前列腺癌细胞来源的外泌体诱导巨噬细胞极化的作用及机制研究

论文摘要

目的:本文旨在对前列腺癌细胞来源的外泌体在诱导巨噬细胞极化中的作用及其机制进行研究。方法:（1）前列腺癌细胞来源的外泌体（PCa-exos）的分离与鉴定:培养PC-3M-2B4、PC-3M-IE8两种前列腺癌细胞,采用Millipore超滤法提取条件培养基中的外泌体。磷钨酸染色后通过透射电子显微镜对外泌体进行形态上的观察,用纳米粒径分析技术对所提外泌体的颗粒大小进行鉴定,用Western印迹检测外泌体表面的特异性分子标志。（2）PCa-exos诱导巨噬细胞极化:培养THP-1细胞并用诱导为巨噬细胞（Macrophage,Mφ）,加入LPS（15 ng/ml）和IFN-γ（50 ng/ml）共同刺激巨噬细胞48h后为M1亚型,加入IL-4（25 ng/ml）刺激巨噬细胞48h后为M2亚型。将所提外泌体（100 ug/ml）加入到巨噬细胞中,48h后为2B4-exo-Mφ与IE8-exo-Mφ型;用绿色荧光PKH67标记的PCa-exos加入到巨噬细胞中,观察外泌体是否能被巨噬细胞吸收以及观察其吸收效率;用CD206抗体对巨噬细胞表面进行荧光染色分型鉴定;用q-PCR、ELISA法检测诱导后的巨噬细胞及其上清中IL-10、IL-1β等因子的表达;用Western印迹检测巨噬细胞经不同诱导处理后细胞中mTOR、AKT、STAT3及其磷酸化蛋白的表达水平。（3）PCa-exos中miRNAs分析:用q-PCR检测提取的外泌体中let-7b等microRNAs的表达。（4）PCa-exos诱导的巨噬细胞功能学实验:用Transwell细胞体外侵袭实验和体外血管生成实验检测各组巨噬细胞上清对前列腺癌细胞的侵袭能力及血管生成能力的影响。结果:（1）电镜、纳米粒径分析结果和Western印迹显示外泌体能通过Millipore超滤方法富集、分离,形态多为圆形,有典型的茶托状结构,直径约在40160 nm,且表面具有外泌体表面特异性分子标志CD63和TGS101。（2）外泌体在24h内能被巨噬细胞大量吸收,2B4-exo被巨噬细胞吸收的摄取率约为70%,IE8-exo被巨噬细胞吸收的摄取率约为64%;经PCa-exos诱导后的巨噬细胞组中CD206荧光显示强烈,与M2亚型巨噬细胞表达类似,阳性细胞数分别占总细胞数的77%和90%;q-PCR、ELISA法检测IL-10、IL-1β等炎症因子的表达趋势符合M2/TAM亚型巨噬细胞的细胞因子表达谱;Western印迹检测出经PCa-exos诱导后的巨噬细胞其AKT、STAT3的磷酸化蛋白表达水平增高。（3）q-PCR结果显示所提的外泌体中富含miR-23c、miR-451a、let-7b等microRNAs。（4）Transwell细胞体外侵袭实验和体外血管生成实验表明经PCa-exos诱导后巨噬细胞组的上清能够促进前列腺癌细胞的侵袭和血管生成能力。结论:通过Millipore超滤的方法能够提取出符合实验要求的外泌体PCa-exos,其能被巨噬细胞吸收,且约在24 h时达到对外泌体吸收的饱和状态;PCa-exos能够将巨噬细胞诱导为类似M2的表型;2B4-exo和IE8-exo中富含大量的microRNAs,他们可能通过激活AKT和STAT3蛋白将巨噬细胞极化为M2亚型;PCa-exos诱导后的巨噬细胞的上清可以促进前列腺癌细胞PC-3M-2B4和PC-3M-IE8的侵袭和体外血管生成能力。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 彭一琳

导师: 闵卫平

关键词: 前列腺癌细胞,外泌体,巨噬细胞极化

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 南昌大学

分类号: R392

总页数: 58

文件大小: 4813K

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标签：前列腺癌细胞论文;  外泌体论文;  巨噬细胞极化论文;