Cdh1和Num1过表达菌株的构建

论文摘要

[目的]研究Cdh1和Num1之间是否存在相互作用,构建用于Cdh1和Num1免疫共沉淀试验的过表达菌株。[方法]首先在酵母菌株YWL630中用GAL1和3HA对CDH1进行标记,构建GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株,再利用酵母四分体解离的方法使菌株YWL63和YWL490分别与该菌株杂交并进行四分体解离,从而得到所需菌株。[结果]成功构建不同基因型和配型的重组酵母菌株,其中YT52成功过表达了约340 kD的Num1,YT53成功过表达了340 kD的Num1和75 kD的Cdh1,YT57成功过表达了75 kD的Cdh1。[结论]经过同源重组的方法成功标记CDH1并诱导蛋白过表达,通过酵母四分体解离的方法构建用于Cdh1和Num1互作试验的过表达菌株,为揭示APC/C是否介导Num1的降解及机制奠定基础。

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。

1.1.2 培养基及试剂。

1.2 方法

1.2.1 GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株的构建。

1.2.1.1 PCR扩增转化片段。

1.2.1.2 酵母感受态的制备。

1.2.1.3 转化。

1.2.1.4 克隆的筛选。

1.2.2 重组转化子的过表达鉴定。

1.2.2.1 酵母过表达菌株的细胞培养。

1.2.2.2 TCA法提取总蛋白。

1.2.2.3 Western Blot分析。

1.2.3 重组菌株基因组DNA的提取及PCR鉴定。

1.2.4 酵母四分体解离法构建重组过表达菌株及表达鉴定。

2 结果与分析

2.1 GAL-3HA-Cdh1 Num1-GFP重组菌株的构建和表达鉴定

2.2 酵母四分体解离法构建重组菌株的筛选鉴定

2.2.1 重组菌株的筛选结果。

2.2.2 YT52、YT53、YT57重组蛋白的Western Blot鉴定。

3 结论与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李巧巧,庞文颖,海力,唐仙英

关键词: 过表达,酵母四分体解离

来源: 安徽农业科学 2019年10期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室生物技术国家民委重点实验室

基金: 国家自然科学基金项目(31371366,31401155),中南民族大学基本科研业务费专项资金项目(3212018CZY18021)

分类号: Q78

页码: 1-4+9

总页数: 5

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Cdh1和Num1过表达菌株的构建

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