一、人原发性胆囊癌细胞系SGC-996的建立（论文文献综述）
苏婷婷[1]（2020）在《吡咯替尼对胆囊癌NOZ、SGC-996细胞系增殖、侵袭、迁移和凋亡作用的研究》文中研究说明研究背景:胆囊癌（gallbladder carcinoma,GBC）是消化系统中发病率第5位,病死率较高的恶性肿瘤。近年来我国胆囊癌发病率呈上升趋势,每年新发病例数约5万例。临床上对于胆囊癌的治疗首选根治性手术切除,但由于该病早期无特异临床表现,发现较晚,发现时常伴局部及远端转移,随后病情发展迅速,预后极差,因此针对胆囊癌的放、化疗,分子靶向治疗等综合治疗逐渐成为胆囊癌的主要治疗手段。随着化疗药物在实体肿瘤中的广泛应用,其在晚期胆囊癌治疗中起了一定作用。目前胆囊癌的化疗方案以吉西他滨+铂类联合化疗为主,尽管化疗可增加肿瘤的可切除性和生存率,然而中位生存期仍不足15个月,因此,寻找新的治疗手段对胆囊癌的防治有重要的临床意义。近年来,分子靶向治疗利用特异性阻断剂干扰肿瘤细胞表达的某种信号分子,抑制肿瘤生长和侵袭,从而达到肿瘤治疗效果,如用于治疗胃癌的阿帕替尼、治疗甲状腺癌的仑伐替尼在临床实验中都取得了很好的疗效。目前已知与胆囊癌相关的靶点有血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子受体（EGFR）家族等,针对这些靶点已有吉非替尼,厄洛替尼,贝伐珠单抗等靶向药物进入临床研究,但治疗效果仍不理想。吡咯替尼（Pyrotinib）是在我国新批准上市用于治疗ErbB2/HER2阳性乳腺癌的靶向化疗药物,该药通过结合并抑制人表皮生长因子受体2（ErbB2/HER2）的靶点,进一步引起下游信号通路的改变抑制肿瘤细胞生长,目前该药物在胆囊癌中的应用国内、外尚无研究报道。随着第二代基因测序技术发展,大量研究报道了胆囊癌组织存在ErbB2基因的异常表达,在此基础上,有实验研究对胆囊癌NOZ和SGC-996等细胞系进行该基因沉默表达,结果发现肿瘤细胞的生长受到抑制,这些数据显示了ErbB2的致癌潜力,在细胞实验水平靶向减少该基因的表达,可初步抑制肿瘤细胞的生长,因此本研究拟探究吡咯替尼对胆囊癌细胞系的杀伤作用,并为进一步研究其可能作用机制。目的:探究吡咯替尼对胆囊癌NOZ、SGC-996细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭作用的影响。方法:CCK-8实验测量用不同浓度吡咯替尼处理胆囊癌NOZ、SGC-996细胞系24小时、48小时和72小时后的吸光度值变化,计算抑制率和半数抑制浓度(IC50),随后选择48小时计算所得的抑制率在25%,50%,75%所对应的药物浓度作为后续细胞实验的给药浓度处理细胞。细胞克隆形成实验探究吡咯替尼对胆囊癌细胞增殖的影响。Transwell实验用于观察迁移和侵袭改变。流式分析凋亡细胞比率,以及western blot分析凋亡相关蛋白表达。结果:1.吡咯替尼抑制胆囊癌细胞增殖:用CCK-8实验检测吡咯替尼对NOZ、SGC-996细胞活力的影响。用吡咯替尼处理后的NOZ、SGC-996细胞的活力随处理浓度增加,细胞活力逐渐下降,同时随着吡咯替尼作用时间延长,细胞活力呈明显下降趋势。在加药后48小时,细胞抑制率随加药浓度升高从20%升高到70%;对于NOZ和SGC-996细胞在24h、48h和72h的IC50分别是:11.5μmol/L,3.6μmol/L,1.4μmol/L和5.5μmol/L,5.2μmol/L,2.4μmol/L。差异具有统计学意义（P<0.05）。2.吡咯替尼对胆囊癌细胞克隆形成能力的影响以及对细胞增殖转移的影响:进行克隆形成实验以测定单细胞增殖能力。吡咯替尼处理后引起胆囊癌细胞集落形成能力呈现剂量依赖性降低,此外,处理组中形成的集落数量和大小均明显小于对照组。上述结果证明了吡咯替尼可抑制胆囊癌细胞的活力和增殖能力（P<0.05）。3.吡咯替尼对胆囊癌细胞侵袭和迁移能力的抑制作用:Transwell小室实验分析表明,与对照组相比,用吡咯替尼处理12小时后,穿过带基质胶和不带基质胶的Transwell小室膜的细胞数随处理浓度增加减少。以上结果证明吡咯替尼抑制胆囊癌NOZ、SGC-996细胞的侵袭和迁移能力（P<0.05）。4.吡咯替尼诱导胆囊癌细胞发生凋亡:为探讨吡咯替尼对胆囊癌细胞凋亡的影响,用前述浓度处理胆囊癌NOZ、SGC-996细胞48小时后,使用流式细胞仪分析了细胞凋亡率。在双参数散点图中,LL象限代表活细胞,LR和UR象限分别代表早期凋亡和晚期凋亡细胞。随着吡咯替尼处理浓度的增加,存活的细胞百分比减少,而早期凋亡和晚期凋亡的细胞数均增加,这些数据均表明吡咯替尼诱导胆囊癌细胞发生凋亡。为了进一步研究吡咯替尼诱导细胞凋亡的机制,我们通过Western blot检测了caspase家族,Bcl-2家族和其他在凋亡过程中期起关键作用的重要蛋白表达结果表明,吡咯替尼增加了Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP和Bax的表达,同时降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外,Bcl-2与Bax的比例呈剂量依赖性降低趋势（P<0.05）。结论:吡咯替尼在体外能够抑制胆囊癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭,通过促进凋亡发挥了细胞杀伤作用,为胆囊癌的分子靶向药物临床治疗提供了新的选择。
袁波[2]（2019）在《胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定》文中进行了进一步梳理第一部分胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定研究背景及目的:胆囊癌（gallbladder cancer,GBC）是最常见的胆道恶性肿瘤,约占胆道癌的80%90%。在消化系统常见恶性肿瘤中,胆囊癌占第六位。胆囊癌的发病率在不同地区存在差异,亚洲发病率较高,所以胆囊癌的防治在我国具有十分现实的意义。由于症状和体征均呈现非特异性,胆囊癌常在胆囊切除术后才明确诊断或长期误诊为良性胆囊疾病而未获得及时诊治,多数情况下发现时已处于中晚期。此外,由于靠近胆囊床的肝脏侧无浆膜包绕,胆囊癌易出现肝脏浸润及转移,且极易沿肝十二指肠韧带淋巴结转移,胆囊癌患者预后极差。据统计,胆囊癌患者的平均总生存期为6个月,而5年生存率仅为5%[1]。手术是目前可能治愈原发性胆囊癌的唯一手段[2]。但由于往往发现过晚,已出现转移,手术切除率低,而其他综合性治疗如化疗等,效果不肯定[3]。肿瘤分子靶向治疗代表着更有效、更有针对性的药物治疗的方向。现在多种分子靶向药物已广泛用于肿瘤治疗,并在部分肿瘤患者体内取得了显着的疗效。但由于可供使用的细胞模型和动物模型非常缺乏,针对胆囊癌的药物研发和筛选研究进展缓慢。因此寻找新的胆囊癌实验模型,已成为比较迫切的现实需求。类器官（Organoid）是一种三维细胞培养体系,其与原代来源的器官相似度极高,是疾病机理研究和药物筛选的理想平台,也是极重要的前沿研究领域。肿瘤类器官是利用肿瘤患者细胞直接在体外构建成的三维肿瘤。近几年,肿瘤类器官迅猛发展,为肿瘤治疗带来了新的曙光。目前已经成功从原发结肠癌、前列腺癌、胰腺癌获得类器官。将这些肿瘤类器官模型与个人化肿瘤基因组信息相关联将极大的加速肿瘤恶性演化、肿瘤研究药物敏感性等研究的进程[4]。目前,针对消化道肿瘤的类器官研究虽有少量报道,但仍存在肿瘤类器官例数少、稳定性差和不具有中国人群遗传特征等方面的问题。迄今为止,尚未有胆囊良恶性肿瘤类器官培养的相关报道。我们尝试利用胆囊良恶性肿瘤患者手术切除新鲜标本,构建胆囊良恶性肿瘤类器官的培养体系,并针对类器官进行形态、肿瘤标志物及基因组方面的鉴定,以期为进一步深入研究胆囊良恶性肿瘤的分子生物学机制,特别是由瘤至癌的演变,以及临床精准治疗,提供一个新的平台。研究方法:1、于2017年12月至2018年12月共纳入东方肝胆外科医院收治的胆囊腺瘤及胆囊癌患者共46例,收集患者手术切除的新鲜肿瘤组织,分成三部分以完成类器官培养、冰冻组织供转录组测序以及病理石蜡切片作形态学鉴定。收集患者外周血以提取白细胞,供全基因组测序。2、肿瘤类器官培养主要步骤:新鲜标本充分洗涤、剪碎后,加入特定消化液,于37℃孵育消化30分钟至3小时,每2000-5000个细胞用DMEM/F12培养基25μl重悬,加入液态Matrigel,混匀后于37℃聚合,加入合适培养基,放入37℃无菌培养箱培养。传代:按1:2或1:3进行。冻存:先用细胞修复液融解Matrigel,再加入无血清细胞冻存液。复苏:从低温中取出冻存细胞快速溶解,再用Matrigel重新包被聚合,加入合适培养基培养。3、培养成功后,进行鉴定。（1）形态学鉴定:将类器官细胞予包埋、石蜡切片。显微镜下观察形态并与普通病理组织对比。（2）免疫荧光染色检测肿瘤标志物:类器官细胞免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜拍照。主要标志物有胆系标志物CK7;干性标志物CD133;胆囊癌常见肿瘤标志物Erb B2,C-myc等。（3）类器官行转录组及全基因组测序。研究结果:1、总共收集46例手术标本,其中5例胆囊腺瘤,41例胆囊恶性肿瘤,包括38例胆囊腺癌,而胆囊鳞癌、胆囊淋巴瘤及胆囊腺癌-神经内分泌混合癌各1例。培养成功标准为细胞数量>1*106或可传代6代以上[5]。2、组织消化所需要消化液及消化时间的选择:消化液的组成为Collagenase II（1mg/ml）+Dispase II（0.3mg/ml）+DNAse I（100ug/ml）。消化时间:胆囊腺瘤消化时间控制在0.5小时-1小时。胆囊腺癌分两种情况,如为腺瘤癌变所致,消化时间可1小时-2小时,而其他类型腺癌则含多量纤维组织,消化时间可适当延长,但不宜超过7小时,否则容易组织坏死。3、在正式选取胆囊腺瘤及胆囊癌行类器官培养之前,我们尝试用正常胆囊上皮进行类器官培养,以优化培养体系和培养流程。确定了包括DMEM/F12培养基、Glutamax、Hepes缓冲液、N-acetylcysteine、nicotinamide、B27、N2、三抗及Primocin为基本构成的培养基组分;良性肿瘤（腺瘤）类器官培养时,添加:Wnt3a、EGF、FGF10、Noggin、R-spondin-1、Gastrin、A8301、Foskolin、Dexamethasone等。恶性肿瘤（腺癌）类器官培养为全培养基去除Wnt3a、R-spondin-1等。4、胆囊腺瘤培养成功率60%（3/5）。2例送检后续类器官转录组及全基因组测序。培养基组分与正常胆囊上皮类器官相同。第1次传代为培养第7-10天,此后每10-15天传代1次,按1:2或1:3传代。镜下见胆囊腺瘤类器官为大小不一的3D椭圆形或类圆形结构,形态较为规则。5、胆囊恶性肿瘤培养成功率14.6%（6/41）,另3例其他类型恶性肿瘤未能培养成功。3例腺癌类器官送检后续类器官转录组及全基因组测序。第1次传代为培养第7-23天,平均第15天,此后每10-20天传代1次,按1:2或1:3传代。镜下大体所见胆囊腺癌类器官为大小及形态均极度不规则细胞团,呈3D结构生长。6、肿瘤类器官培养过程中,为避免出现混入的正常上皮组织形成的生长优势现象,我们的处理:一是在取材中严格把握,尽量选取肿瘤组织而不附带正常胆囊上皮;二是在剪切前尽量去除可疑的正常上皮组织;三是在培养过程中,如果有孤立的、巨大球形上皮类器官细胞团,可在显微镜下行上皮类器官穿刺抽吸以去除。7、Matrigel重聚合时机:一为类器官数量超过100-150/孔,应及时传代,同时即相应完成重聚合;二是Matrigel出现崩解;三是显微镜下观察Matrigel出现消耗过度的情况。8、胆囊癌肿瘤类器官的形态学鉴定:类器官石蜡切片与原代组织石蜡切片比较,大体镜下形态相似,正常胆囊上皮、胆囊腺瘤及胆囊腺癌均与来源组织形态保持一致。9、类器官肿瘤标志物测定:类器官行免疫荧光染色提示相关标志物CK7,CD133、Erb B2及C-myc均有表达,提示类器官来自于胆系干细胞,且与胆囊癌常见肿瘤标志物表达一致。10、类器官转录组及全基因组测序结果显示,类器官与原代肿瘤组织之间基因表达谱、胚系突变及体细胞突变的相似度均比较好。研究结论:根据上述实验结果,我们初步构建了胆囊腺瘤及胆囊腺癌病人来源的类器官培养体系,明确了胆囊良恶性肿瘤类器官培养从新鲜标本收集、消化、Matrigel聚合以至传代、保存、复苏等整套流程,确立了针对良性及恶性肿瘤不同的培养基组分。在胆囊腺瘤中,类器官培养成功率达60%,胆囊恶性肿瘤类器官培养成功率达到14.6%。同时,针对培养出的类器官,分别进行形态、肿瘤标志物及基因组等方面的鉴定。胆囊癌类器官形态与原代肿瘤相似,且保留3D结构而非平面结构,表达胆系及干性、胆囊恶性肿瘤标志物,同时测序结果提示肿瘤类器官与原代肿瘤组织相似度较好。综上所述,我们成功构建胆囊良恶性肿瘤类器官模型,为后续胆囊癌的分子机制研究及药物筛选,提供了很好的平台。第二部分睫状神经营养因子受体通过MAPK/ERK通路抑制胆囊癌转移研究背景及目的:胆囊癌（GBC）是世界范围内最具侵袭性的恶性肿瘤之一,极易出现肝或邻近器官局部浸润、淋巴转移或腹腔转移,导致发现时已处于中晚期而失去手术机会。对于胆囊癌这种具有侵袭性生物学行为和预后不良的肿瘤,发现其转移的机制并确定潜在的治疗靶点以改善临床预后至关重要。肿瘤细胞侵袭和转移的过程及机制较为复杂,主要的影响因素包括:促进细胞黏附、降解细胞外基质等。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）是一类可以降解细胞外基质的蛋白酶,在肿瘤转移过程中十分重要。睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophic factor,CNTF）是白介素-6家族成员,其受体为睫状神经营养因子受体（Ciliary neurotrophic factor receptor,CNTFR）,包括CNTFR-α、LIFR-β和gp130三种亚基,其中CNTFR-α是其核心亚基。长期以来,关于CNTF及CNTFR的研究,多集中于神经系统及运动系统损伤后修复方面。近年来,这两者在恶性肿瘤中的作用逐渐得到重视。但CNTFR及CNTF在胆囊癌中的表达情况,以及两者是否在胆囊癌的发生、发展过程中起作用,尚未有报道。我们在胆囊癌类器官培养过程中,转录组测序结果发现睫状神经营养因子受体CNTFR在胆囊癌及正常胆囊上皮中表达有显着差异,而CNTF表达无差异（未发表数据）。我们设想CNTFR在胆囊癌中可能发挥了一定作用。由此,在本研究中,我们进一步检测了胆囊癌及癌旁组织中CNTFR和CNTF的表达,并分析了其表达与胆囊癌患者临床特征和预后的关系。随后通过肿瘤细胞生物学及动物体内实验进一步对CNTFR在胆囊癌中的作用及分子机制进行研究。我们期望通过对CNTFR调控胆囊癌的分子通路的研究,为胆囊癌的临床干预,特别是抑制其侵袭转移,提供新的靶点。研究方法:1.收集胆囊癌及癌旁新鲜组织标本,检测癌及癌旁CNTF和CNTFR的m RNA、蛋白表达水平。2.收集152例有随访资料的胆囊癌患者肿瘤组织病理切片,通过免疫组化染色检测胆囊癌及癌旁组织中CNTFR及CNTF的表达情况。统计分析CNTFR及CNTF表达与患者临床特征和预后的关系,借以判断CNTFR及CNTF在胆囊癌的恶性进展中是否发挥作用。3.用慢病毒转染方法在NOZ及SGC-996两株胆囊癌细胞株中建立CNTFR过表达细胞系,体外检测CNTFR过表达后对胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响,并在脾注射肝转移模型中检测CNTFR对胆囊癌细胞转移能力的影响。4.将过表达CNTFR的两株细胞系作转录组测序,并分析CNTFR调控的关键信号通路或节点分子。5.通过Western Blotting等方法对相关激酶和蛋白进行检测,进一步验证CNTFR对胆囊癌细胞中信号通路的调控。6.使用抑制剂特异阻断关键信号通路,检测CNTFR对胆囊癌细胞的调控是否依赖于特定的信号通路。研究结果:1.在20例胆囊癌及癌旁新鲜组织标本中,CNTFR m RNA表达水平明显低于癌旁组织（P<0.01）。而CNTF m RNA表达水平与癌旁相比,没有显着性差异（P=0.108）。蛋白检测结果一致。2.152例胆囊癌石蜡病理切片的免疫组化结果表明CNTFR在胆囊癌组织中表达明显降低,而癌旁组织中有较高水平表达。CNTF在胆囊癌与癌旁组织中的表达没有明显差异。3.在152例胆囊癌患者的病理切片中,CNTFR的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及TNM分期无关,而与淋巴结转移和远处转移密切相关。单因素生存分析提示CNTFR的表达与胆囊癌总生存率相关。多因素生存分析提示CNTFR表达与远处转移是胆囊癌预后的独立危险因素。4.CNTFR对胆囊癌细胞增殖无明显影响,但对癌细胞的迁移及侵袭能力有显着抑制作用。体内实验亦得出相同结论。5.测序结果发现丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路在两株细胞系的差异性通路排名中均靠前。WB结果显示P38、AKT及STAT3的磷酸化水平及总蛋白表达在对照及过表达CNTFR细胞中均无明显变化,而ERK蛋白磷酸化在过表达CNTFR细胞中明显受抑制。同时,MAPK调控的迁移转移相关蛋白MMP1及MMP10在过表达CNTFR细胞中亦明显下调。6.用ERK抑制剂SCH772984处理细胞后,对照细胞和过表达CNTFR细胞内ERK的磷酸化水平均下调,同时两种细胞的迁移侵袭能力亦被抑制,对照组细胞和过表达组细胞间无明显差异。这表明在胆囊癌细胞中CNTFR通过影响MAPK/ERK通路抑制细胞的侵袭转移能力。研究结论:1.胆囊癌中存在CNTFR及CNTF的表达。胆囊癌中CNTFR的表达明显比癌旁组织低。CNTF在癌及癌旁组织中表达无明显差异。2.CNTFR表达与胆囊癌患者的淋巴转移和远处转移密切相关,且CNTFR的高表达预示着胆囊癌患者的较好预后。CNTFR是潜在的胆囊癌预后判断分子。3.CNTFR对胆囊癌细胞的侵袭转移具有抑制作用,这一作用是通过抑制MAPK/ERK通路的磷酸化,进而抑制下游MMP1及MMP10这两种基质金属蛋白酶的表达来实现的。
黄新策[3]（2019）在《circERBB2调控核糖体DNA转录促进胆囊癌细胞增殖》文中指出目的胆囊癌是预后最差的肿瘤类型之一。研究发现环状RNA在多种恶性肿瘤中起重要作用。我们希望通过胆囊癌组织表达谱测序,了解胆囊癌发生过程中环状RNA的变化,寻找影响胆囊癌发生发展的环状RNA分子,为胆囊癌治疗提供新的靶点。方法我们收集了10对胆囊癌和癌旁组织,通过表达谱测序,检测了mRNA、miRNA、lncRNA和环状RNA的表达。通过分析差异基因发现环状RNA分子circERBB2在胆囊癌中表达量显着上升。通过siRNA和CRISPR-cas9技术敲低circERBB2,研究了circERBB2的体外体内功能。另外,我们构建了circERBB2的过表达载体进行回补实验。通过FISH实验,明确了circERBB2的亚细胞定位。通过qPCR、双荧光素酶报告基因等实验,我们研究了circERBB2对核糖体RNA转录和加工的影响。通过RNA pulldown实验,探索了circERBB2相互作用蛋白谱,从中寻找介导circERBB2功能的蛋白。通过Western blot等实验,探索了circERBB2对下游蛋白功能的影响。我们将收集的149例原发性胆囊癌标本并制成组织芯片,检测了各病人circERBB2的表达情况,分析了circERBB2对胆囊癌病人的预后的影响。结果胆囊癌和癌旁组织的环状RNA表达谱存在显着差异。在胆囊癌中,环状RNA的总体表达量显着下降,同时环状RNA和同源的mRNA较癌旁组织具有更好的相关性。我们发现circERBB2在胆囊癌中表达显着上升。circERBB2能促进胆囊癌细胞的体内体外增殖。circERBB2在胆囊癌细胞核仁内富集,提示circERBB2可能和核糖体RNA的生成相关。敲低circERBB2后,胆囊癌细胞的核糖体RNA前体水平显着降低,提示circERBB2和核糖体DNA的转录相关。RNA pulldown实验找到了一系列circERBB2潜在的相互作用蛋白。我们发现PA2G4蛋白可能介导了circERBB2的功能。circERBB2能促进PA2G4在核仁中的定位,而PA2G4在核仁中通过和TIFIA相互作用,促进核糖体DNA转录和细胞增殖。circERBB2和胆囊癌病人预后显着相关（p<0.05）,高表达circERBB2的病人预后显着差于低表达的病人。结论胆囊癌中环状RNA表达谱发生了显着变化;circERBB2在胆囊癌中表达量显着升高。circERBB2促进胆囊癌核糖体DNA的转录,从而促进细胞增殖。circERBB2通过和PA2G4蛋白作用,形成circERBB2-PA2G4-TIFIA的调控轴,调节胆囊癌细胞RNA聚合酶I活性和核糖体转录,进而调节细胞增殖。circERBB2的高表达提示胆囊癌病人预后较差。
林卫国[4]（2019）在《ARAF基因沉默对胆囊癌恶性表型的影响》文中研究说明目的:明确胆囊癌与正常胆囊中ARAF基因的表达差异,探讨该基因对胆囊肿瘤恶性表型的调控作用,为临床治疗该疾病提供新的理论依据。临床资料与方法:连续收集绍兴市人民医院2018年2月至9月经病理学检查证实的胆囊癌患者肿瘤组织及胆囊息肉患者息肉旁正常胆囊组织各12例。以RT-qPCR及Western blot检测两组组织中ARAF mRNA和编码蛋白的表达水平。构建ARAF siRNA组和siRNA control组胆囊癌细胞,以细胞增殖实验、增殖细胞核抗原蛋白（PCNA）检测、集落形成实验验证ARAF对其增殖能力的调控作用;以划痕实验、transwell实验验证ARAF对其迁移、侵袭能力的调控作用;以化疗耐药实验验证ARAF对其化疗敏感性的影响。最后通过建立移植瘤动物模型,研究在体条件下,ARAF异常表达对胆囊癌生长的影响。对实验数据行Student’st-检验,比较统计学差异。结果:实验结果显示,胆囊癌组织中ARAF mRNA表达水平与A-Raf蛋白含量显着高于非肿瘤组织（P<0.05）。相较siRNA control组,ARAF siRNA可有效降低胆囊癌细胞的增殖能力、PCNA蛋白表达量及集落形成数量（P<0.05）;胆囊癌细胞经转染ARAF siRNA后对顺铂与吉西他滨的药物耐受能力明显降低（P<0.05）;在划痕实验和transwell实验中,沉默ARAF致使胆囊癌细胞迁移和侵袭能力减弱（P<0.05）。此外,通过荷鼠成瘤实验进一步明确,ARAF siRNA组裸鼠的肿瘤体积与重量相较于对照组明显降低,这与体外实验结果一致（P<0.05）。结论:ARAF作为原癌基因在胆囊癌组织中表达上调。沉默ARAF基因能够抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,增强其对化疗药物的敏感性,并抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的生长。因此,ARAF基因可能是参与胆囊癌发生发展的原癌基因,并可作为临床治疗的潜在靶标。
张亦弛[5]（2017）在《Hsa-miR-99a-5p在胆囊癌中的功能与机制研究》文中研究指明研究背景胆囊癌是发病率较低但恶性程度极高的肿瘤,其发病率在消化道肿瘤中排第六位。目前根治性手术切除是唯一可能治愈胆囊癌的方法,但由于其早期缺乏特异性症状,大部分患者一经发现已至进展期,根治性切除率低,故预后极差,五年生存率不足5%。miRNA是一类小分子非编码RNA。它可以通过与靶基因的3’UTR区结合来参与对下游分子与信号通路的调控作用。miRNA在许多恶性肿瘤的发生发展过程中都扮演了至关重要的角色。方法1、通过前期的高通量miRNA芯片检测了胆囊癌组织以及其相应的癌旁正常组织中miRNA的表达情况,同时结合TCGA数据库的资料,筛选出miR-99a-5p作为研究对象。2、采取实时荧光定量PCR的方法检测了胆囊癌患者癌组织及其相应的癌旁组织中miR-99a-5p的表达情况,并分析miR-99a-5p与胆囊癌患者的临床病理资料以及预后的相关性。3、通过细胞功能学实验和体内动物实验研究miR-99a-5p对胆囊癌细胞的增殖和侵袭转移能力是否存在调控作用。4、通过生物信息学方法预测miR-99a-5p的靶基因,使用双荧光素酶报告基因试验检测miR-99a-5p是否与靶基因的3’UTR区产生作用,并用Western blot实验检测miR-99a-5p是否能在蛋白水平抑制靶基因的表达,同时判断miR-99a-5p是否对相关信号通路和EMT相关指标产生影响。5、用细胞功能学实验验证miR-99a-5p的候选靶基因SMARCA5在胆囊癌中的相关功能,并用回复实验验证miR-99 a-5p能够通过靶定SMARCA5实现抑制胆囊癌细胞侵袭和转移的功能。结果1、通过miRNA芯片分析结合实时荧光定量PCR验证,发现miR-99a-5p在胆囊癌患者癌组织中普遍低表达,且miR-99a-5p的低表达与胆囊癌患者的不良预后具有显着相关性;2、体内体外实验证明miR-99a-5p的过表达通过调控PI3K/AKT通路和EMT作用抑制了胆囊癌细胞的侵袭和转移功能;3、MTOR和SMARCA5确为miR-99a-5p的直接下游靶基因;4、SMARCA5能够促进胆囊癌细胞的侵袭和转移,且直接介导了miR-99a-5p抑制胆囊癌侵袭转移功能的作用。结论miR-99a-5p在胆囊癌患者癌组织中普遍低表达,通过靶基因MTOR、SMARCA5以及PI3K/AKT通路和EMT作用抑制了胆囊癌的侵袭转移功能,miR-99a-5p可能成为胆囊癌综合治疗的潜在靶点。
施骅,汪剑波,潘俊娣,叶斌[6]（2017）在《AG490对Janus蛋白酪氨酸激酶与信号转导和转录激活子3调控的胆囊癌SGC-996细胞株侵袭和转移的影响》文中指出目的探讨AG490对Janus蛋白酪氨酸激酶与信号转导和转录激活子3（JAK/STAT3）调控的胆囊癌SGC-996细胞株侵袭和转移的影响,并探讨其相关作用机制。方法采用MTT法检测50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L不同浓度AG490对SGC-996细胞活力的影响,Transwell评价AG490对胆囊癌侵袭转移能力,流式细胞术检测SGC-996细胞凋亡,Western blot检测SGC-996细胞JAK/STAT3通路相关蛋白表达。结果不同浓度的AG490对SGC-996细胞活力抑制率分别为（17.49±3.41）%、（38.66±4.57）%、（79.15±6.29）%,且随着浓度的增加细胞活力明显下降,与对照组的（1.39±0.21）%差异均有统计学意义（t=8.162、14.111、21.401,均P<0.01）。不同浓度的AG490降低SGC-996细胞转移抑制率[分别为（23.18±4.53）%、（51.75±6.46）%、（81.32±7.13）%],且随着AG490浓度的增加抑制侵袭转移能力增强,与对照组的（1.46±0.42）%差异均有统计学意义（t=8.269、13.455、19.366,均P<0.01）。不同浓度的AG490诱导SGC-996细胞的凋亡促进率分别为（13.34±4.33）%、（28.16±6.23）%、（53.61±8.74）%,且随着浓度的增加细胞凋亡增高,与对照组的（0.97±0.52）%差异均有统计学意义（t=4.913、7.533、10.414,均P<0.01）。不同浓度的AG490降低SGC-996细胞JAK/STAT3通路的ZFX、STAT3和Smad1蛋白表达,与对照组差异均有统计学意义(tZFX=2.154、3.041、4.185,tSTAT3=7.348、14.892、17.774,tSmad1=3.474、5.241、7.718,均P<0.05)。结论 AG490可抑制胆囊癌SGC-996细胞的侵袭和转移,且呈剂量依赖性,其作用机制可能与降低细胞凋亡和JAK/STAT3通路蛋白表达有关。
范跃祖[7]（2014）在《从胆囊癌的一种新血供方式——血管生成拟态看胆囊癌诊疗观点改变》文中研究指明从胆囊癌的一种新的血液供应方式——血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）论述胆囊癌诊疗观点的改变。1994.1—2000.12同济医院确诊的74例原发性胆囊癌标本及其临床病理学和人口统计学资料;H&E染色+CD31/PAS双重染色（Envision法）,胆囊癌VM（+）/（-）临床参数单/多因素、Cox模型风险和Kaplan-Meier生存分析+log-rank检验。细胞、动物实验:胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞二/三维培养,侵袭力、迁移力、VM形成测定和倒置光显微镜、透射/扫描电镜VM形态学观察以及动态磁共振荷瘤鼠胆囊癌移植瘤血流动力学检测。信号通道研究:胆囊癌细胞三维培养和裸鼠移植瘤VM组织切片的免疫组化、免疫荧光、Western blotting、QRT-PCR检测,以探讨相关信号通道。13.5%（10/74）胆囊癌存VM,其中4.3%（13/306）管腔内含红细胞,即胆囊癌VM是高倍光学显微镜下由胆囊癌细胞围成管腔、内衬癌细胞而非血管内皮细胞、有圈PAS阳性界膜分隔、腔内含红细胞的管道结构;VM（+）胆囊癌腺癌居多,有较高的血行转移机会;VM是影响胆囊癌患者预后的独立危险因素,有VM存在胆囊癌患者生存期短,预后差。体外胆囊癌GBC-SD细胞三维培养、荷瘤鼠胆囊癌石蜡切片经H&E染色和CD31/PAS双重染色,光/电镜观察,85.7%存在VM,其VM结构与临床结果一致;MRI增强扫描提示,荷瘤裸鼠胆囊癌移植瘤中心或瘤体周围存在VM血供而不致出现肿瘤坏死而呈现MRI强化信号。发现胆囊癌存在VM-相关PI3-K/MMPs/Ln-5γ2和Eph A2/FAK/Paxillin信号通路。高侵袭胆囊癌存在VM这一特殊生物学特性。因高侵袭胆囊癌VM不能被常规病理学检测,故建议对临床恶性程度高、易血行转移、预后差胆囊癌,常规开展胆囊癌标本CD31/PAS双重染色检查。对胆囊癌根治术后复发、辅助化疗+抗血管生成靶向疗效差者,应考虑存在VM,采取针对性的"抗血管生成拟态"辅助治疗。
常颜信[8]（2013）在《胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究》文中指出第一部分胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究研究背景和目的胆囊癌是胆系恶性肿瘤中最常见的肿瘤，近年来其发病率上升较快，其发病率在胃肠道肿瘤里占第5位。胆囊癌被认为是侵袭性和致死性最高的恶性肿瘤之一，其较强的侵犯特性使得胆囊癌即使行外科手术切除后预后也非常差。早期胆囊癌无症状或仅有上腹部不适感，发病隐匿，诊断困难，常被忽视或漏诊，至晚期可出现腹痛、黄疸及消瘦等症状，但多数患者已无手术机会，进展期胆囊癌预后效果较差，术后5年存活率约为5%。近几十年来关于胆囊癌的研究有了一定的进展，但是胆囊癌高转移、高侵袭特性的分子机制尚未被完全阐明。microRNA（miRNA）是一种只有18-22个碱基左右的小分子非编码RNA，通过转录后调控机制影响基因表达。miRNA几乎参与了与肿瘤相关的所有过程，包括增殖、分化、凋亡、转移、血管生成、免疫应答等，并且功能研究表明其在肿瘤中起着致癌或者抑癌基因的作用，在肿瘤的诊断、发生发展、预后中具有重要的意义。但是目前关于miRNA在胆囊癌中的相关研究未有系统报道。miR-20a定位在染色体13q31，是miRNA17-92簇的成员之一。研究表明17-92簇的miRNAs成员在多种肿瘤里起着癌基因的作用。但是，miR-20a却鲜见研究和报道。本研究从高内涵筛选出发，系统性筛选胆囊癌转移相关的miRNAs，筛选出包含miR-20a在内的17个miRNAs，继而通过胆囊癌、癌旁差异性表达确定miR-20a为研究对象，在胆囊癌细胞株、稳定表达细胞系和动物水平研究miR-20a的促进肿瘤生长和促进肿瘤转移功能，继而通过生物学预测的方法去研究miR-20a的靶基因，通过多种生物学方法确定Smad7为miR-20a的靶基因，然后明确Smad7在miR-20a促进胆囊癌生长和转移中的依赖作用，进一步阐明Smad7通过影响β-catenin的转录活性和下游基因的表达是miR-20a促进胆囊癌生长、转移的分子机制，并结合临床样本明确miR-20a和Smad7在胆囊癌中的预后作用。实验方法1.通过高内涵成像和分析系统，用人的miRNAs库mimics转染胆囊癌细胞系GBC-SD，通过F-actin染色，筛选出胆囊癌转移相关的miRNAs；2.通过Real-tim PCR和miRNA原位杂交的方法检测胆囊癌冰冻组织、正常胆囊粘膜组织中17个转移相关的miRNAs的差异性表达，确定miR-20a为最终的研究对象。3.体内观察抑制miR-20a后胆囊癌生长和转移特性的变化：（1）miR-20a和胆囊癌生长特性的关系——裸鼠皮下荷瘤模型；（2）miR-20a和胆囊癌转移和侵袭的关系——脾脏注射肝转移模型。4. miR-20a的靶基因的确定：miRanda and TargetScan等生物学预测工具寻找可能的靶基因、 pGLO-Smad7dual luciferase report gene assay检测miR-20a对靶基因3’UTR的binding作用、Western blot和Real-time PCR检测miR-20a在蛋白和mRNA水平对靶基因的抑制作用，Real-time PCR检测在胆囊癌和裸鼠皮下荷瘤模型样本中Smad7和miR-20a的表达以及相关性。5. Smad7在胆囊癌中的作用：（1）Smad7在胆囊癌和正常胆囊组织中的表达情况：Real-time PCR，免疫组化；（2）Smad7对胆囊癌细胞生长中的影响——CCK8assay；（3）Smad7对胆囊癌细胞转移和侵袭的影响：Transwell assay、Matrigel assay、Western blot、Real-time PCR。6. Smad7作为miR-20a的直接靶基因在miR-20a的生物学功能中的作用（1）Smad7在miR-20a对胆囊癌细胞促生长中的作用——Smad7表达质粒和miR-20a共转染后进行CCK8assay；（3）Smad7在miR-20a对胆囊癌细胞促转移和侵袭中的作用：Smad7表达质粒和miR-20a共转染后进行Transwell assay、Matrigelassay、Western blot。7. Smad7下游靶基因β-catenin的相关研究：（1）miR-20a、Smad7对β-catenin转录活性的影响——β-catenin报告基因活性检测、β-catenin蛋白核转位Western blot检和免疫荧光检测；（2）β-catenin转录活性在胆囊生物学功能中的作用——LiCl刺激胆囊癌细胞后Transwell assay、Matrigelassay、Real-time PCR检测。8. miR-20a及靶基因在临床样本中和预后的关系：miRNA原位杂交检测miR-20a在石蜡样本中的表达、免疫组化检测Smad7基因等。9. miR-20a诱导的Smad7抑制在TGF-β1通路中的作用：Transwell assay、Matrigelassay、Western blot等。实验结果1.通过人类miRNA库mimic转染胆囊癌细胞进行F-actin测定的高内涵系统筛选出17个可以明显上调F-actin的miRNAs，即胆囊癌转移相关miRNAs。通过胆囊癌差异性表达检测确定miR-20a为核心的胆囊癌转移相关miRNA；2. miR-20a过表达通过上皮细胞间制化促进胆囊癌细胞的转移、侵袭，并促进胆囊癌细胞的生长；3.动物模型证实抑制miR-20a可以明显抑制胆囊癌的生长和转移；4. Smad7被证实为miR-20a的直接靶基因；5. Smad7在胆囊癌中起抑癌基因作用，并且其在miR-20a的促癌作用中起关键作用；6. Smad7通过影响β-catenin的转录活性发挥作用；7. miR-20a的过表达和胆囊癌患者的生存明显呈负相关；8. TGF-β1可以诱导miR-20a表达升高，miR-20a在TGF-β1诱导的EMT过程中起重要作用。结论本研究通过高内涵的方法筛选出了和胆囊癌转移相关的miRNAs，体内外证实miR-20a通过靶向Smad7在胆囊癌的转移和生长中起关键作用，miR-20a过表达、Smad7低表达患者有较差的预后，结果提示：干预miR-20a可能成为胆囊癌治疗的重要部分。第二部分自噬在肝母细胞瘤中的功能和机制研究研究背景和目的肝母细胞瘤是3岁以下儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，占全部儿童恶性肿瘤的1%，占小儿肝脏恶性肿瘤的90％。约70%的儿童在发现肿瘤时可以成功切除，早期的肝母细胞瘤可以有约90%的1年生存率和65%的5年生存率。辅助化疗和肝移植术为肝母细胞瘤提供了手术切除意外的保障。其发生发展是多因素综合作用的结果，包括基因组和环境等因素。近年来，研究表明染色体11p15区的缺失突变，IL-1β和IL-6，β-catenin/Wnt通路的异常等都和肝母细胞瘤密切相关。但是该肿瘤机制尚未完全明了，治疗和预后仍面临诸多问题。自噬是一种革命性的新发现，它是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程，在清除无用的、累积的蛋白质聚集物、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。自噬调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。近几年自噬有了较大的发展，多种自噬相关基因（ATGs）被发现，但对其深层次机制的认识上尚需进一步的研究和发现。近年来研究表明，自噬和多种肿瘤的发生发展有密切联系。但是目前其对肿瘤是保护还是抑制作用是有较大分歧的，可以认为自噬抑制肿瘤的发生，却促进了肿瘤的进展。在某些肿瘤中，自噬减弱最终会导致癌基因的突变和对肿瘤的易感性。如鼠的BECN1经过断裂突变处理后发现淋巴瘤、肺癌和肝癌高发，表明了自噬的抑癌作用。相反地，在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中，抑制自噬可以显着提高肿瘤最化疗的敏感性，此时自噬是促进肿瘤发展的。然而自噬是否参与肝母细胞瘤的发生发展并在其中发挥重要作用目前国内外未见相关报道。本实验首先观察自噬相关基因ATG5、BECN1在人肝母细胞瘤组织中的表达情况，然后在肝母细胞瘤细胞中通过饥饿和化疗两种方式去诱导自噬的发生，并检测自噬相关基因的变化，确定在肝母细胞瘤中的起主要作用的自噬相关基因，进一步通过自噬特异性抑制剂和siRNA干扰技术，明确自噬在肝母细胞瘤自然生长和化疗中的作用，最终在动物模型中去进一步验证自噬在肝母细胞瘤中的作用。实验方法1.通过电镜、Western blot、Real-time PCR、免疫组化等方法检测肝母细胞瘤中自噬活性及相关基因的表达；2.通过饥饿的方法诱导肝母细胞瘤细胞产生自噬，检测其中自噬相关基因的变化，并在饥饿同时加入自噬抑制剂，观察自噬在饥饿刺激中的作用；3.通过化疗药物刺激的方法诱导肝母细胞瘤细胞产生自噬，检测其中自噬相关基因的变化，并在化疗药物刺激同时加入自噬抑制剂，观察自噬在肝母细胞瘤化疗敏感性中的作用；4.通过siRNA干扰和自噬抑制剂确定肝母细胞瘤自噬相关基因和相关信号通路；5.裸鼠皮下荷瘤注射自噬抑制剂进一步明确自噬在肝母细胞瘤中的生物学功能。实验结果1.自噬在肝母细胞瘤中高度激活；2.自噬保护了肝母细胞瘤中饥饿诱导的自噬性凋亡；3.自噬保护了肝母细胞瘤中化疗诱导的自噬性凋亡，抑制自噬可以提高其化疗敏感性；4. BECN1/PI3K通路在肝母细胞瘤自噬中起关键作用；5.抑制自噬可以抑制肝母细胞瘤的生长。结论本研究发现自噬在肝母细胞瘤中被激活，并发现自噬在饥饿和化疗诱导的细胞凋亡中起保护作用，抑制自噬可以抑制肝母细胞瘤的生长，并提高其对化疗药物的敏感性。其中BECN1/PI3K通路起关键作用。本研究为深入理解自噬在肝母细胞瘤中的作用和机制提供新的线索，并为该病的治疗提供新的潜在靶点和策略。
潘韡[9]（2013）在《胆囊癌皮下移植模型与原位移植模型的建立与对比研究》文中进行了进一步梳理目的：通过构建裸鼠胆囊癌皮下移植模型及原位移植模型，对比两种胆囊癌动物模型的优缺点，并探讨动物胆囊癌模型的发展方向。方法：构建裸鼠胆囊癌皮下移植模型及原位移植模型，通过比较成瘤率、淋巴结转移、腹水产生、脏器转移、病理切片HE染色及微淋巴管密度（LVD）测定，进行相应的统计学分析（计数资料采用χ2检验，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，显着性水平α=0.05，P<0.05为有统计学意义）。评价两种动物模型的优劣，并为今后模型改进提供参考。结果：胆囊癌原位移植模型与皮下移植模型在成瘤率、淋巴结转移、腹水产生、脏器转移等方面存在差异（P<0.05）。胆囊癌原位移植模型的自发转移率高于胆囊癌皮下移植瘤模型。两种模型病理切片在HE染色下组织学性质无明显差异，但通过微淋巴管密度（LVD）测定可见原位移植瘤模型的淋巴管密度（12.13±1.92）显着高于皮下移植瘤模型的淋巴管密度（0.27±0.59），此结果为胆囊癌原位移植模型具备更强的淋巴转移能力及侵袭能力提供基础。但皮下移植瘤在接种后裸鼠存活率及肿瘤观察难易度上占优势。结论：裸鼠胆囊癌原位移植瘤模型具备较高的自发转移率，具备同人胆囊癌更加类似的生物学特性，是将来临床研究胆囊癌动物模型的主要方向。但原位模型制备过程较繁琐，手术创伤大，对操作者操作熟练度要求较高。本文原位移植组成瘤率要略低于皮下移植组，同时裸鼠死亡率略高。皮下移植瘤操作简单，成瘤率高，生长于皮下的肿瘤组织易于观察，而原位移植瘤深在腹腔，不利于观察其生长情况，转移过程。因此我们认为课题组应通过所需要观察的指标及目的选择合适的动物模型。
孙伟,范跃祖,张文忠,葛春燕,赵凤娣,周婷婷,宁艳霞[10]（2012）在《去甲斑蝥素对胆囊癌细胞体外模拟血管生成拟态的抑制作用》文中提出目的探讨去甲斑蝥素对GBC-SD、SGC-996胆囊癌细胞系体外三维培养血管生成拟态形态学影响。方法 Transwell小室及鼠尾Ⅰ型胶原收缩试验测定GBC-SD、SGC-996胆囊癌细胞系体外侵袭迁徙力,运用Matrigel胶、鼠尾Ⅰ型胶原三维培养基质建立GBC-SD、SGC-996胆囊癌细胞三维培养模型,观察细胞侵袭力高低与血管生成拟态相关性,并运用电镜、光镜观察血管生成拟态形态学构成;在三维培养模型中加入NCTD后动态观察NCTD对血管生成拟态形态影响。结果①GBC-SD胆囊癌细胞侵袭迁徙能力显着高于SGC-996胆囊癌细胞（P=0.0013）,高侵袭GBC-SD胆囊癌细胞在Matrigel胶、鼠尾Ⅰ型胶原三维培养基质中均能形成管状结构,而低侵袭SGC-996胆囊癌细胞不能形成管状结构②第1天至第4天,GBC-SD TIMP2干预组收缩指数明显低于GBC-SD组（F=353.88,P<0.0001;F=525.8,P<0.0001;F=190.02,P=0.0002;F=196.26,P=0.0002）,高侵袭性GBC-SD细胞收缩指数显着高于低侵袭性SGC-996细胞（F=318.73,P<0.0001;F=911.25,P<0.0001;F=268.88,P<0.0001;F=243.14,P<0.0001）;仅第2天,GBC-SD TIMP1干预组收缩指数显着低于GBC-SD组（F=52.66,P=0.0019）③NCTD可抑制胆囊癌细胞侵袭迁移能力,促使细胞凋亡,抑制细胞三维培养基质中管道形成。结论三维培养模型能模拟体内细胞生长条件,GBC-SD胆囊癌细胞侵袭迁徙能力显着高于SGC-996胆囊癌细胞并能在三维培养基质中形成管状结构,NCTD能抑制胆囊癌细胞体外血管生成拟态形成。
二、人原发性胆囊癌细胞系SGC-996的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人原发性胆囊癌细胞系SGC-996的建立（论文提纲范文）
（1）吡咯替尼对胆囊癌NOZ、SGC-996细胞系增殖、侵袭、迁移和凋亡作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 前言 |
| 第一部分:实验材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.1 主要实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 3.试剂的配制 |
| 3.1 吡咯替尼溶液的配制 |
| 3.2 胎牛血清灭活分装 |
| 3.3 细胞培养液的配制 |
| 3.4 细胞冻存液配制 |
| 3.5 蛋白电泳缓冲液的配制 |
| 3.6 转膜缓冲液的配制 |
| 3.7 TBST(10x)的配制 |
| 3.8 封闭液的配制 |
| 4.实验方法 |
| 4.1 细胞培养技术 |
| 4.2 CCK-8 检测细胞增殖-毒性 |
| 4.3 平板克隆形成实验 |
| 4.4 Transwell实验 |
| 4.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.6 Western blot |
| 5.统计学处理 |
| 第二部分:实验结果 |
| 1 吡咯替尼抑制胆囊癌NOZ细胞和SGC-996 细胞增殖 |
| 2 吡咯替尼对胆囊癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 3 吡咯替尼对胆囊癌NOZ细胞和SGC-996 细胞侵袭和迁移能力的抑制作用 |
| 4 吡咯替尼诱导胆囊癌NOZ细胞和SGC-996 细胞发生凋亡 |
| 5 Western blot检测吡咯替尼对NOZ细胞和SGC-996 细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 第三部分:讨论 |
| 第四部分:结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 睫状神经营养因子受体通过MAPK/ERK通路抑制胆囊癌转移 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（3）circERBB2调控核糖体DNA转录促进胆囊癌细胞增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文缩略语中英文对照 |
| 一 :前言 |
| 1.1 胆囊癌诊治现状 |
| 1.2 胆囊癌发生及其生物学行为的分子基础 |
| 1.3 环状RNA的生成机制和生物功能 |
| 1.4 环状RNA在肿瘤中研究进展 |
| 1.5 胆囊癌中非编码RNA研究现状及本研究意义 |
| 二 :材料和方法 |
| 2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 引物、siRNA及探针序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养和处理 |
| 2.2.2 细胞增殖能力检测 |
| 2.2.3 细胞和组织RNA提取、反转录和荧光定量PCR(qPCR) |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 RNA pulldown |
| 2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶银染 |
| 2.2.7 RNA 免疫沉淀(RIP) |
| 2.2.8 裸鼠成瘤实验 |
| 2.2.9 免疫组织化学(IHC)检测 |
| 2.2.10 Northern Blot |
| 2.2.11 核仁分离 |
| 2.2.12 组织芯片荧光原位杂交 |
| 2.2.13 细胞爬片FISH |
| 2.2.14 细胞爬片免疫荧光(IF) |
| 2.2.15 细胞IF+FISH双重染色 |
| 2.2.16双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.17免疫共沉淀(CO-IP)实验 |
| 2.2.18 质粒构建、转化及抽取 |
| 2.2.19 数据统计 |
| 三 :结果 |
| 3.1 胆囊癌组织环状RNA表达谱分析及差异表达基因筛选 |
| 3.1.1 胆囊癌发生过程中环状 RNA 表达谱发生了明显变化 |
| 3.1.2 来源于ERBB2基因的一个环状RNA分子circERBB2在胆囊癌中表达量显着升高 |
| 3.2 circERBB2 促进胆囊癌细胞增殖 |
| 3.2.1 敲低circERBB2 能抑制胆囊癌细胞体内体外增殖 |
| 3.2.2 过表达circERBB2 促进胆囊癌细胞体内体外增殖 |
| 3.3 circERBB2 调控胆囊癌细胞核糖体RNA转录促进胆囊癌细胞增殖 |
| 3.3.1 circERBB2 在胆囊癌细胞中主要定位于核仁 |
| 3.3.2 circ ERBB2促进胆囊癌细胞核糖体RNA基因(核糖体 DNA)转录 |
| 3.4 来源于ERBB2基因的一个环状RNA分子circERBB2在胆囊癌中表达量显着升高 |
| 3.4.1 circERBB2和PA2G4 蛋白存在相互作用 |
| 3.4.2 PA2G4 促进胆囊癌细胞核糖体DNA转录和细胞增殖 |
| 3.4.3 circERBB2 促进PA2G4 核仁定位,影响胆囊癌细胞增殖 |
| 3.5 circERBB2 是胆囊癌病人预后指标 |
| 3.6 总结 |
| 四 :讨论 |
| 4.1 肿瘤形成过程中环状RNA表达量的调控形式的转变 |
| 4.2 明确环状RNA的亚细胞定位是阐明其作用机制的重要线索 |
| 4.3 Pol I活性的调控和肿瘤细胞的增殖 |
| 4.4 PA2G4 蛋白在胆囊癌和其他肿瘤中的临床意义 |
| 4.5 探索circERBB2和PA2G4相互作用的分子基础 |
| 4.6 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 致谢辞 |
（4）ARAF基因沉默对胆囊癌恶性表型的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARAF表达水平在胆囊癌组织中上调 |
| 3.2 ARAF基因沉默抑制胆囊癌细胞的增殖能力 |
| 3.3 ARAF基因沉默抑制胆囊癌细胞的集落形成能力 |
| 3.4 ARAF基因沉默增强胆囊癌细胞的化疗敏感性 |
| 3.5 ARAF基因沉默抑制胆囊癌细胞的迁移、侵袭能力 |
| 3.6 ARAF基因沉默抑制裸鼠体内移植瘤的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 本研究的局限性 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胆嚢恶性肿瘤相关基因的研究现状 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）Hsa-miR-99a-5p在胆囊癌中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号及缩略词 |
| 中文部分 |
| 绪论 |
| 第一部分: 胆囊癌组织样本中差异miRNA的筛选和验证 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人胆囊癌组织样本的收集和保存 |
| 2.1.2 Realtime-PCR试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人胆囊癌及其相对应正常组织样本的总RNA提取 |
| 2.2.2 实时荧光定量PCR法验证miRNA芯片结果 |
| 2.3 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 胆囊癌组织中差异miRNA的筛选 |
| 3.2 TCGA数据库中miR-99a-5p表达情况分析 |
| 3.3 胆囊癌组织样本中miR-99a-5p的表达量 |
| 3.4 miR-99a-5p表达量与胆囊癌患者的临床病理资料和临床预后的相关性分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二部分: miR-99a-5p在胆囊癌中的功能研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 动物 |
| 2.1.3 主要实验所用试剂 |
| 2.1.4 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 miR-99a-5p过表达与敲减试剂的合成与构建 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR方法检测细胞内miRNA表达量 |
| 2.2.4 细胞计数 |
| 2.2.5 Cell Counting Kit-8(CCK8)试验检测细胞体外增殖能力 |
| 2.2.6 克隆形成试验 |
| 2.2.7 细胞划痕愈合试验 |
| 2.2.8 Transwell小室迁移/侵袭试验 |
| 2.2.9 裸鼠皮下成瘤试验 |
| 2.2.10 裸鼠脾脏注射肝转移模型建立 |
| 2.2.11 蛋白印迹(Western Blot)试验 |
| 2.2.12 统计方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 miR-99a-5p对胆囊癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.2 miR-99a-5p对胆囊癌细胞转移侵袭能力的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三部分: miR-99a-5p通过靶定MTOR和SMARCA5影响胆囊癌的功能 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 通过生物信息学方法预测miR-99a-5p的靶基因 |
| 2.2.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.3 靶基因过表达质粒的构建与转染 |
| 2.2.4 小干扰RNA合成 |
| 2.2.5 主要实时定量荧光PCR引物列表 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 miR-99a-5p的靶基因预测 |
| 3.2 双荧光素酶报告基因试验验证miR-99a-5p的靶基因 |
| 3.3 miR-99a-5p对候选靶基因MTOR和SMARCA5表达量的影响 |
| 3.4 SMARCA5在胆囊癌患者组织中的表达以及与临床病例资料和预后的相关性 |
| 3.5 miR-99a-5p通过PI3K/AKT通路影响胆囊癌细胞的侵袭转移能力 |
| 3.6 SMARCA5对胆囊癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响 |
| 3.7 miR-99a-5p通过直接调控SMARCA5影响胆囊癌细胞的侵袭转移能力 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文小结及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 英语全文翻译 |
| Introduction |
| PART 1: Screening and validation of differential miRNAs ingallbladder cancer tissue samples |
| 1.Introduction |
| 2 Materials and Methods |
| 2.1 Materials |
| 2.1.1 Patients and specimens |
| 2.1.2 qRT-PCR reagents |
| 2.1.3 Main instruments and reagents |
| 2.2 Methods |
| 2.2.1 Total RNA extraction from GBC tissues and their corresponding peritumoraltissues |
| 2.2.2 Verifying the miRNA microarray result by qRT-PCR |
| 2.3 Statistical analysis |
| 3.Results |
| 3.1 Screening of differentially miRNAin GBC tissues |
| 3.2 miR-99a-5p expression analysis in TCGA database |
| 3.3 miR-99a-5p expression in GBC tissues |
| 3.4 Correlation analysis of miR-99a-5p expression with clinicopathologicalcharacteristics and prognosis in patients with GBC |
| 4.Discussion |
| 5.Conclusions |
| PART 2: Functional study of miR-99a-5p in GBC |
| 1.Introduction |
| 2.Materials and Methods |
| 2.1 Materials |
| 2.1.1 Cell lines |
| 2.2.2 Laboratory animals |
| 2.1.3 Main reagents |
| 2.1.4 Instruments and equipment |
| 2.2 Methods |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Overexpression and knockout reagents9 synthesis and construction |
| 2.2.3 Detection of intracellular miRNA expression by qRT-PCR |
| 2.2.4 Cell counting |
| 2.2.5 Examination of cell proliferation in vitro by CCK8 assay |
| 2.2.6 Colony formation assay |
| 2.2.7 Wound healing assay |
| 2.2.8 Transwell cell migration/invasion assay |
| 2.2.9 Subcutaneous xenograft model of nude mice |
| 2.2.10 Splenic vein-liver metastasis tumor model of nude mice |
| 2.2.11 Western blot assay |
| 2.2.12 Statistical analysis |
| 3.Results |
| 3,1 Effects of miR-99a-5p on proliferation of GBC Cell lines |
| 3.2 Effects of miR_99a_5p on the invasion and metastasis of GBC cells |
| 4.Discussion |
| 5.Conclusion |
| PART 3: MiR-99a-5p affects the functions of GBC bytargeting MTOR and SMARCA5 |
| 1.Introduction |
| 2.Materials and Methods |
| 2.1 Materials |
| 2.2.1 Prediction of the target genes of miR-99a-5p by bioinformatics |
| 2.2.2 Dual luciferase reporter assay |
| 2.2.3 Construction and transfection of target genes overexpression plasmid |
| 2.2.4 Small interfering RNA synthesis |
| 2.2.5 Sequences of major qRT-PCR primers |
| 2.2.6 Statistical analysis |
| 2.2 Methods |
| 3.Results |
| 3.1 Prediction of target genes of miR-99a-5p |
| 3.2 Validation of target genes of miR-99a-5p by dual luciferase reporter assay |
| 3.3 Effects of miR-99a-5p on the expression of candidate target genes MTOR andSMARCA5 |
| 3.4 Expression of SMARCA5 in gallbladder carcinoma and its correlation withclinical data and prognosis |
| 3.5 MiR-99a-5p affected the invasion and metastasis of GBC cells by PI3K/AKTpathway |
| 3.6 Effects of SMARCA5 on proliferation，invasion and metastasis of GBC Cells |
| 3.7 MiR-99a-5p affected the invasion and metastasis of GBC cells by directregulating SMARCA5 |
| 4.Discussion |
| 5.Conclusion |
| Summary and prospect for this paper |
| Reference |
| 八年制学位论文要求 |
（7）从胆囊癌的一种新血供方式——血管生成拟态看胆囊癌诊疗观点改变（论文提纲范文）
| 1 胆囊癌的生物学特性和诊治困惑 |
| 2 胆囊癌血管生成拟态的发现 |
| 2.1 肿瘤的发生、发展与血液供应 |
| 2.2 胆囊癌 VM 的发现 |
| 2.2.1 临床发现 |
| 2.2.2 细胞实验验证 |
| 2.2.3 动物实验验证 |
| 2.2.4 分子机制研究 |
| 3 从胆囊癌血管生成拟态的发现看胆囊癌诊疗观念改变 |
| 3.1 胆囊癌的特殊恶性生物学特性 |
| 3.2 胆囊癌诊断启示 |
| 3.3 胆囊癌综合治疗启示 |
（8）胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 胆囊癌转移相关 miRNAs 的高内涵筛选及功能和机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分 自噬在肝母细胞瘤中的作用和机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分小结 |
| 附录一 |
| 文献综述（一） |
| 参考文献 |
| 文献综述（二） |
| 参考文献 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（9）胆囊癌皮下移植模型与原位移植模型的建立与对比研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 英文缩略词表 (Abbreviation) |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（10）去甲斑蝥素对胆囊癌细胞体外模拟血管生成拟态的抑制作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 胆囊癌细胞株 |
| 1.1.2 药物与抗体 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞侵袭迁移力测定 |
| (1) GBC-SD、SGC-996细胞二维培养 |
| (2) GBC-SD、SGC-996细胞Transwell小室侵袭力测定 |
| (3) GBC-SD、SGC-996细胞胶原收缩实验即迁移力测定 |
| 1.2.2 胆囊癌细胞三维培养体外模拟VM及其干预实验 |
| (1) GBC-SD、SGC-996细胞三维培养 |
| (2) 体外模拟VM干预实验 |
| 1.2.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞的侵袭迁移能力 |
| 2.1.1 胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞侵袭力 |
| 2.1.2 胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞迁移力 |
| 2.2 胆囊癌细胞体外模拟VM及NCTD对其的影响 |
| 2.2.1 胆囊癌GBC-SD、SGC-996 细胞三维培养和体外模拟VM |
| 2.2.2 NCTD对胆囊癌GBC-SD细胞体外模拟VM的抑制作用 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胆囊癌细胞三维培养体外模拟VM |
| 3.2 NCTD对胆囊癌细胞体外模拟VM的抑制作用 |
四、人原发性胆囊癌细胞系SGC-996的建立（论文参考文献）
- [1]吡咯替尼对胆囊癌NOZ、SGC-996细胞系增殖、侵袭、迁移和凋亡作用的研究[D]. 苏婷婷. 上海交通大学, 2020(01)
- [2]胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定[D]. 袁波. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(11)
- [3]circERBB2调控核糖体DNA转录促进胆囊癌细胞增殖[D]. 黄新策. 上海交通大学, 2019(06)
- [4]ARAF基因沉默对胆囊癌恶性表型的影响[D]. 林卫国. 浙江大学, 2019(03)
- [5]Hsa-miR-99a-5p在胆囊癌中的功能与机制研究[D]. 张亦弛. 上海交通大学, 2017(08)
- [6]AG490对Janus蛋白酪氨酸激酶与信号转导和转录激活子3调控的胆囊癌SGC-996细胞株侵袭和转移的影响[J]. 施骅,汪剑波,潘俊娣,叶斌. 中国基层医药, 2017(06)
- [7]从胆囊癌的一种新血供方式——血管生成拟态看胆囊癌诊疗观点改变[J]. 范跃祖. 外科研究与新技术, 2014(03)
- [8]胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究[D]. 常颜信. 第二军医大学, 2013(04)
- [9]胆囊癌皮下移植模型与原位移植模型的建立与对比研究[D]. 潘韡. 福建医科大学, 2013(01)
- [10]去甲斑蝥素对胆囊癌细胞体外模拟血管生成拟态的抑制作用[J]. 孙伟,范跃祖,张文忠,葛春燕,赵凤娣,周婷婷,宁艳霞. 外科研究与新技术, 2012(02)