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Activin A和BMP4单独添加对小鼠胚胎干细胞多能性的影响

2020-12-08阅读(310)

Activin A和BMP4单独添加对小鼠胚胎干细胞多能性的影响

论文摘要

自从1981年首次由小鼠囊胚建立胚胎干细胞系（Embryonic Stem Cells,ESCs）以来,人们不断的探索其体外培养条件,试图用化学成分明确的培养基来替代原始的饲养层上皮细胞和胎牛血清的培养基。经过近30年的努力,研究者发现Mek1/2和GSK3b通路的抑制剂（PD和CH:2i）和白血病抑制因子（LIF）的共同使用,可以成功获得一种化学成分明确的培养基（2i/LIF）使小鼠ESCs维持类似囊胚内细胞团（Inner Cell Mess,ICM）的na?ve多能性状态。然而在2017年《Nature》发表的两篇论文指出,用2i/LIF长期培养小鼠ESCs会使它产生不可逆的表观遗传改变和基因组不稳定性,主要原因是Mek1/2的抑制剂PD对小鼠ESCs的多能性发育有阻滞作用。本实验首先将2i/LIF培养液中的PD分别替换为Activin A和BMP4,对2i/LIF-ESCs进行体外培养,诱导得到的细胞系依次命名为ACL-ESCs和BCL-ESCs。其次,研究ACL-ESCs和BCL-ESC的干细胞特征,基因表达模式和体内发育潜能等,具体实验结果如下:（1）在形态学特征上ACL-ESCs和BCL-ESCs与2i/LIF-ESCs细胞形态基本相同;由△PE-Oct4激活表达的绿色荧光蛋白（GOF/GFP）一直存在,说明在ACL-ESCs和BCL-ESCs培养体系中,Oct4远端启动子依然处于被激活的状态;碱性磷酸酶染色结果显示ACL-ESCs和BCL-ESCs均呈较强碱性磷酸酶活性。但是ACL-ESCs和BCL-ESCs的细胞增殖速度与2i/LIF-ESCs存在一定差异。（2）在ACL-ESCs和BCL-ESCs中Oct4、Sox2和Klf4等多能性相关基因的表达均与2i/LIF-ESCs无显著差异;而与2i/LIF-ESCs相比,BCL-ESCs细胞的DNA甲基化相关基因Dnmt3b和Dnmt3l和中胚层相关基因Hand1,Evx1,Eomes和T的表达量均显著提高。更值得注意的是Myc的表达量与对照组细胞相比较,诱导后得到的两种细胞系中均显著上调。（3）从RNA测序结果可以看出,在2i/LIF-ESCs中高表达的基因与骨骼系统发育、脊椎动物胚胎发育和感觉器官发育等相关;在ACL-ESCs中高表达的基因与有机羟基化合物代谢过程,无机分子实体跨膜转运蛋白活性及无机离子稳态调控等代谢过程相关;在BCL-ESCs中高表达的基因主要与组织形态发生,生殖结构发育以及胚胎形态发生等有关。说明ACL-ESCs和BCL-ESCs具有独特的基因表达模式。（4）体内发育潜能检测结果显示,在受精后第10天（E10.5）的小鼠嵌合胚胎中ACL-ESCs和BCL-ESCs单个细胞均可贡献到胚胎及部分胚外组织中;而2i/LIF-ESCs不能贡献到胚胎外组织。表明本实验获得的两种细胞系的体内发育潜能比对照组更高。综上所述,本实验结果表明,用Activin A或BMP4替代2i/LIF培养液中的PD可使小鼠ESCs维持干细胞特征,并分别具有独特的基因表达模式,对小鼠ESCs的多能性具有一定的扩展潜能。我们推测这个培养系统对研究早期胚胎发育和小鼠胚胎干细胞的研究提供了新的途径。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 小鼠胚胎干细胞的研究进展
  •   1.2 小鼠胚胎干细胞多能性调控机制
  •     1.2.1 oct
  •     1.2.2 Nanog
  •     1.2.3 Sox
  •     1.2.4 Klf基因
  •   1.3 小鼠胚胎干细胞多能性维持的信号通路
  •     1.3.1 LIF信号通路
  •     1.3.2 BMP/Activin信号通路
  •     1.3.3 Wnt信号通路
  •   1.4 mESCs多能性维持的表观遗传学调控
  •     1.4.1 miRNAs对转录和转录后的调节
  •     1.4.2 IncRNA的调节
  •     1.4.3 组蛋白修饰与DNA甲基化
  • 第二章 ACTIVIN A或 BMP4 取代PD后对小鼠胚胎干细胞形态特征的影响
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验对象
  •     2.1.2 培养试剂与仪器耗材
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 培养液的配制
  •     2.2.2 由小鼠 2i/LIF-ESCs向ACL-ESCs和BCL-ESCs诱导
  •     2.2.3 ACL-ESCs和BCL-ESCs细胞的生物学特性检测
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 ACL-ESCs和BCL-ESCs的形态学鉴定
  •     2.3.2 ACL-ESCs和BCL-ESCs的细胞增殖特征
  •     2.3.3 ACL-ESCs和BCL-ESCs的碱性磷酸酶活性检测
  •   2.4 讨论
  • 第三章ACL-ESCS和BCL-ESCS的基因表达特征
  •   3.1 实验材料及仪器
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 实验仪器
  •     3.1.3 培养试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 培养液的配制
  •     3.2.2 ACL-ESCs和BCL-ESCs细胞的传代
  •     3.2.3 免疫荧光染色
  •     3.2.4 mRNA的提取
  •     3.2.5 mRNA反转录为c DNA的过程
  •     3.2.6 检测实时荧光定量PCR
  •     3.2.7 RNA-seq测序及分析
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 ACL-ESCs和BCL-ESCs免疫荧光染色结果
  •     3.3.2 实时荧光定量检测ACL-ESCs和BCL-ESCs的基因表达水平
  •     3.3.3 ACL-ESCs和BCL-ESCs的RNA-seq检测结果
  •   3.4 讨论
  • 第四章ACL-ESCS和BCL-ESCS的体内发育潜能分析
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 实验动物
  •     4.1.2 仪器与耗材
  •     4.1.3 实验试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 ACL-ESCs和BCL-ESCs中tdTomato的转染
  •     4.2.2 制备嵌合体小鼠
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 建立tdTomato阳性ACL-ESCs和BCL-ESCs
  •     4.3.2 制备嵌合体小鼠
  •     4.3.3 ACL-ESCs和BCL-ESCs对小鼠E10.5 胚胎的嵌合能力
  •   4.4 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 孟庆丽

    导师: 李喜和

    关键词: 小鼠胚胎干细胞,体外培养,多能性

    来源: 内蒙古大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 内蒙古大学

    分类号: Q813.11

    总页数: 71

    文件大小: 5045K

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