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鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA特异性适配体及多克隆抗体的制备研究

2020-12-08阅读(998)

鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA特异性适配体及多克隆抗体的制备研究

论文摘要

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种人畜共患病肠道致病细菌,可引起肠胃炎、伤寒、痢疾等疾病。由鼠伤寒沙门氏菌引起的病例全球可见,分布广泛,特别是在贫困地区,由其感染造成的发病率和死亡率更是高居不下,给人类生活健康造成极大威胁,而形成细菌菌膜是其感染难以根除的主要原因之一。菌毛是细菌表面的一些丝状附属物,其在病原菌感染机体形成菌膜的初始黏附,菌膜发展甚至细菌间的信号传递等过程中均有重要作用。适配体是能与靶标特异性结合的寡核酸片段,其在靶向给药治疗细菌或细菌菌膜感染等方面有极大应用前景,因此,本文以鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白为靶标,筛选其特异性适配体,为靶向治疗细菌或细菌菌膜感染奠定基础。此外,为进一步探究菌毛影响菌膜发展的分子机制,以菌毛蛋白为抗原,制备其多克隆抗体。具体工作如下:（1）FimA蛋白是鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛的主要结构单位,对实现其菌毛的功能有重要意义。本实验通过构建pET-28a-fimA重组质粒,将重组质粒导入表达细菌,并成功诱导表达。经纯化浓缩,得到纯度较高的重组蛋白FimA,用Bradford法测得其浓度为1.594 mg/mL,达到后续实验要求。（2）适配体（Aptamer）是经指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）筛选得到的,与靶标具有高亲和力与特异性结合能力的寡核酸片段。本部分以鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA为靶标,筛选得到其特异性适配体。经验证分析,筛选得到的适配体对靶标菌具有较强的亲和力,达到29.8±7.88 nM,且具有较好的特异性。（3）本部分以纯化的鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA为抗原,免疫3只小鼠,得到其多克隆抗体。经间接酶联免疫吸附（ELISA）实验测其抗血清效价,其中两只小鼠抗血清效价达到1:64000,另一只小鼠抗血清效价达到1:32000。此外,用Western blot检验其特异性,结果表明,多克隆抗体特异性较好。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 引言和文献综述
  •   1.1 鼠伤寒沙门氏菌
  •     1.1.1 S.typhimurium的致病性
  •     1.1.2 S.typhimurium的检测方法
  •     1.1.3 S.typhimurium的防治方法
  •   1.2 菌毛
  •     1.2.1 S.typhimurium菌毛
  •     1.2.2 菌毛与菌膜之间的关系
  •   1.3 适配体
  •     1.3.1 适配体的筛选过程
  •     1.3.2 适配体的特点
  •     1.3.3 适配体的应用
  •   1.4 多克隆抗体
  •     1.4.1 多克隆抗体的制备过程
  •     1.4.2 多克隆抗体与单克隆抗体的比较
  •     1.4.3 多克隆抗体的应用
  •   1.5 本课题的研究内容
  • 第二章 鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA的纯化
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验部分
  •     2.2.1 实验材料与仪器
  •     2.2.2 主要溶液配制
  •     2.2.3 实验方法
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 S.typhimurium fimA基因的PCR扩增验证
  •     2.3.2 重组质粒pET-28a-fimA双酶切鉴定
  •     2.3.3 重组质粒pET-28a-fimA测序结果
  •     2.3.4 重组蛋白可溶性分析
  •     2.3.5 重组蛋白的纯化鉴定
  •     2.3.6 浓缩后的蛋白质浓度测定
  •   2.4 小结与讨论
  • 第三章 鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA特异性适配体的筛选
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验部分
  •     3.2.1 实验材料与仪器
  •     3.2.2 主要溶液配制
  •     3.2.3 实验方法
  •     3.2.4 适配体亲和力分析
  •     3.2.5 适配体特异性分析
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
  •     3.3.2 高通量测序分析
  •     3.3.3 适配体亲和力分析
  •     3.3.4 适配体特异性分析
  •   3.4 小结与讨论
  • 第四章 鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA多克隆抗体的制备
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验部分
  •     4.2.1 实验材料与仪器
  •     4.2.2 主要溶液配制
  •     4.2.3 实验部分
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 多克隆抗体效价测定结果
  •     4.3.2 多克隆抗体特异性验证
  •   4.4 小结与讨论
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的论文
  • 致谢
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 周佳琪

    导师: 邓乐

    关键词: 鼠伤寒沙门氏菌,菌毛,适配体,多克隆抗体

    来源: 湖南师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 湖南师范大学

    基金: 国家自然科学基金

    分类号: Q93

    总页数: 62

    文件大小: 1846K

    下载量: 126

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