导读:本文包含了异种角膜基质论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:去细胞异种角膜基质,去细胞异种结膜基质,原材料,Gal抗原缺失小鼠
异种角膜基质论文文献综述
魏利娜,邵安良,黄立静,程祥,陈亮[1]（2019）在《去细胞异种角膜基质与去细胞异种结膜基质的免疫原性研究》一文中研究指出目的:应用Gal抗原缺失小鼠从体液免疫、细胞免疫、植入物局部组织病理等多方面评价去细胞异种角膜基质(猪源)与去细胞异种结膜基质(猪源)的免疫原性。方法:将用于每种材料的小鼠分为3个实验组:对照组(Con)、原材料组(T1)和基质组(T2)。将去细胞异种角膜基质与去细胞异种结膜基质及其原材料植入经兔血红细胞2次预免疫的Gal抗原缺失小鼠体内,于植入1个月后取材,分别分析2种基质及其原材料组与对照组在小鼠血清总抗体、抗-Gal抗体、细胞因子,脾脏淋巴细胞不同亚型的细胞表面分子表达水平,以及植入物局部组织病理等方面的变化。结果:2种基质及其原材料组在植入1个月后小鼠血清总抗体含量、细胞因子含量与对照组相比均无显着性差异。少数脾脏淋巴细胞表面分子表达水平与对照组相比有显着性差异(P<0.05),但均在对照组历史数据变异范围内。然而,小鼠血清抗Gal抗体检测结果显示:去细胞异种结膜基质植入1个月时基质及其原材料组小鼠血清抗-Gal抗体水平比对照组显着升高(P<0.05);而去细胞异种角膜基质植入1个月时基质及其原材料组小鼠血清抗-Gal抗体水平与对照组相比均无显着性差异。植入物局部组织病理显示:去细胞异种结膜基质植入1个月时大部分已降解,组织学显示轻微炎症反应,原材料组已无材料残留,组织学显示无明显炎症反应。去细胞异种角膜基质及原材料组植入1个月时植入物未发生明显降解,基质及原材料组的组织学反应均为重度炎症反应。结论:本研究结果证实了Gal抗原缺失小鼠对材料中残留Gal抗原的敏感性,应用Gal抗原小鼠能够科学地评价动物源性生物材料的异种免疫原性风险。(本文来源于《药物分析杂志》期刊2019年08期）
庞鵾鹏[2]（2011）在《以异种脱细胞角膜基质构建组织工程兔角膜前板层的实验研究》一文中研究指出角膜是构成眼屈光间质的重要组成部分,同时也是重要的天然防御屏障。目前,全球约有超过1000万人承受着角膜盲的痛苦。迄今为止,同种异体角膜移植是治疗角膜盲最有效的手段。然而,由于供体材料的匮乏,远远满足不了角膜盲患者的需求。因此,寻找有效的角膜替代物用于角膜移植,是目前眼科界亟待解决的问题。早期的角膜替代物研究多集中于人工角膜(Keratoprosthesis),有些已应用于临床,然而因生物相容性差、术后并发症较多等原因,限制了其在临床的应用。组织工程人工角膜是近年来研究热点,由种子细胞和可降解支架材料经体外构建而成,可最大程度地模仿天然角膜结构和功能。国内外已有学者采用天然或人工合成材料进行组织工程角膜构建,取得了较大进展,但因该构建物机械力学性能不足以及光学特性不佳等原因仅能用于基础研究。有报道证实,采用天然的材料如动物或人胶原制作支架可以增强其生物相容性。一些异种来源的细胞外基质己成功用于构建人工器官,如皮肤、心脏、血管等。我们课题组前期研究也证实,0.5% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)处理的脱细胞猪角膜基质(Acellular Porcine Cornea Matrix, APCM)具有较好的透光性、力学性能、生物安全性及生物相容性,细胞及遗传物质被去除的同时,角膜的天然结构得到了良好的保留。然而,APCM能否应用于组织工程人工角膜构建并用于移植是本研究的重点和难点。鉴于角膜板层移植是治疗一些常见角膜病的有效手段,同时能够避免角膜内皮损伤和排斥,本研究主要开展了以异种脱细胞角膜支架进行组织工程兔角膜前板层构建的研究,并成功进行动物角膜板层移植,取得了较好的效果,目前国内外尚无类似研究报道。第一部分兔角膜细胞的培养及APCM的制备[目的]探讨应用无血清培养基KSFM培养兔角膜上皮、基质及内皮细胞的可行性,同时对脱细胞方法进行改良以制备APCM用于组织工程人工角膜前板层构建。[方法]1.兔角膜细胞的原代培养：无菌条件下获取新西兰大白兔眼角膜,仔细去除虹膜、结膜及多余巩膜,解剖显微镜下撕下内皮层用于组织块培养；将去内皮角膜组织置于2.4U/ml DispaseⅡ消化1h,获取角膜上皮片,经0.25%胰酶-0.02%EDTA获取上皮细胞悬液进行培养；剩余角膜基质剪碎成1mm×1mm大小,置于0.5mg/ml胶原酶I 37℃消化过夜,获取基质细胞悬液。将3种细胞各分为2组,即KSFM培养组和含10%FBS的DMEM/F12培养组,置于六孔板内培养,每种细胞每组3个孔,各接种8个板,观察各培养条件下的细胞形态,细胞计数法描记生长曲线；2. APCM的制备及去细胞效果检测：改良脱细胞制作方法,无菌条件下将处理后的新鲜猪角膜置于0.5%SDS溶液4℃振摇4h×6次,不含双抗PBS冲洗2h×8次,含双抗PBS冲洗1h×3-6次获取无菌APCM,进行以下检测：1)H.E.及DAPI检测脱细胞角膜基质内细胞及遗传物质的残留；2)MTT实验检测材料浸提液对角膜上皮、基质及内皮细胞生长曲线的影响；3)电镜观察材料的结构及有无细胞残留。[结果]1.1)KSFM组：培养2d,上皮细胞形成克隆团,基质细胞贴壁呈树枝状,内皮细胞未见爬出；培养7d,上皮细胞紧密连接呈片状(密度达到90%-100%),基质细胞呈树枝状(密度达70-80%),内皮细胞连接紧密,形态不规则；传代后,细胞生长缓慢或不生长,漂浮细胞较多；2)含10%FBS的DMEM/F12组：培养2d,上皮细胞形成克隆团,基质细胞呈梭形,内皮细胞可见有少量细胞爬出；培养5d,上皮呈鹅卵石样已达60%密度,基质细胞呈梭形达70-80%密度,可见大量内皮细胞从内皮片组织周边爬出,呈不规则状；上皮和基质细胞培养7d传代,内皮细胞培养10d后传代,生长状态均良好,基质细胞可传10代。KSFM培养的上皮和基质细胞的生长曲线与含血清培养基相比差异有统计学意义(P<0.05)。2.MTT实验证实APCM浸提液对角膜上皮、基质及内皮细胞生长曲线无影响(P>0.05)；H.E.及DAPI证实材料内无细胞成分残留；电镜示材料结构完整,胶原排列整齐。[结论]KSFM可用来培养角膜上皮、基质及内皮细胞,但细胞生长较缓慢,易死亡；APCM经改良的脱细胞方法处理效果良好,可用来进行组织工程人工角膜构建。第二部分组织工程兔角膜前板层的体外构建[目的]探讨以APCM为支架体外构建含角膜上皮和基质细胞的组织工程兔角膜前板层的可行性。[方法]解剖显微镜下获取含前弹力层的APCM薄片(厚约1-2mm、直径7mm),置于培养基内37℃下浸泡24h,以备接种细胞。胰酶消化获取3代兔角膜基质细胞悬液,调整细胞终浓度为5×105/ml,应用1ml胰岛素空针平行于APCM前弹力层平面,将1ml基质细胞悬液沿着材料边缘接种于内静置培养24h,而后置于摇床上振摇培养7d；将1代角膜缘上皮细胞以5×103/mm2的密度接种于构建物表面,等待2h待细胞贴附于材料表面后,轻轻添加培养基静置再培养7d,构建同时含角膜上皮和基质细胞的组织工程兔角膜前板层。将接种基质细胞培养8d后的构建物再贴壁培养7d,观察有无细胞从角膜周边爬出,间接鉴定构建物内基质细胞活性；分别于3d、8d、15d取材进行H.E.染色,观察构建物细胞生长情况及组织结构；免疫染色检测角膜上皮细胞特异性标志物CK3和基质细胞标志物Vimentin的表达；取15d构建物标本分别进行免疫染色检查和扫描电镜观察。兔角膜前板层的叁维构建过程均采用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养。[结果]构建物再贴壁培养5d,可见有大量基质细胞爬出,间接证实材料内细胞活性。H.E.染色示构建物结构完整,未见明显的结构改变,胶原纤维间隙较大：3d,可见基质内有细胞生长,密度分布不均匀,胶原排列较规则；8d,可见基质内生长大量细胞,密度较均匀,胶原纤维间隙较大,排列整齐；15d,材料内仍分布大量细胞,表达基质细胞标志物Vimentin,密度较均匀,材料表面有2-3层细胞,表达上皮细胞标志物CK3,胶原排列整齐,纤维间隙较大。扫描电镜示胶原纤维水肿膨胀明显,部分区域见有胶原纤维断裂,胶原排列较整齐,可见有梭形的基质细胞附着生长。经过100%无菌甘油脱水,构建物能够恢复透明,表明APCM经过细胞接种再培养过程,叁维结构保持良好。[结论]APCM可用于组织工程人工角膜的构建；构建物具有正常兔角膜的表型,且脱水后能恢复透明,验证了该叁维培养方法的可行性,为兔角膜全层和人角膜的构建奠定了实验基础。第叁部分组织工程兔角膜前板层的动物移植实验[目的]初步探讨体外构建的兔角膜前板层体内移植后的生物学功能。[方法]1.5～2 kg新西兰大白兔20只随机分为两组,即构建物移植组和APCM空支架组,每组10只,各组均以右眼做术眼,左眼做阴性对照。术前3d术眼滴用抗生素,3%戊巴比妥钠(1ml/kg)经耳缘静脉进行麻醉,含庆大霉素生理盐水冲洗结膜囊,制备6.5mm直径大小角膜植床,采用国产10-0尼龙线对位缝合7mm直径大小植片至植床(共16针),并覆盖羊膜,结膜下隔日注射庆大霉素及地塞米松,合并应用典舒眼水(3次/天),构建物移植组术后1个月拆线。分别于1d、3d、7d、14d、21d、28d观察以下指标：结膜充血、水肿、分泌物,角膜水肿、混浊、浸润、新生血管、炎症反应,荧光素染色观察角膜上皮的完整性；术后5周进行活体共聚焦检查；于1周、2周、4周取材经4%多聚甲醛及3%戊二醛固定,分别进行组织学检查及扫描电镜观察。[结果]1.构建物移植组：术后1周,羊膜脱落,结膜轻度充血水肿,角膜上皮已覆盖大部分植片,未见有角膜新生血管,虹膜纹理可见,组织学检查见植片内胶原排列规则整齐,有少量细胞分布,植片与植床边界清晰,材料表面可见1～2层上皮细胞；术后2周,结膜轻度充血,中央角膜轻度混浊,未见有新生血管,植片表面有小部分区域上皮缺损,但可见虹膜纹理,组织学检查见材料表面分布有类似正常角膜的上皮结构,植片内部结构完整,胶原排列规则整齐,有细胞分布；术后4周,结膜充血水肿加重,植片表面不光滑,但较透明,可见角膜新生血管分布在周边区域,上皮已覆盖大部分植片,虹膜纹理可见,组织学检查同术后2周,扫描电镜示植片表面上皮排列与正常角膜已无明显差异；术后5周(已拆线1周),结膜充血水肿消失,植片区域角膜较透明,有轻微瘢痕形成,大部分新生血管已退去,虹膜纹理清晰,植片区域可见点状荧光素着色,激光共聚焦显示术眼角膜内皮密度及形态均正常。2. APCM空支架组：术后4周内角结膜反应情况相似于构建物移植组,但上皮始终无法完全覆盖植片表面,中央角膜呈现中度混浊状态,但仍可透见虹膜。组织学检查见植片胶原排列较规则,无明显结构改变,但与受体角膜分界明显；植片表面可见有上皮细胞生长,但不同于正常上皮结构；术后3周内,材料内均无细胞分布,而在术后第4周材料内部开始出现少许细胞。术后5周(未拆线)出现植片大量溶解现象,角结膜反应较重。[结论]体外构建的兔角膜前板层可用于板层移植,具有一定的组织修复能力。(本文来源于《山东大学》期刊2011-04-18）
徐锦堂,陈建苏,吴静,罗小玲,潘红卫[3]（2010）在《异种角膜基质的研究现状及问题》一文中研究指出在角膜3层(上皮层+Bowman’s膜、基质层、内皮层+Descemet’s膜)膜中,按等量计算,基质层的免疫原性是最低的。应用脱细胞的异种角膜基质移植后,神经和基质细胞可以再生,术后未见排斥反应,植片获得透明。因此,异种角膜基质有望成为板层角膜移植的供体和组织工程角膜的载体。现就异种角膜基质的研究现状及问题综述如下。(本文来源于《眼科新进展》期刊2010年07期）
刘先宁,朱秀萍,银勇,吴洁,杨华[4]（2008）在《以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织》一文中研究指出目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。(本文来源于《国际眼科杂志》期刊2008年11期）
傅瑶,陈苹,范先群[5]（2006）在《异种角膜脱细胞基质和几丁糖载体构建角膜基质层的比较》一文中研究指出目的探索异种角膜脱细胞基质和几丁糖为载体构建生物角膜组织的可行性,评价二者的结构、功能和生物相容性。方法1%TritonX-100及冷冻干燥处理获得猪角膜脱细胞基质,网状几丁糖材料制备成似角膜片状形态,将体外培养的兔角膜基质细胞种植于两种载体,体外培养2周,形成细胞载体复合物。对构建的角膜组织进行苏木精-伊红染色、扫描电镜观察;同时将两种生物材料移植到兔角膜基质囊袋内,观察其生物相容性。结果角膜基质细胞在两种载体上皆可黏附生长,并分泌细胞外基质。脱细胞基质载体内细胞形态不规则,位于胶原板层间,形成类似正常组织的角膜基质结构;细胞可在几丁糖网状纤维上黏附并包绕生长。两种载体移植到兔角膜囊袋后,脱细胞基质降解较慢,与宿主角膜组织相融性良好,未发生明显排斥及毒性反应;几丁糖载体降解较迅速,但降解产物诱导较严重的排斥反应。结论异种角膜脱细胞基质保留正常组织的胶原板层结构,并具角膜的韧性和良好的生物相容性,更适于作为体外构建生物角膜的载体,而几丁糖材料则需要在构成结构和性能等方面进一步改进。(本文来源于《眼科研究》期刊2006年06期）
吴静,郝念,李姝燕,徐锦堂,王彦平[6]（2006）在《异种角膜基质作为生物角膜载体的免疫学研究》一文中研究指出目的探讨异种(猪)角膜基质组织免疫原性,以评价其作为角膜重建载体材料的可行性。方法将新鲜、脱水2种猪角膜基质植片分别植入F344大鼠角膜基质层间,术后12d、90d抽取外周血,行抗CD25·FITC和抗CD4/CD8·PE双色免疫荧光标记,流式细胞仪测定分析。结果测得新鲜组、脱水组大鼠术后12d外周血T淋巴细胞表面抗原CD4+和CD25+、CD8+和CD25+双阳性表达率(1.53%±0.47%,2.13%±0.53%与0·57%±0.20%,0.67%±0.18%)及CD4+/CD8+比值(1.43±0.28,1.69±0.18)与同基因移植组(1.78%±0.36%,1.50±0.19)、阴性对照组(2.06%±0.52%,1.44±0.32)比较无显着性差异(P>0.05)。术后90d,新鲜组、脱水组大鼠外周血T淋巴细胞表面抗原CD4+和CD25+、CD8+和CD25+双阳性表达率(1.48%±0.39%,1.50%±0.46%与0·55%±0.15%,0·58%±0·11%)及CD4+/CD8+比值(1.43±0.51,1.36±0.59)与同基因移植组(1.32%±0·75%,1.31±0.29)、阴性对照组(1.34%±0.18%,1.44±0.42)比较,也无显着性差异(P>0.05)。结论异种(猪)角膜基质免疫原性低,是一种理想的角膜体外重建载体材料。(本文来源于《眼科新进展》期刊2006年05期）
陈根云[7]（2006）在《直径10mm异种角膜基质生物相容性及神经再生研究》一文中研究指出目的：从组织相容性、免疫相容性、神经再生特性评价直径10mm异种(猪)角膜基质作为人工生物角膜载体材料的可行性。 方法：(1)通过活体正位植入实验模型，观察直径10mm新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质材料(n=6)植入后1、1．5、2、3、4、5个月的组织病理变化，并采用神经银染法检测2种材料的神经再生状况；(2)将直径10mm新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质材料(n=6)植入到小鼠皮下组织内，同时以异种皮肤、异种羊膜分别为阳性和阴性对照(n=6)；术后15d、30d利用流式细胞仪检测受体外周血T淋巴细胞总数和亚群的变化；30d后取材进行组织病理学观察，并通过直接免疫荧光法检测植入材料内T淋巴细胞总数和亚群的变化。 结果：(1)直径10mm新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质材料正位植入后均可和植床组织透明愈合，5个月内未发生免疫排斥反应；受体植床的再生神经纤维分别于术后2个月和3个月长入新鲜材料和脱水材料边缘，但形态走向异常；术后4个月，2种材料周边区神经纤维的数量明显增加，可见神经纤维束和神经纤维丛再生，部分象限中央区也可见神经纤维再生；术后5个月，再生神经纤维形态走向开始改建。(2)直径10mm新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质材料异位植入术后15d、30d受体外周血流式细胞仪检测显示CD_4~+／CD_8~+发生变化，变化的程度和异种羊膜组无差异(e＞0.05)，但低于异种皮肤组的变化水平(P＜0.05)；组织病理学观察可见少量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润，未形成肉芽肿样结构，新鲜材料胶原纤维变性，脱水材料胶原纤维部分坏死；直接免疫荧光法检测可见少量CD_3~+细胞、CD_4~+细胞、CD_8~+细胞浸润，CD_4~+/CD_8~+的变化未达到异种皮肤组水平(P＜0.05)。 结论：直径10mm新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质材料组织相容性和免疫相容性好，易于神经再生，是较为理想的人工生物角膜载体材料。(本文来源于《暨南大学》期刊2006-05-01）
张超,金岩,聂鑫,胡丹,刘源[8]（2006）在《异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究》一文中研究指出目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0.25%胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料;将兔角膜组织块用胶原酶消化后,用含10%血清的DMEM培养液体外培养,并做波形丝蛋白,角蛋白免疫组织化学染色检测;将培养的兔角膜基质细胞的2~3代接种在材料上,培养5d后,做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后,细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的叁维网格状结构,网状间隙明显增大,利于细胞生长;体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性;HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖,可进一步用于组织工程角膜的研究。(本文来源于《眼科研究》期刊2006年02期）
徐锦,吴静,王智崇,姚晓明,罗小玲[9]（2006）在《异种角膜基质的系列研究》一文中研究指出[目的]研究异种角膜基质的特性及其应用的可能。 [方法](1)应用半定量分析检测异种角膜基质的免疫原性,并比较了鸡、兔和猪角膜基质的抗原性;(2)应用带屈光度异种角膜基质进行人→猴和猴→人的移植;(3)以冷冻脱水保存的角膜基质作载体培养兔角膜上皮和内皮细胞,进行实验性移(本文来源于《第九届全国眼表及角膜病学术大会暨第二届国际角膜病学术研讨会论文汇编》期刊2006-04-01）
陈根云,吴静,徐锦堂,赵松滨[10]（2006）在《异种角膜基质异位植入后免疫病理学研究》一文中研究指出目的观察异种角膜基质异位植入后的免疫病理变化,评价其免疫相容性。方法将一定大小的新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质植入到小鼠皮下组织内,同时以异种皮肤、假手术为阳性和阴性对照;术后1个月取材进行组织病理学观察,并通过免疫荧光细胞化学法检测植入材料内T淋巴细胞总数和亚群的变化。结果新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质皮下植入后1个月,可见少量的淋巴细胞、巨噬细胞、CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞浸润,且CD4+细胞多于CD8+细胞,但未达到阳性对照水平(P<0.05)。结论异种角膜基质异位植入后早期局部未引发免疫排斥反应,免疫相容性好。(本文来源于《眼科研究》期刊2006年01期）
异种角膜基质论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
角膜是构成眼屈光间质的重要组成部分,同时也是重要的天然防御屏障。目前,全球约有超过1000万人承受着角膜盲的痛苦。迄今为止,同种异体角膜移植是治疗角膜盲最有效的手段。然而,由于供体材料的匮乏,远远满足不了角膜盲患者的需求。因此,寻找有效的角膜替代物用于角膜移植,是目前眼科界亟待解决的问题。早期的角膜替代物研究多集中于人工角膜(Keratoprosthesis),有些已应用于临床,然而因生物相容性差、术后并发症较多等原因,限制了其在临床的应用。组织工程人工角膜是近年来研究热点,由种子细胞和可降解支架材料经体外构建而成,可最大程度地模仿天然角膜结构和功能。国内外已有学者采用天然或人工合成材料进行组织工程角膜构建,取得了较大进展,但因该构建物机械力学性能不足以及光学特性不佳等原因仅能用于基础研究。有报道证实,采用天然的材料如动物或人胶原制作支架可以增强其生物相容性。一些异种来源的细胞外基质己成功用于构建人工器官,如皮肤、心脏、血管等。我们课题组前期研究也证实,0.5% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)处理的脱细胞猪角膜基质(Acellular Porcine Cornea Matrix, APCM)具有较好的透光性、力学性能、生物安全性及生物相容性,细胞及遗传物质被去除的同时,角膜的天然结构得到了良好的保留。然而,APCM能否应用于组织工程人工角膜构建并用于移植是本研究的重点和难点。鉴于角膜板层移植是治疗一些常见角膜病的有效手段,同时能够避免角膜内皮损伤和排斥,本研究主要开展了以异种脱细胞角膜支架进行组织工程兔角膜前板层构建的研究,并成功进行动物角膜板层移植,取得了较好的效果,目前国内外尚无类似研究报道。第一部分兔角膜细胞的培养及APCM的制备[目的]探讨应用无血清培养基KSFM培养兔角膜上皮、基质及内皮细胞的可行性,同时对脱细胞方法进行改良以制备APCM用于组织工程人工角膜前板层构建。[方法]1.兔角膜细胞的原代培养：无菌条件下获取新西兰大白兔眼角膜,仔细去除虹膜、结膜及多余巩膜,解剖显微镜下撕下内皮层用于组织块培养；将去内皮角膜组织置于2.4U/ml DispaseⅡ消化1h,获取角膜上皮片,经0.25%胰酶-0.02%EDTA获取上皮细胞悬液进行培养；剩余角膜基质剪碎成1mm×1mm大小,置于0.5mg/ml胶原酶I 37℃消化过夜,获取基质细胞悬液。将3种细胞各分为2组,即KSFM培养组和含10%FBS的DMEM/F12培养组,置于六孔板内培养,每种细胞每组3个孔,各接种8个板,观察各培养条件下的细胞形态,细胞计数法描记生长曲线；2. APCM的制备及去细胞效果检测：改良脱细胞制作方法,无菌条件下将处理后的新鲜猪角膜置于0.5%SDS溶液4℃振摇4h×6次,不含双抗PBS冲洗2h×8次,含双抗PBS冲洗1h×3-6次获取无菌APCM,进行以下检测：1)H.E.及DAPI检测脱细胞角膜基质内细胞及遗传物质的残留；2)MTT实验检测材料浸提液对角膜上皮、基质及内皮细胞生长曲线的影响；3)电镜观察材料的结构及有无细胞残留。[结果]1.1)KSFM组：培养2d,上皮细胞形成克隆团,基质细胞贴壁呈树枝状,内皮细胞未见爬出；培养7d,上皮细胞紧密连接呈片状(密度达到90%-100%),基质细胞呈树枝状(密度达70-80%),内皮细胞连接紧密,形态不规则；传代后,细胞生长缓慢或不生长,漂浮细胞较多；2)含10%FBS的DMEM/F12组：培养2d,上皮细胞形成克隆团,基质细胞呈梭形,内皮细胞可见有少量细胞爬出；培养5d,上皮呈鹅卵石样已达60%密度,基质细胞呈梭形达70-80%密度,可见大量内皮细胞从内皮片组织周边爬出,呈不规则状；上皮和基质细胞培养7d传代,内皮细胞培养10d后传代,生长状态均良好,基质细胞可传10代。KSFM培养的上皮和基质细胞的生长曲线与含血清培养基相比差异有统计学意义(P<0.05)。2.MTT实验证实APCM浸提液对角膜上皮、基质及内皮细胞生长曲线无影响(P>0.05)；H.E.及DAPI证实材料内无细胞成分残留；电镜示材料结构完整,胶原排列整齐。[结论]KSFM可用来培养角膜上皮、基质及内皮细胞,但细胞生长较缓慢,易死亡；APCM经改良的脱细胞方法处理效果良好,可用来进行组织工程人工角膜构建。第二部分组织工程兔角膜前板层的体外构建[目的]探讨以APCM为支架体外构建含角膜上皮和基质细胞的组织工程兔角膜前板层的可行性。[方法]解剖显微镜下获取含前弹力层的APCM薄片(厚约1-2mm、直径7mm),置于培养基内37℃下浸泡24h,以备接种细胞。胰酶消化获取3代兔角膜基质细胞悬液,调整细胞终浓度为5×105/ml,应用1ml胰岛素空针平行于APCM前弹力层平面,将1ml基质细胞悬液沿着材料边缘接种于内静置培养24h,而后置于摇床上振摇培养7d；将1代角膜缘上皮细胞以5×103/mm2的密度接种于构建物表面,等待2h待细胞贴附于材料表面后,轻轻添加培养基静置再培养7d,构建同时含角膜上皮和基质细胞的组织工程兔角膜前板层。将接种基质细胞培养8d后的构建物再贴壁培养7d,观察有无细胞从角膜周边爬出,间接鉴定构建物内基质细胞活性；分别于3d、8d、15d取材进行H.E.染色,观察构建物细胞生长情况及组织结构；免疫染色检测角膜上皮细胞特异性标志物CK3和基质细胞标志物Vimentin的表达；取15d构建物标本分别进行免疫染色检查和扫描电镜观察。兔角膜前板层的叁维构建过程均采用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养。[结果]构建物再贴壁培养5d,可见有大量基质细胞爬出,间接证实材料内细胞活性。H.E.染色示构建物结构完整,未见明显的结构改变,胶原纤维间隙较大：3d,可见基质内有细胞生长,密度分布不均匀,胶原排列较规则；8d,可见基质内生长大量细胞,密度较均匀,胶原纤维间隙较大,排列整齐；15d,材料内仍分布大量细胞,表达基质细胞标志物Vimentin,密度较均匀,材料表面有2-3层细胞,表达上皮细胞标志物CK3,胶原排列整齐,纤维间隙较大。扫描电镜示胶原纤维水肿膨胀明显,部分区域见有胶原纤维断裂,胶原排列较整齐,可见有梭形的基质细胞附着生长。经过100%无菌甘油脱水,构建物能够恢复透明,表明APCM经过细胞接种再培养过程,叁维结构保持良好。[结论]APCM可用于组织工程人工角膜的构建；构建物具有正常兔角膜的表型,且脱水后能恢复透明,验证了该叁维培养方法的可行性,为兔角膜全层和人角膜的构建奠定了实验基础。第叁部分组织工程兔角膜前板层的动物移植实验[目的]初步探讨体外构建的兔角膜前板层体内移植后的生物学功能。[方法]1.5～2 kg新西兰大白兔20只随机分为两组,即构建物移植组和APCM空支架组,每组10只,各组均以右眼做术眼,左眼做阴性对照。术前3d术眼滴用抗生素,3%戊巴比妥钠(1ml/kg)经耳缘静脉进行麻醉,含庆大霉素生理盐水冲洗结膜囊,制备6.5mm直径大小角膜植床,采用国产10-0尼龙线对位缝合7mm直径大小植片至植床(共16针),并覆盖羊膜,结膜下隔日注射庆大霉素及地塞米松,合并应用典舒眼水(3次/天),构建物移植组术后1个月拆线。分别于1d、3d、7d、14d、21d、28d观察以下指标：结膜充血、水肿、分泌物,角膜水肿、混浊、浸润、新生血管、炎症反应,荧光素染色观察角膜上皮的完整性；术后5周进行活体共聚焦检查；于1周、2周、4周取材经4%多聚甲醛及3%戊二醛固定,分别进行组织学检查及扫描电镜观察。[结果]1.构建物移植组：术后1周,羊膜脱落,结膜轻度充血水肿,角膜上皮已覆盖大部分植片,未见有角膜新生血管,虹膜纹理可见,组织学检查见植片内胶原排列规则整齐,有少量细胞分布,植片与植床边界清晰,材料表面可见1～2层上皮细胞；术后2周,结膜轻度充血,中央角膜轻度混浊,未见有新生血管,植片表面有小部分区域上皮缺损,但可见虹膜纹理,组织学检查见材料表面分布有类似正常角膜的上皮结构,植片内部结构完整,胶原排列规则整齐,有细胞分布；术后4周,结膜充血水肿加重,植片表面不光滑,但较透明,可见角膜新生血管分布在周边区域,上皮已覆盖大部分植片,虹膜纹理可见,组织学检查同术后2周,扫描电镜示植片表面上皮排列与正常角膜已无明显差异；术后5周(已拆线1周),结膜充血水肿消失,植片区域角膜较透明,有轻微瘢痕形成,大部分新生血管已退去,虹膜纹理清晰,植片区域可见点状荧光素着色,激光共聚焦显示术眼角膜内皮密度及形态均正常。2. APCM空支架组：术后4周内角结膜反应情况相似于构建物移植组,但上皮始终无法完全覆盖植片表面,中央角膜呈现中度混浊状态,但仍可透见虹膜。组织学检查见植片胶原排列较规则,无明显结构改变,但与受体角膜分界明显；植片表面可见有上皮细胞生长,但不同于正常上皮结构；术后3周内,材料内均无细胞分布,而在术后第4周材料内部开始出现少许细胞。术后5周(未拆线)出现植片大量溶解现象,角结膜反应较重。[结论]体外构建的兔角膜前板层可用于板层移植,具有一定的组织修复能力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
异种角膜基质论文参考文献
[1].魏利娜,邵安良,黄立静,程祥,陈亮.去细胞异种角膜基质与去细胞异种结膜基质的免疫原性研究[J].药物分析杂志.2019
[2].庞鵾鹏.以异种脱细胞角膜基质构建组织工程兔角膜前板层的实验研究[D].山东大学.2011
[3].徐锦堂,陈建苏,吴静,罗小玲,潘红卫.异种角膜基质的研究现状及问题[J].眼科新进展.2010
[4].刘先宁,朱秀萍,银勇,吴洁,杨华.以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织[J].国际眼科杂志.2008
[5].傅瑶,陈苹,范先群.异种角膜脱细胞基质和几丁糖载体构建角膜基质层的比较[J].眼科研究.2006
[6].吴静,郝念,李姝燕,徐锦堂,王彦平.异种角膜基质作为生物角膜载体的免疫学研究[J].眼科新进展.2006
[7].陈根云.直径10mm异种角膜基质生物相容性及神经再生研究[D].暨南大学.2006
[8].张超,金岩,聂鑫,胡丹,刘源.异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究[J].眼科研究.2006
[9].徐锦,吴静,王智崇,姚晓明,罗小玲.异种角膜基质的系列研究[C].第九届全国眼表及角膜病学术大会暨第二届国际角膜病学术研讨会论文汇编.2006
[10].陈根云,吴静,徐锦堂,赵松滨.异种角膜基质异位植入后免疫病理学研究[J].眼科研究.2006