关基因的候选基因。本研究采用了第一和第叁种方法进行Xcc致病相关新基因的鉴定。首先,在本实验已经构建了Xcc8004的Tn5gusA5插入突变体库并对所有突变体进行了致病性检测的前提下,我们利用标记置换(marker exchange)的方法对10个致病力下降的Tn5gusA5插入突变体重新构建突变体,证实2个与Xcc致病相关的插入位点,通过进一步的非极性突变体的构建及互补证明了hgiA和gpdA基因与该病原菌的致病相关。另外,通过检查Xcc8004基因组注释结果,我们发现Xcc中存在一个与植物病原菌欧文氏菌致病因子调控基因rsmA高度同源的基因-csrA,我们通过定点整合突变的方法获得了该基因的非极性突变体,致病性检测表明该突变体不能在寄主植物满身红萝卜上引起症状。 hgiA基因编码产物为MarR家族转录调控子(MarR family transcriptional regulator)。MarR转录调控子在大肠杆菌中最先是作为非特异抗生素抗性抑制子,翼式双螺旋的结构是该家族成员的共同特征。已经证明欧文氏菌,沙门氏菌,耶尔森氏菌中MarR家族转录调控子在致病过程中发挥重要作用。而Xcc的hgiA基因突变以后,突变体的致病力也明显减弱。用OD_(600)=0.1的接种浓度用剪叶法接种满身红萝卜,接种10天后,接种突变体的叶片病斑长度为3.25mm,而接种野生型菌株8004的叶片的病斑长度为12.5mm,而且突变体的致病缺陷能被hgiA基因反式互补,这一结果证明hgiA基因是病原菌致病所需要的。叶内回收菌体试验结果表明hgiA突变体在寄主叶内的生长量比野生型菌株显着减少,说明hgiA基因是病原菌叶内生长所必需的。我们在8个不同栽培品种的十字花科植物上检测了hgiA突变体的致病力,结果发现在健春(大白菜)(Brassica campestris var.JianChun)、中白78(Brassica campestris var.ZhongBai78)和京丰1号(卷心菜)(Brassica campestris var.JingFengNol)上完全没有致病力,而在花叶白萝卜(萝卜)(Raphanus sativus L.var.radiculus HuaYe)、板叶红袍(萝卜)(Raphanus sativus L.var.radiculus BanYeHongPao)、晚丰(甘蓝)(Brassica oleracea L.var.WanFeng)、鲜红小金钟樱桃(萝卜)(Raphanus sativus L.var.radiculus XianHongXiaoJinZhong)和秋王70(花椰菜)(Brassica oleracea var.QiuWang70)的致病力为野生型菌株的20～30%。尽管该突变体的致病力明显下降,但是我们发现它的致病因子如胞外多糖的产量,胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶的活性与野生型菌株比较没有明显差异;而且突变体在丰富培养基和MMX基本培养基中与野生型菌株8004的生长状况也没有差异。为了研究该基因
徐荣旗[3]2006年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种新的依赖于Ⅲ型分泌系统的效应物的鉴定》文中指出黄单胞菌属由大量不同的种和变种组成，它可以侵染包括禾本科、豆科、十字花科作物在内的392种植物，在全世界每年都给农业生产造成重大经济损失。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc)是一种革兰氏阴性细菌，能侵染十字花科植物，引起黑腐病，是植物病原细菌与植物相互作用机理研究的模式菌之一。研究证明，Ⅲ型分泌系统(TypeⅢSecretion System，T3SS)是大部分植物和动物革兰氏阴性病原细菌致病过程中的关键装置，T3SS功能丧失后，病原菌不再具有致病性。病原菌利用T3SS将被称为效应物的蛋白分子直接注射到植物细胞的细胞质中，这些效应物包括无毒蛋白、致病因子和其它外泌蛋白(如Hrp outer protein，Hop)。全基因组测序为这些效应物的综合鉴定提供了可能，如可以根据启动子活性、与启动子相关的序列模型(PIP-box、hrp_Ⅱbox)或效应物的靶结构域(Leucine-rich repeats，LRRs)来筛选候选效应物等。本研究以全基因组已测序的Xcc8004菌株为研究对象，根据启动子区序列或蛋白结构特征以及调控蛋白HrpG、HrpX芯片杂交结果，将Xcc的所有8个avr基因和2个LRR基因作为候选的效应物基因，利用启动子报道基因、RT-PCR、Western杂交和体内转运检测等方法鉴定这些基因是否为依赖于T3SS的效应物基因。一、Xcc 8004基因组所有的4332个基因的启动子区(起始密码子前25～500bp)搜索结果表明，有66个基因含有PIP-box(TTCGCN15，N16TTCGC)，包括正义链上ORF 50个，反义链上ORF 16个；有123个基因含有hrp_Ⅱbox(TTCG…n15，n16…TTCG)，包括正义链上ORF 63个，反义链上ORF 60个。候选的效应物基因中，avrBs2和XC4273含有严谨的PIP-box，avrXccB、avrXccC、avrXccE1含有hrp_(Ⅱ) box。avrBs2在已测序的其它黄单胞菌(X.campestris pv. vesicatoria, X. axonopodis pv.citri, X. oryzae pv. oryzae)中非常保守，但其它无毒基因一致性和相似性都较低，甚至没有同源基因；XC1553、XC4273、HpaF和PopC之间存在一定的同源性。二、鉴定了候选基因的Tn5gusA5插入突变体，并构建了这些候选基因的单交换整合突变体。在寄主植物萝卜和甘蓝上对这些突变体的致病性检测表明：无毒基因avrBs2是Xcc的致病相关基因；XC4273基因突变后，Xcc的致病性显着下降。叁、野生型Xcc 8004在光头芥菜上不能致病。但当avrXccC基因突变后，Xcc在光头芥菜上变的可以致病。avrXccC是寄主特异性基因，它与寄主植物光头芥菜对Xcc的抗性有关。四、Xcc在抗病的拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Col-0上不能致病，而XC1553的突变体具有致病特性，这种类似于无毒基因的特征可以被XC1553基因反式互补。因此，推断XC1553是一个无毒基因。五、构建了8个无毒基因的avr-hrpG双突变体和2个LRR基因的启动子报道基因。实验结果证明avrBs1.1、avrBs1、avrXccB、avrXccC、avrXccE1、XC1553和XC4273的表达是受hrpG调控的，除avrBs1和XC4273外，这些基因还受hrpX调控。六、利用本实验室构建的可以导致hrp基因组成型表达的Xcc 8004~*，尝试了通过Western杂交将其用于效应物分泌检测的可能性。七、以AvrBs1的功能区为报道蛋白，分别证明XC1553和与野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv)XopN同源的XC0241是Xcc依赖于T3SS的效应物；利用Xcv已知的效应物AvrBs3的功能区为报道蛋白，证明了AvrXccC也是依赖于T3SS的效应物。总之，本研究对Xcc 8004注释的所有编码Avr和LRR蛋白的基因，在致病性、表达调控和效应物分泌或转运等方面进行了系统研究，鉴定了两个寄主特异性基因，证明了叁个基因的编码产物为Xcc新的依赖于Ⅲ型分泌系统的效应物。
韦红玉[4]2006年在《野油菜黄单胞菌效应物转运鉴定系统的构建》文中进行了进一步梳理效应物是通过Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起识别或致病作用的细菌分泌蛋白，对于病原菌的致病性至关重要。效应物蛋白从结构上可分为分泌转运信号区和互作功能区。目前，在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc)中仍然缺乏有效、快速的鉴定致病效应物的方法。为有效地在全基因组水平上鉴定Xcc效应物，本研究依据黄单胞菌的avrBsl对辣椒ECW-10R的Bsl互作机理，建立了一套快速、有效地Xcc效应物转运鉴定系统。首先，构建了Xcc avrBsl的缺失突变体，证明avrBsl基因所编码的无毒蛋白能引起具Bsl抗性基因的辣椒ECW-10R过敏性反应(hypersensitive reaction，HR)。然后，通过缺失AvrBsl N端氨基酸实验，预测avrBsl第59至445氨基酸为能引起HR反应的AvrBsl功能区，农杆菌介导瞬时表达证明Xcc avrBsl第59至445氨基酸足够诱导ECW-10R HR反应，鉴定为Xcc avrBs，的互作功能区。利用Xcc avrBsl，的互作功能区，分别与X00241、XC3160的启动子区和信号区融合，结果能引起依赖hrp-TTSS的HR反应。GUS活性检测表明这两个基因都受到hrpG和hrpX调控，致病力试验表明这两个基因都与致病相关。通过该系统，X00241、X03160被鉴定为新的效应物基因，表明该鉴定系统能有效工作。
唐昭[5]2004年在《野油菜黄单胞菌中感受植物信号基因的鉴定》文中进行了进一步梳理野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris，简称Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原菌，它具有对致病起关键作用的hrp基因簇。研究表明，Xcc的hrp基因表达调控模式与茄青枯病罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)相似。在丰富培养基中hrp基因的表达受到抑制，而在基本培养基或植物中受到诱导而表达。到目前为止，只有在茄青枯病罗尔斯通氏菌中发现了感受植物信号诱导hrp基因表达的相关基因。本工作在Xcc 8004基因组测序和注释完成的基础上，通过氨基酸序列的同源比较，在Xcc 8004基因组中搜索到6个与茄青枯病罗尔斯通氏菌中感受植物信号相关基因(prhA、prhJ、prhI、prhR)具有较高同源性的基因，本研究对这6个候选基因中的2个(XC0519和XC0520，分别与prhI和prhR同源)进行深入研究。① 通过构建hrp基因GUS报告系统，分析了在XC0519突变体和野生型背景下hrpB1和hrpF的表达，结果表明XC0519突变体的hrpB1和hrpF在基本培养基和诱导培养基中的表达没有明显差别，而在与植物直接接触后XC0519突变体的GUS活性比野生型明显降低，说明XC0519是感受植物信号诱导hrpB1和hrpF表达中的一员。② XC0519和XC0520突变体在完全培养基和基本培养基上的生长与野生型没有明显差别。XC0519和XC0520的突变体在红萝卜上的致病力明显降低，剪叶接种后第十天，XC0159突变体病斑长度为4.9mm，XC0520突变体病斑长度为8.4mm，而野生型的病斑长度为11.5mm。这些结果表明XC0519和XC0520与Xcc的致病性有关。
臧宁[6]2005年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种mip-like基因的鉴定及功能分析》文中研究指明巨噬细胞侵染增强因子Mip(macrophage infectivity potentiator,Mip)是人的病原细菌嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)中的重要致病因子,它属于FKBP类型的肽基脯氨酰基顺反异构酶(peptidylprolyl cis-trans isomerase,PPIase)(FKBPs)。Mip或Mip-like蛋白也是其它一些人或动物病原生物如Q热立克次体(Coxiella burnetii)和沙门伤寒氏菌(S.typhimurium)的致病因子。在植物病原细菌中,只有木质部难养细菌(Xylella fastidiosa)基因组中注释了一个名为mip-like的基因,至于mip-like在其它植物病原细菌中是否存在以及其生物学功能未见报道。本研究中,我们用木质部难养细菌的Mip-like蛋白的氨基酸序列去搜索野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)(该菌是引起十字花科植物黑腐病的病原菌)8004菌株的基因组,发现基因XC2699(原来注释为肽基脯氨酰基顺反异构酶)与木质部难养细菌的mip-like基因和嗜肺军团菌的mip基因在氨基酸水平上分别有85%和49%的相似性。为此,我们将XC2699重新命名为mip-like。 为了确定ORF2699编码的产物是否是一个肽基脯氨酰基顺反异构酶以及其类型,我们将该ORF2699的编码区序列克隆到载体pET-30上并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行过量表达,然后将带有六组氨酸标记的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Mip—like融合蛋白纯化,并用蛋白酶偶联法,以N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide为底物测定了该蛋白的PPIase酶活性,结果证实纯化后的目标蛋白具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性;其Km和Kcat值分别为21.72mM和7.2×10~4S~(-1),Kcat/Km为3.29×10~6M~(-1)S~(-1)。酶活性抑制特性测定结果表明,其活性能被免疫抑制药物FK506特异抑制而不受另一种免疫抑制药物环孢菌素A(clycosporin A)抑制。这些结果证明XC2699是一个mip-like基因,Xcc Mip-like蛋白是一个FKBP类肽基脯氨酰基顺反异构酶。 为了确定Mip-like蛋白在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的生物学功能,我们利用自杀质粒pK18mob整合突变方法构建了mip-like基因的非极性突变体,并在寄主植物满身红萝卜(Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.)上用剪叶法测定了其致病性,结果发现,接种十天后,接种mip-like突变体NK2699的叶片的平均病斑长度为2.3mm,而接种野生型菌株8004的叶片的平均病斑长度为15.1mm,而且突变体致病性的降低能被一个野生型的mip-like基因反式互补(接种互补菌株CNK2699的叶片的平均病斑长度为13.6mm)。这一结果证明mip-like基因是Xcc致病所需要的。为了了解mip-like基因影响致病的机制,我们进一步检测了该突变体在培养基上的生长情况以及致病因子产生情况,结果发现(ⅰ)mip-like突变体NK2699在NYGA培养基上的生长与野生型菌株8004基本一致;但在基本培养基上该突变体的生长非常差,而野生型菌株和互补菌株生长良好;(ⅱ)mip-like突
姜伟[7]2006年在《计算机模拟全基因组鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Ⅲ型效应物基因》文中认为效应物是通过Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起识别或致病作用的细菌分泌蛋白，对于病原菌的致病性至关重要。由于效应物分子在一级结构上存在较大的差异，目前，在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc)中仍然缺乏有效、快速的预测效应物基因的方法。本研究采用计算机模拟方法，分析已知的效应物蛋白在氨基酸组成、性质及结构等方面的共性，初步建立了计算机模拟全基因组鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Ⅲ型效应物蛋白的工作平台。该研究表明，尽管效应物蛋白之间的同源性并不明显，但效应物氨基端的区域拥有相似的氨基酸成分。许多avr或者hop基因编码蛋白的N-端有以下几个特征，包括：(1)前50个氨基酸中丝氨酸或脯氨酸的含量大于10％；(2)第3位或第4位含有一个脂肪族氨基酸或脯氨酸；(3)前12位氨基酸中缺乏带负电荷的氨基酸。利用以上这些特征，对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000)的已知效应物进行了分析，发现已知的效应物基本符合以上的特征，并且经TMHMM2.0和SignalP3.0预测发现效应物蛋白没有跨膜结构和信号肽。另外，效应物启动子区域存在保守的hrp-box，也是一个很有利的全基因组搜索的条件。而黄单胞菌中已知效应物的特征与假单胞菌相比则有些差别。综合对已知效应物的分析，特别是对黄单胞菌中已知效应物的分析，得到如下特征：(1)编码的蛋白长度大于50个氨基酸；(2)前50个氨基酸中丝氨酸或脯氨酸的含量大于10％，亮氨酸的含量少于10％；(3)TMHMM2.0、SignalP3.0预测没有跨膜结构和信号肽；(4)基因启动子区域存在保守的PIP box序列。利用这些特征全基因组预测Xcc 8004的效应物，最后得到43个候选基因。然后利用以AvrBs1为报告蛋白的效应物体外转运检测系统对候选基因进行验证。本文随机挑选XC0268和XC2995进行生物学验证，发现XC2995为新的效应物基因。
梁莹[8]2004年在《水稻黄单胞菌水稻致病变种与致病相关的新基因的功能鉴定》文中提出作者所在实验室以前工作表明含有水稻黄单胞菌水稻致病变种(以下简称Xoo)13751 DNA的重组质粒pGXN3000上至少有4个基因(rpfA、rpfB、rpfC、rpfF)能正向调控该菌的胞外多糖的产生及致病性并已完成了pGXN3000的序列测定。序列分析表明pGXN3000的rpfA上游有4个完整的ORFs，分别为pdeA、cheB、pin、pcaD。pdeA基因为2262 bp，可编码一个含754个氨基酸的产物，该产物与地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(以下简称Xac)的环二鸟苷酸磷酸二酯酶A(c-di-GMP phosphodiesterase A)有96％的相似性和93％的相同性。cheB基因为1074 bp，可编码一个含358个氨基酸的产物，该产物与Xac的谷氨酸甲酯酶(glutamate methylesterase)的相似性和相同性均为67％。pcaD基因为813bp，可编码一个含271个氨基酸的产物，该产物与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(以下简称Xcc)的β-酮已二烯醇内酯水解酶(beta-ketoadipate enol-lactone hydrolase)有92％的相似性和85％的相同性。pin基因产物的功能域分析表明其第189-198个氨基酸为锌指结合域(zinc finger binding domain，ZnF_NFX域)。在rpfC基因下游有—ORF的产物与Xcc的属于双组分调控系统家族的调节蛋白RpfG有99％的相似性和96％的相同性。 为了了解Xoo pdeA、rpfG、cheB、pin、pcaD基因在该菌在水稻致病过广西大学硕_l:学位论文程中的作用和功能，我们用同源自杀质粒单位点整合突变方法分别构建得到了该菌的p认纳一突变体(GXNI 256)、，月一突变体(GXNI 258)、CheB一突变体(GXNI 255)、刀j厅突变体(GXN1269)和户eal)一突变体(GXN1261)。 水稻植株剪叶接种试验表明，xo口p/n-突变体GXNI 269在水稻上引起 的病斑长度与野生型13751的没有显着差别，说明xo口pl’n基因可能与其在 水稻上的致病性无关。无论是在高接种浓度(OD600二0.1)还是在低接种浓度 (0D600=0.001)下，而oFp几一突变体GXNI 258、p动纳一突变体GXNI 256和pCaD- 突变体GXNI 261在水稻上引起的病斑长度显着降低，在高接种浓度(OD600=0.1)下，GXNI 25a、GxNI 256和GxNI 261在水稻上引起的病斑长度分别是野 生型13751的21.37%、64.69%和77.44%，在低接种浓度(0D600=0.001)下 则分别是野生型13751的14.47%、67.99%和76.10%，说明而。的rP招、刀决斌和pCao基因与其在水稻上的致病性有关。 平板检测表明xo口p丈介绒一突变体GXNI 256、rP招一突变体GXNI 258的胞外多糖和OSF因子的产量均显着减少，说明xo口胞外多糖和OSF因子的产生与rP招和p尤论斌基因有关。xo口pde月基因产物的功能域分析表明其第317一488个氨基酸为具有环二鸟昔酸磷酸二醋酶A活性的OUFI域和第498一745个氨基酸为具有二鸟昔酸环化酶活性的DU「2域(也称GGOE「基序)，这两个酶可能参与调控细胞内信号分子环二鸟昔酸的浓度。xo口rP凡基因产物的功能域分析表明第1 92一329个氨基酸为HD域，属于依赖金属的磷酸水解酶家族。关于信号分子环二鸟昔酸与病原菌在植物上的致病的相关性目前还未见报道。平板检测表明xo口p决流基因能很好地恢复rP绍一突变体GxNI 258产Ds「的能力，xo口rP凡基因也能很好地恢复pdeA一突变体GXN 1 256产胞外多糖和DSF的能力。 广西大学硕士学位论文 水稻植株剪叶接种试验表明cheB一突变体GXN 1 255在水稻上引起的病斑长度与13751的没有显着差异，但是水稻植株喷雾接种试验表明cheB一突变体GXN 1 255在水稻上引起的病情指数是1 3751的48.91%。毛细管趋化应答试验表明ch出一突变体的趋化能力显着降低，说明cheB基因与xo口的趋化应答有关，xo。的ch出基因与其在水稻上的致病性有关可能是通过控制其趋向水孔有关。进一步说明趋化性可能在植物病原细菌致病的早期起重要作用。
刘建元[9]2008年在《野油菜黄单胞菌控制hrpG、hrpX表达的调节基因的鉴定》文中进行了进一步梳理hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity)基因决定着病原细菌对寄主植物的致病性和诱导非寄主植物过敏反应。在野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)中,hrpG、hrpX是目前已鉴定出的控制hrp基因表达的关键调节基因,而关于hrpG、hrpX上游的调节基因几乎一无所知,因此,鉴定控制hrpG、hrpX表达的调节基因,对于研究hrp基因的表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制都具有重要意义。本研究利用蔗糖敏感型自杀基因sacB作为报告基因,将报告质粒pL6sacBhrpX和pL6sacBhrpG通过叁亲本接合的方法导入Xcc 8004功能注释为调节基因的253个突变体,从中筛选出6个候选调节基因XC3799、XC2253、XC3056、XC1734、XC2650和XC2251。在初步获得6个候选调节基因的基础上,本研究又利用gus基因作为报告基因,建立了GUS报告系统加以验证。首先构建获得GUS报告质粒pL6gushrpX和pL6gushrpG,然后将它们与另外两个GUS报告质粒pLGX和pLGG通过叁亲本接合的方法分别导入上述候选基因对应的突变体(073G12、125H08、151D11、NK1668、PK2558和NK2168),在MMX培养基中检测GUS活性。结果显示,与野生型Xcc 8004相比,突变体073G12、125H08、151D11、NK1668和NK2168中hrpG、hrpX基因的表达量(即GUS活性)均表现为显着降低,表明这5个突变体所对应的基因XC3799、XC2253、XC3056、XC1734和XC2251正向调控hrpG、hrpX基因的表达,而突变体PK2558对应的基因XC2650非正向调控hrpG、hrpX基因的表达。通过功能反式互补,构建获得调节基因XC2253的突变体125H08和XC3056的突变体151D11的互补菌株,然后进行突变体及互补菌株的表型检测。结果表明,XC2253和XC3056这两个调节基因都可影响Xcc的致病能力,但基本上不影响Xcc诱导辣椒ECW-10R的过敏反应,也不影响Xcc胞外多糖的分泌及胞外蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性;调节基因XC2253可影响Xcc的游动性及生物膜的形成,而另一调节基因XC3056不影响Xcc的游动性及生物膜的形成。
李有志[10]1999年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖产生有关的一基因簇的鉴定和分析》文中指出本室原已从Xcc野生型菌株8004克隆到含有EPS产生相关基因的9.4kbHindⅢ DNA片段，本研究进一步构建了这一片段的6种限制性内切酶酶切图谱，通过转座子Tn5gusA5插入诱变这一克隆片段和标记置换(marker exchange)构建突变体，发现其中连续的7kb区域中含有一个与EPS产生有关的基因簇，由于未能获得转座子插入及实质，还不清楚于另一端的余下的2kb区域是否与EPS产生有关。将含有这9.4kb DNA片段的重组质粒导入菌株8004，能提高EPS的产量2.8倍。 本研究对以上9.4kbDNA中的“1.9”kb EcoR1 片段进行了测序分析，测序分析结果表明这一片段实际长度为1880bp。进一步对这1880bp DNA进行分析，其中含有一个完整的开放阅读框架(ORF2)和一个不完整的开往阅滨框架(ORF1)，ORF1和ORF2的推断性编码产物分别与已报道的GumA和GumB蛋白在氨基酸水平上具有100％的同源性。GumA是一种作用范围较广的调控蛋白，被称为整合寄主因子(IHFα)，在大肠杆菌中是由himA基因编码的。GmB可能与糖核苷聚合或EPs输出有关。 本工作还利用所构建的EPS-突变体探讨了EPS对Xcc致病性的影响，结果表明，EPS的产量与致病性呈正相关，按种浓度的大小直接影响到致能力。通过电镜观察还发现，EPS对Xcc从气孔入侵寄主能力具有重要作用。
参考文献：
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