周云丽[1]2004年在《乳腺癌线粒体DNA突变和拷贝数改变的研究》文中研究指明目的： 乳腺癌是全世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。线粒体DNA的突变已经在很多人类肿瘤中被观察到。线粒体DNA调控区D-loop区相较于线粒体DNA的其它区域累积突变的频率更加迅速。本文首先通过对两个乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的研究建立线粒体DNA的D-loop区基因突变和线粒体DNA拷贝数改变的检测方法；其次通过测定乳腺癌患者组织和外周血以及家族性乳腺癌家系成员外周血线粒体基因组D-loop区突变的频率和分布研究这些突变产生的机制及在肿瘤发生中的作用；此外，进一步对这些标本线粒体DNA拷贝数改变进行了分析，探讨了线粒体DNA的D-loop区的突变和拷贝数改变与乳腺癌发生及与遗传性乳腺癌易感性的关系。 方法： 第一部分：体外培养乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231，从对数生长期细胞中提取线粒体DNA，PCR扩增线粒体DNA的D-loop区，与T载体连接后在大肠杆菌DH5 α中克隆，测序分析突变；以含有D-loop区的T载体为标准，用real-time实时定量PCR扩增两个细胞系线粒体DNA的D-loop区以检测线粒体DNA的绝对拷贝数。 第二部分：取30例乳腺癌组织标本、30例乳腺癌患者的外周全血标本、42例遗传性乳腺癌家系成员的外周全血标本和30例健康献血员的外周全血标本，采用E.N.Z.A Tissue和Blood DNA试剂盒分别提取总DNA。利用Oligo6.2软件设计叁对引物把线粒体DNA的D-loop区分成叁段分别进行PCR扩增，利用单链核苷酸多态性(SSCP)电泳筛选可疑突变区域。在发生突变的包含线粒体DNA复制和转录起始区和微卫星不稳定热点区D310区的128-599片段的PCR产物直接送交测序。测序结果用软件DNASTAR与已公布的剑桥序列比较以分析突变的频率和分布，序列 天津医科大学硕士学位论文 变化根据Mitomap database判断为多态性或新发现的多态性和突变位 点。第叁部分:以第一部分所得的连接有线粒体DNAD一1。叩区片段的克隆载体质 粒为标准，用real一time实时定量PCR对与第二部分相同的四组标本进 行IntDNA拷贝数的绝对定量测定，并分析各组的差异。结果:第一部分:在我们测序的两个细胞系的线粒体DNA的D一looP区中，各自发现 了9个突变，它们包括点突变、插入/删除突变，突变率占D一10op区全 长的0.8%，其中MCF一7的四个突变和MDA一MB一231的两个突变发生在H 链的复制起始区。两个细胞系在D一310的C一Stretch区均存在突变。此 外，我们在MDA一MB一231细胞中还发现了复杂的基因重排。用real一t ilne 实时定量PCR我们测定两个细胞系线粒体DNA的拷贝数分别是4.84x 10’5 and 5.63xlo’5 eopy/ugnNA。第二部分:用PCR一 SSCP我们在30例乳腺癌组织中筛选出巧例(50%)存在 突变，30例乳腺癌外周血中13例(43.3%)存在突变，与正常外周血(6%) 相比其差别有统计学意义(P<0.05)。在12例128一599片段存在突变的 组织中我们共发现了66个突变:51个为点突变，其中23个为 举C，巧个为A卜G;5个为插入突变;10个为删除突变;21个突变分 别发生在所有12例标本中的D31O区，且每个组织中的D310区突变各 不相同，可见此区确是突变高发区域;52个突变为已报导过的多态性， 其余14个为新发现的多态性和突变。在所有突变中263位点的A，以 489位点的T，C是12例组织共有的突变位点。在新发现的D一1。。p区 的多态性和突变位点中，12例组织中有6例(50%)在D3 10区311一313 位点出现了CC或CCC deletion。 用PCR一SSCP我们还在42例乳腺癌家系成员的外周血中筛选出30例 天津医科大学硕士学位论文 (71.4%)存在突变，与散发的乳腺癌患者外周血(43.3%)相比，差 别没有统计学意义(P>0.05);与正常对照相比(6%)差别有统计学意 义(P<0 .05)。在23例128一599片段存在突变的家系成员外周血中我们 共发现了126个突变:92个为点突变，其中41个为T，C，32个为 A卜G;20个突变为插入突变;14个突变为删除突变;37个分别突变发 生在所有23例标本中的D3lO区;122个突变为已发现的多态性，其它 的4个为新的多态性和突变位点。23例家系外周血在263和489存在相 同与组织的263和489位点的突变。而310位点的年C，311一312位点 的Te insert，522一523位点的CA deletion和527位点的C，G则是 这些成员中的高发突变位点。与散发的乳腺癌组织的测序结果相比， D31O区311一313位点仍发现有CC或CCC删除。在研究的叁个典型家系 中，同一家族中的乳腺癌家系成员的突变除D310区外基本相同。第叁部分:用real一time实时定量PCR，我们检测出乳腺癌组织的线粒体DNA 的拷贝数的平均值是7.75 xlo’:，C叩y/ugDNA，它高于乳腺癌病人外周血 的平均值3.22 X 10”eopy/ugDNA(P<0.05)和正常对照的平均值6.55火 10‘。copy/u gDNA(P<0 .05)。我们也检测出乳腺癌家系成员的平均值为 1.64xl0，Zeopy/ugDNA，它高于乳腺癌病人外周血的平均值(P(0.05) 和正常对照的平均值(P<0 .05)。结论: 我们的研究发现
戴纪刚[2]2006年在《非小细胞肺癌线粒体基因组不稳定性的研究》文中提出线粒体是真核细胞细胞核外唯一含有自己的基因组的细胞器。作为细胞的“动力工厂”,它在细胞的能量代谢、氧自由基生成和凋亡调控过程中扮演重要角色。哺乳动物mtDNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)是一全长为16.5kb左右的双链闭环分子,在长度仅为16.5kb左右的基因组内,定位了2种rRNA、22种参与线粒体蛋白合成的tRNA和13种涉及呼吸作用和氧化磷酸化功能的多肽链基因。线粒体DNA为多拷贝基因,每个细胞器都含有数个到上千个不等的线粒体,而每个线粒体可含有数个到数十个不等的线粒体DNA分子。与核基因组相比,其相对分子量小,缺乏组蛋白保护,缺乏损失修复系统等特点决定了它是致癌物作用的重要靶点。线粒体DNA突变发生率被认为是核DNA的10-20倍。近年来,随着对线粒体在细胞凋亡调控中的中心地位和诱发细胞癌变等肿瘤生物学过程中所起作用的进一步了解,线粒体DNA突变成为目前肿瘤研究的热点之一。线粒体DNA突变目前已在各种肿瘤及肿瘤细胞株中发现。报道的mtDNA遗传改变包括,发生于编码区及非编码区(即控制区)内的各种点突变、片段缺失、重复或插入突变及微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)等。肺癌组织中mtDNA的大片段缺失状况、控制区的微卫星不稳定性和mtDNA的拷贝数有何改变?至今尚不清禁。mtDNA控制区微卫星不稳定及线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A , mtTFA)的表达对线粒体DNA拷贝数改变又有何影响?也未见文献报道。目的:一、明确mtDNA 4977bp大片段缺失在肺癌组织、癌旁正常组织及非癌病人肺组织中的分布频率,了解肺癌组织mtMSI发生的具体方式、位置以及它与年龄、吸烟及组织学病理类型等临床指标间的关系,探讨mtDNA大片段缺失、控制区微卫星不稳定与肿瘤的相关性。二、建立一种精确定量组织细胞线粒体DNA拷贝数的方法,了解肺癌组织中mtDNA的拷贝数的改变及其与肺癌的相关性,明确肺癌组织中线粒体转录因子A的
江换钢[3]2014年在《基因多态性及线粒体DNA变化与乳腺癌易感性关系的分子流行病学研究》文中指出第一部分P53、USP7、TSPYL5基因多态性与乳腺癌易感性关系的研究目的：P53通路在DNA损伤修复、细胞凋亡、周期调控等方面发挥着重要的抑癌作用,此通路中某些基因的多态性与肿瘤易感性及肿瘤患者临床病理参数有关。研究显示,泛素特异蛋白酶7(USP7)和类Y染色体编码睾丸特异蛋白5(TSPYL5)可调节P53的活性。此研究旨在探讨P53、USP7和TSPYL5基因的单核苷酸多态性(SNP)与中国汉族女性乳腺癌易感性的关系。方法：本阶段研究期间,共有192名乳腺癌患者和与之年龄匹配的192名对照女性入组,留取其外周血液样本,并提取DNA。以Hapmap数据库及Haploview软件选取P53、USP7、TSPYL5基因的标签单核苷酸多态性位点,并使用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱方法进行各个多态性位点的分型检测。结果：本部分研究中,乳腺癌患者和对照组女性之间年龄、绝经状态未见差异,P值分别为0.926,0.610。对照组中,各个SNP位点的基因型频率经检验均符合Hardy-Weinberg平衡,P值介于0.082至0.915之间。统计分析结果显示,患者组和对照组女性的USP7基因上的rs12924995位点和rs2304467位点的突变频率存在统计学差异,P值分别为0.026,0.037;而P53基因和TSPLY5基因的各个多态性位点,以及USP7基因上其它位点的基因型分布在两组之间却均未见显着差异。结论：本部分研究成功检测了3个基因序列上的20余个单核苷酸多态性位点,从中筛选出位于USP7基因上的rs12924995和rs2304467两个可能与中国汉族女性乳腺癌易感性相关的位点。此部分研究结果为下一步大样本病例对照研究提供了数据支持。第二部分USP7基因rs2304467、 rsl2924995多态性与乳腺癌易感性关系的研究目的：以第一部分的研究结果为基础,在大样本的人群中进行病例对照研究以验证USP7基因rs2304467和rs12924995两个单核苷酸多态性位点与中国汉族女性乳腺癌易感性的关系。方法：选取乳腺癌患者及与之年龄匹配的对照女性入组,收集其外周静脉血液标本并提取DNA。使用聚合酶链式反应-限制性片段多态性方法(PCR-RFLP)检测各样本rs2304467和rs12924995两个位点的基因型。查阅患者病历,收集乳腺癌患者初潮年龄、孕产史、病理类型、TNM分期、雌孕激素受体状态等相关临床资料。结果：本研究第一、第二部分进行期间,共有975名乳腺癌患者以及910名与之年龄匹配的对照女性入组。正常组中,两位点基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P值分别为0.979,0.111)。多因素分析显示：杂合子rs2304467CG基因型携带者患病风险与rs2304467CC基因型携带者相比未见明显差异(P=0.679,OR=0.95,95%CI：0.74-1.21),而纯合子rs2304467GG基因型携带者的发病风险却比CC基因型者显着降低(P<0.001,OR=0.51,95%CI:0.36-0.73)。与rs2304467GG基因型者相比,rs2304467C等位基因携带者(CC和CG基因型)发病风险更高(P<0.001,OR=1.87,95%Cl1.44-2.44)。对于多态性位点rs12924995基因型的分析显示,CC、 AC基因型携带者分别与AA基因型者相比较时,发病风险均未见统计学差异(P值分别为0.074,0.992);而将rs12924995A等位基因携带者(即AA和AC基因型)与rs12924995CC基因型者相比则发现,前者患乳腺癌风险更高(P=0.002,OR=1.36,95%Cl:1.12-1.65)。结论：在中国汉族人群中,USP7基因rs2304467多态性位点基因型为CC、 CG的女性和rs12924995位点为AA AC基因型的女性患乳腺癌的风险相对更高。第叁部分外周血线粒体DNA含量及线粒体DNA10398位点多态性与乳腺癌易感性关系的研究目的：国内外研究显示,P53在线粒体DNA损伤修复、线粒体功能调节方面同样发挥着重要作用。线粒体DNA比核内DNA更易受到损伤,线粒体DNA含量的变化和序列的多态性与多种肿瘤的发生、发展有关。但是,外周血中线粒体DNA含量及某些多态性位点是否与乳腺癌易感性有关目前尚不清楚。此部分旨在研究中国汉族女性外周血线粒体DNA含量和10398位点多态性是否可以作为乳腺癌易感性评估的分子标记。方法：本研究期间,共检测了506名乳腺癌患者以及与之年龄匹配的520名对照女性的DNA样本。线粒体DNA含量采用实时定量PCR方法(Real-time PCR)检测,线粒体DNA10398位点基因型的检测采用聚合酶链式反应-限制性片段多态性方法。结果：外周血线粒体DNA含量和A10398G位点基因型在乳腺癌患者和对照组女性之间并无统计学差异。但进一步的分析显示,在绝经前女性中,线粒体DNA含量异常降低与乳腺癌易感性相关(P=0.001,线粒体DNA含量高者：OR=0.54,95%CI:0.38-0.77),而在绝经后的女性人群中,异常增高的线粒体DNA含量与乳腺癌易感性相关(P=0.027,线粒体DNA含量高者OR=1.49,95%CI:1.05-2.11)。另外,线粒体DNA含量还与乳腺癌患者的年龄、绝经与否、孕产次数等有关(P值分别为<0.001,0.006,0.001,<0.001)。然而,不同年龄、绝经状态和线粒体DNA含量亚组内,A10398G位点的基因型分布在病例和对照组间也均无差异(P值从0.396至0.906)。病理类型不同、人表皮生长因子受体2(Her2)表达水平不同的乳腺癌患者间10398A和10398G基因型分布存在差异(P=0.006,0.016),而其他不同临床病理参数的亚组中却未见显着性差异(P值大小从0.052至0.977)。与USP7基因2个SNP位点联合分析显示,rs2304467和rs12924995两位点基因型不会影响mtDNA含量(P值介于0.076至0.863),但两位点与mtDNA含量交叉分组可进一步区别各亚组女性的乳腺癌患病风险差异(OR值最高为3.46,95%CI：1.61-7.39)。结论：此部分病例对照研究表明,在中国汉族人群中,外周血线粒体DNA含量异常降低的绝经前女性和线粒体DNA含量异常升高的绝经后女性是乳腺癌发病的高危人群。线粒体DNA含量可与USP7基因2个单核苷酸多态性位点共同作为乳腺癌易感性评估的分子标记。
刘宗文[4]2008年在《线粒体DNA与食管鳞癌发生、发展及细胞凋亡关系的研究》文中认为食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年约有30万人死于食管癌,严重危害人类的生命和健康。我国是世界上食管癌高发区之一,河南省林州市食管癌的发病率和死亡率又居全国之首,因此,探讨食管癌的发生机制、早期诊断及靶向治疗已成为国内外研究的热点。线粒体是真核细胞的重要细胞器,生物氧化和能量转换等功能主要是在线粒体内进行。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)存在于线粒体内膜上,是一种特殊类型的DNA,它是唯一存在于核外的遗传物质,分为非编码区(D-Loop区)和编码区。mtDNA的结构特点与核DNA(nuclear DNA,nDNA)相比,其分子量相对较小,缺乏组蛋白保护和必要的损伤修复系统,又直接暴露于线粒体高反应氧中,且具有母系遗传的特点。因此mtDNA比nDNA更易受氧化性损伤和致癌物的攻击,进而引起突变和拷贝数的改变。研究认为,肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段和多基因突变的复杂演进过程,目前的研究多集中在细胞核基因组中癌基因和抑癌基因的变化,但仍有很多问题不能仅用核基因的变化来解释。近年来,随着对线粒体研究的深入,发现了存在于线粒体内膜上的mtDNA,认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质,而且与核外的mtDNA关系密切。以往的研究表明,mtDNA拷贝数的改变与白血病、神经胶质瘤细胞、肝癌、胃癌等肿瘤关系密切。同时有学者认为mtDNA的突变可能参与了细胞的恶变,并在头颈部肿瘤、甲状腺肿瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、结肠癌、膀胱癌等多种肿瘤中证实了这一观点。有关mtDNA与肿瘤关系的研究虽有一些报道,但mtDNA与食管癌发生、发展关系的系列性研究,特别是mtDNA与食管鳞癌发生、发展及细胞凋亡的关系,迄今国内外未见报道。为进一步阐明mtDNA与食管鳞癌发生、发展的关系,探讨抑制食管鳞癌发生、发展的有效方法并为食管癌的线粒体靶向治疗提供理论依据,本研究在同一样品中同时提取mtDNA和nDNA后,采用半定量PCR及实时荧光定量PCR等技术,系统地检测了62例高发区食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜中mtDNA数量的变化;采用纯化的PCR产物测序方法,对31例食管鳞癌、31例癌旁不典型增生组织及31例正常食管黏膜的mtDNA的ND1基因全部测序,以期了解mtDNA的ND1基因突变与食管鳞癌发生、发展的关系;通过建立食管鳞癌细胞EC9706和TE－13无mtDNA的p°细胞,采用半定量PCR、实时荧光定量PCR、TUNEL染色和流式细胞技术,观察mtDNA拷贝数与细胞凋亡的关系,以期为食管癌的线粒体靶向治疗提供理论依据。本实验分为以下叁部分:第一部分线粒体DNA数量变化与食管鳞癌发生、发展的关系方法1.分别扩增62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜中的mtDNA编码区(3490bp-3892bp,共403bp),并以β-actin作为定量标准物,琼脂糖凝胶电泳比较mtDNA在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜间的差异。2.采用实时荧光定量PCR技术定量检测62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜中的mtDNA拷贝数;并采用凝胶电泳对mtDNA进行定性检测。3.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,资料以均数±标准差((?)±s)表示,均数的比较采用t检验及方差分析,检验水准α=0.05。结果1.62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜中mtDNA的相对含量分别为1.604±0.195、1.533±0.147、1.401±0.185。食管鳞癌组织中mtDNA相对含量高于癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜,组间比较差异有统计学意义(F=19.536,P<0.05)。2.在62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜中的mtDNA的检出率均为100%(62/62,31/31,62/62),而mtDNA的平均拷贝数的Ct值分别为25.394±1.380,26.068±1.792,26.835±1.949,组间比较差异有统计学意义(F=11.020,P<0.05)。第二部分食管鳞癌组织中线粒体DNA编码区ND1基因突变及其与拷贝数量关系的研究方法1.利用PCR技术扩增31例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织和31例正常食管黏膜中mtDNA的编码区ND1基因。2.回收、纯化mtDNA编码区ND1基因的PCR产物并进行测序。3.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,资料以均数士标准差((?)±s)表示,均数的比较采用t检验及方差分析,检验水准α=0.05。结果1.在31例食管鳞癌和癌旁不典型增生组织中,其mtDNAND1基因均有9例发生突变,突变率为29.03%,且突变均为同一位点突变(C3971T,T3553A),未发现其它类型的突变。而在31例正常食管黏膜中,mtDNA ND1基因均未发现突变。2.食管鳞癌组织中,ND1基因突变区的mtDNA拷贝数与非突变区的mtDNA拷贝数相比,差异显着(P<0.05)。在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜中,mtDNA的平均拷贝数的Ct值分别为25.558±1.0789、26.324±1.897、26.932±0.530;癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织均有9例发生突变,其突变Ct值分别为24.774±1.129、23.921±1.0574,组间比较差异有统计学意义(F=5.184、14.861;P均<0.05)。第叁部分人食管鳞癌EC9706和TE-13细胞中线粒体DNA与细胞凋亡的相关性研究方法1.培养人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13,用溴乙啶(EB)处理获得完全缺失mtDNA的细胞(p°细胞)。2.利用实时荧光定量PCR技术,检测EB处理后不同时间的人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13 mtDNA的拷贝数;并采用琼脂糖凝胶电泳对mtDNA进行定性检测。3.利用PCR技术,扩增人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13 mtDNA编码区ND1基因,并将PCR产物回收、纯化后进行测序。4.采用TUNEL染色和流式细胞技术,检测EB处理后不同时间人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的凋亡情况。5.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,资料以均数±标准差((?)±s)表示,均数的比较采用t检验及方差分析,检验水准α=0.05。结果1.成功建立了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的p°细胞,经实时荧光定量PCR鉴定,发现在EB的存在下,随着细胞分裂,mtDNA拷贝数进行性减少,直到12d,mtDNA完全丢失。2.检测人食管鳞癌EC9706和TE-13细胞mtDNA的ND1基因序列,发现均存在C3971T突变。3.检测了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的p°细胞系培养过程中对照组和EB处理后第4、8、12d的mtDNA拷贝数量,发现:从第4d到第12d其拷贝数量逐渐递减,第12d为零,无mtDNA。4.本实验率先检测了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13的p°细胞培养过程中对照组和EB处理后第4、8、12d的细胞凋亡的情况。经流式细胞术检测发现,从第4d到第12d其凋亡率逐渐增加;TE-13的凋亡率(%)分别为16.42±0.70、59.80±0.49、68.80±0.21;EC9706的凋亡率(%)分别为2.784±1.04、11.68±1.85、26.62±1.06。TUNEL检测结果与上述一致,从第4d到第12d凋亡率亦逐渐增加。结论1.在同一组织中同时提取mtDNA和nDNA,节省组织,缩短时间,减少费用,操作简单,并且对疾病的研究,两者更具可比性及相关性更有说服力。2.运用半定量PCR技术,检测食管鳞癌发生、发展不同阶段组织中mtDNA,发现由正常食管黏膜、癌旁不典型增生及食管鳞癌组织,其mtDNA的数量依次增加,提示mtDNA数量的增加与食管鳞癌的发生、发展密切相关。3.采用实时荧光定量PCR检测mtDNA,发现正常食管黏膜、癌旁不典型增生及食管癌组织中mtDNA的拷贝数呈逐渐递增的趋势,提示mtDNA拷贝数量的增加与食管鳞癌的发生、发展密切相关。4.对不同食管病变组织中mtDNA的ND1基因测序发现,29.03%的癌旁不典型增生及食管鳞癌组织发生ND1基因(C3971T,T3553A)突变,而正常组织中均未发现该基因突变,提示mtDNA突变可能在食管癌的发生和发展中起一定的作用。对人食管癌细胞EC9706和TE-13mtDNA的ND1基因测序,仅发现C3971T突变,进一步证实了mtDNA的ND1基因突变与人食管癌关系密切。5.突变组mtDNA拷贝数量明显高于未突变组mtDNA拷贝数量,两者相比有显着差异,提示mtDNA突变与mtDNA拷贝数量密切相关。6.成功建立了EC9706和TE-13的P°细胞,为进一步研究mtDNA与食管癌的关系提供了新的技术手段。7.随着EC9706和TE-13两细胞株mtDNA拷贝数量的逐渐减少,两细胞株中的凋亡率均逐渐增加,表明mtDNA在诱导细胞凋亡中起着一定调控作用。提示选择性地诱导食管癌细胞mtDNA损伤,致使食管癌细胞mtDNA拷贝数量明显减少,进而诱导细胞凋亡增加,可望成为食管癌生物治疗的一个新靶点。本研究创新点:1.首次运用同一组织同时提取mtDNA和nDNA,节省组织,缩短时问,减少费用,操作简单,对研究肿瘤及其它相关疾病更有说服力。2.率先运用半定量PCR、荧光定量PCR方法检测食管鳞癌组织发生不同阶段组织中mtDNA的数量及mtDNA的拷贝数。3.首次对正常食管黏膜、癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织的mtDNA的ND1基基因纯化并全部测序,发现在癌旁不典型增生和食管鳞癌组织中ND1基因点突变位点为C3971T,T3553A。4.首次建立了人食管鳞癌EC9706和TE-13的p°细胞系,为进一步研究mtDNA与食管癌的关系提供了新的技术手段。5.首次检测了人食管鳞癌细胞EC9706和TE-13mtDNA拷贝数的改变与凋亡的关系,并对二细胞系中mtDNA的ND1基因测序,发现ND1基因点突变位点为C3971T。6.首次发现经EB处理后的两种细胞mtDNA的拷贝数逐渐减少,到第12dmtDNA的拷贝数为零,而两种细胞数的凋亡率逐渐增加。
周云丽, 牛瑞芳, 史玉荣, 于满[5]2005年在《乳腺癌线粒体DNA拷贝数改变的研究及意义》文中研究表明目的:用实时定量PCR对乳腺癌组织线粒体DNA的拷贝数进行检测,探讨线粒体DNA拷贝数改变与乳腺癌的关系。方法:对30例乳腺癌患者组织及其相应外周全血、30例健康献血员外周全血标本的线粒体DNAD-loop区克隆并制备标准品;用实时定量PCR检测标本线粒体DNA的拷贝数。结果:乳腺癌组织线粒体DNA的拷贝数平均值为7.75×1013copy/μgDNA,高于其相应外周血的平均值3.22×1011copy/μgDNA(P<0.05)和对照的平均值6.55×1010copy/μgDNA(P<0.05)。结论:线粒体DNA拷贝数改变与乳腺癌发生有关。
张淑萍, 宋书娟, 李雅轩[6]2008年在《人类线粒体DNA突变与癌症》文中研究表明细胞中的线粒体在细胞的能量代谢等功能中发挥了重要的作用。人类的肿瘤形成与线粒体DNA(mtDNA)存在着复杂的关联,在多种癌细胞中均检测到mtDNA的突变。文章综述了癌细胞中的mtDNA突变与癌症发生的相关性,并讨论了部分突变产生的原因及在癌症中进行mtDNA突变检测的应用前景。
李德洋[7]2018年在《基于新一代测序技术的肿瘤线粒体DNA突变研究》文中指出背景:线粒体是细胞内能量代谢的核心,也是动物细胞中除细胞核外唯一存在遗传物质的细胞器。线粒体DNA是一段共价闭合环状的双链DNA,在细胞内以多拷贝形式存在,编码产物参与构成氧化呼吸链复合体。线粒体DNA突变会对细胞能量代谢产生重大影响。自从1956年Warburg提出Warburg效应以来,肿瘤中的线粒体DNA突变便引起了广泛的重视。一方面,目前在几乎所有种类的恶性肿瘤中都发现有线粒体DNA体细胞突变,且错义突变比例、高危突变比例远高于正常人群中多态性位点,因此很多研究者认为线粒体DNA体细胞突变受阳性选择,参与了肿瘤的发生发展,并鉴定出影响肿瘤细胞增殖和转移能力的点突变;另一方面,近期研究表明,肿瘤中线粒体DNA体细胞突变大多是由复制过程中DNA聚合酶参与的碱基掺入错误导致的,并非进化选择的结果,更多的是中性突变。目的:1.建立基于新一代测序技术的肿瘤线粒体DNA体细胞突变检测方法;2.探讨肿瘤中线粒体DNA体细胞突变所受进化压力模式;3.观察乙型肝炎病毒感染的肝细胞肝癌患者炎症组织和癌症组织中线粒体DNA体细胞突变的特征,探索线粒体DNA突变在炎-癌转化过程中可能发挥的作用。方法:1.构建双barcode文库,利用自制的线粒体DNA杂交捕获探针从全基因组测序文库中捕获线粒体DNA;利用自建的生物信息分析流程检测肿瘤线粒体DNA体细胞突变;2.从以往文献及肿瘤变异数据库(TCGA,ICGC)中提取肿瘤线粒体DNA体细胞突变,合并下述自测突变数据,分析肿瘤中线粒体DNA体细胞突变所受选择压力的特点。3.利用上述方法对156例肝细胞肝癌患者的血细胞、肝炎组织和肿瘤组织的线粒体DNA进行测序,分析炎症组织和肿瘤组织中线粒体DNA体细胞突变的特点。结果:1.建立的肿瘤线粒体DNA体细胞突变检测方法能够准确有效地鉴定肿瘤中线粒体DNA体细胞突变;2.肿瘤中线粒体DNA体细胞突变总体上受到的负向选择压力放松,但编码复合物V亚基的基因(ATP6,ATP8)和tRNA编码基因受到的负向选择压力显着高于其他区域,尤其是ATP8基因编码区和tRNA的loop区域和可变区域编码区;3.导致产生Thr氨基酸的突变可能受正向选择,导致产生终止密码子的突变可能受负向选择;4.炎症组织中,对基因功能影响越大的线粒体DNA体细胞突变,异质性水平越低;而肿瘤组织中未见此趋势;5.位于线粒体DNA非编码区的72位碱基的T>C点突变在8%肝细胞肝癌患者的炎症组织中出现,而在肿瘤组织中很少出现,可能不利于肿瘤细胞的生长增殖。结论:肿瘤中线粒体DNA体细胞突变受到位点特异性的进化选择;与炎症组织中的突变相比,肿瘤组织中的突变对基因功能影响更大;线粒体DNA 72位碱基T>C替换可能是抑制肿瘤发生的突变。
赵明[8]2008年在《喉癌细胞系线粒体功能缺陷和喉癌组织中线粒体基因突变的研究》文中指出线粒体功能障碍与凋亡途径的缺陷相关,喉癌显示出凋亡缺陷。线粒体膜电位的缺失是线粒体凋亡途径的早期起始事件。膜电位去极化剂valinomycin处理3个喉癌细胞系,研究它们的凋亡反应,及其去极化诱导细胞色素C的释放的能力。喉癌细胞系o11,o12,和o19,和一个白血病对照细胞系HL60经处理后,流式细胞仪法检测细胞线粒体膜电位和它们的凋亡率,Western Blot用来检测细胞质中细胞色素C的释放。在药物处理24小时后,所有细胞系显示完全的膜电位去极化,只有HL60经历凋亡。喉癌细胞系均无细胞色素C释放,而HL60细胞系却非常明显。DNA直接测序显示68%的喉癌组织标本中有线粒体DNA突变,而配对的正常癌旁组织只有32%。喉癌细胞系在线粒体膜电位去极化诱导凋亡方面显示缺陷,喉癌组织的高突变频率提示我们细胞突变可能是凋亡抑制的原因,突变DNA的检测可成为有潜力的喉癌生物标志物。
张熙[9]2016年在《线粒体编码区COⅠ、COⅡ、COⅢ基因单核苷酸多态性与乳腺癌的发病风险的相关性研究》文中研究说明目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,根据世界卫生组织公布的数据,显示乳腺癌在全世界女性中的发病率排名第一,死亡率列恶性肿瘤第五位;中国肿瘤登记点公布的数据显示乳腺癌是中国女性发病率最高的恶性肿瘤,死亡率位居第六。乳腺癌是一种多基因、多因素和多阶段累计的过程,呈现明显的家族聚集性,其中基因改变被认为是乳腺癌发生的基础。不同于核DNA(nuclear DNA),线粒体DNA(mitochondrial DNA)缺乏组蛋白的保护、修复能力差以及处于富含活性氧(reactive oxygen species,简称ROS)的环境中,因此易于产生氧化应激损伤,从而易于发生基因改变。针对线粒体基因与乳腺癌发病风险的相关性,众多学者展开了大量的研究工作,研究结果表明表明线粒体D-loop区基因多态性与乳腺癌的发病风险具有相关性。线粒体基因D-loop区通过影响线粒体基因的转录及复制而改变线粒体基因,而线粒体基因编码区因其几乎不含有内含子,故线粒体编码区基因的单核苷酸多态性可通过改变编码的氨基酸类型从而改变线粒体功能。因此,开展线粒体编码区基因与乳腺癌发生、发展的相关性研究具有重要的意义。本研究中选择线粒体编码区基因为研究对象,主要检测区域为线粒体编码区基因COX,选取外周静脉血液样本,进行测序并与标准序列进行对比找到多态性位点,运用KW与卡方检验探究多态性位点、多态性频次与乳腺癌发病风险的相关性,为解决乳腺癌发病风险评估方法提供了一种新的思路。方法:1线粒体DNA的提取,所有患者均为女性,既往无乳腺及其他恶性肿瘤病史,且均为非孕期。所有入组患者均于2008年1月至2015年10月期间在河北医科大学第四医院乳腺中心就诊。其中本次实验入组的散发性乳腺癌患者为161名,家族性乳腺癌患者为67名,所有患者均经病理证实为乳腺癌。家族性乳腺癌的一级亲属共41名,此外还有161名正常对照组,均为在河北医科大学第四医院体检中心体检的无乳腺疾病的健康人,乳腺疾病包括良性和恶性乳腺疾病。2目的基因检测,PCR扩增产物测序,在网站获取剑桥标准人类线粒体DNA序列,然后利用两款软件进行DNA序列分析。首先应用DNAMAN序列分析软件,将各实验组的血线粒体DNA目的基因段与以获取的标准序列进行多序列对比分析,找出提示的突变位点。然后在Chromas软件中找到相对应的突变位点,再次确认是否发生突变,并记录下来。3统计、分析,把经过对比分析的资料,进行仔细、严密的汇总。内容主要包括有多少突变位点,以及每一个突变位点在各实验分组中的人员配比情况,列出相应的表格。采用卡方检验(χ~2检验,Pearson Chi-Squaretest)对各组资料的构成比进行分析。要求理论频数不应小于5。当有1=<理论频数<5时,运用连续性校正卡方检验,当理论频数小于1时,运用确切概率法计算概率。多态性位点分布频次的分析采用Kruskal-Wallis H检验,对样本总体进行检验,如果P<0.05,样本总体具有统计学差异,再使用nemenyi继续4组间分析,P<0.0126,具有统计学差异。所有的数据应用SPSSversion21统计软件进行统计分析,P<0.05被认为是有统计学意义。结果:1临床资料分析,各组间年龄的比较未见明显差异(P>0.05),提示各组间年龄均衡,其他实验数据具有可比性。对于家族和散发性乳腺癌组患者的临床资料进行对比,两组的病理类型(P=0.013)有统计学差异,其中髓样癌(P=0.012)、浸润性小叶癌(P=0.045),家族性乳腺癌患者以上类型肿瘤发生率较散发性乳腺癌高,提示家族性乳腺癌患者病理类型恶性程度更高。其余的临床资料,分别包括临床分期(P=0.436)、淋巴结转移(P=0.069)、绝经情况(P=0.152)、HER-2的表达(P=0.218)及激素受体的表达情况(P=0.847),均无明显统计学差异,提示本组研究中的散发性和家族性患者的临床生物学特性相匹配。2线粒体基因编码区COⅠ、COⅡ、COⅢ基因多态性改变与乳腺癌发病风险的相关性分析。各实验组的多态性改变经过统计学分析,运用卡方检验(χ~2检验,Pearson Chi-Squaretest)计算出P值,P<0.05被认为有统计学意义,可以考虑这个位点的多态性改变与乳腺癌的发病风险相关。2.1散发乳腺癌组与正常对照组统计学分析,在线粒体基因编码区COⅠ基因上,散发性乳腺癌组与正常对照组相比7196C/A位点(P=0.034)存在多态性,具有统计学差异。在线粒体基因编码区COⅢ基因上,散发性乳腺癌组与正常对照组比较,9545A/G(P=0.036)、9548G/A(P=0.003)位点存在多态性,具有统计学意义,提示这些位点多态性可能与乳腺癌的发病风险具有相关性。2.2在9548G/A位点,家族性乳腺癌组(P=0.027)与对照组比较,此位点多态性发生率高,具有统计学差异,但与散发性乳腺癌组对比(P=1.00),发生率无明显差别,无明显统计学差异,提示此位点的多态性可能仅与乳腺癌的发生、发展有相关性。3各实验组的线粒体基因COⅠ(5904~7445base)、COⅡ(7586~8269base)、COⅢ(9207~9990base)每个样本多态性位点频次分布与乳腺癌发病风险。分为两组进行比较,均采用Kruskal-Wallis H检验,对样本总体进行检验(P<0.05视为具有统计学差异),Nemenyi(4组间比较α=0.125)数据结果提示散发性乳腺癌组、家族性乳腺癌组、一级亲属组多态性频次分布在引物4和6号组较正常对照组均有统计学差异,均高于健康对照组。但散发性乳腺癌与家族性乳腺癌之间、散发性乳腺癌和一级亲属及家族性乳腺癌和一级亲属组多态性频次无明显统计学差异。提示线粒体基因氧化损伤在散发性乳腺癌及家族性乳腺癌亲属中的累积高于正常对照组。结论:1 COⅠ、COⅡ、COⅢ基因的检测中,发现7196C/A位点、9545A/G、9548G/A与散发性乳腺癌的发病风险具有相关性,增加了散发性乳腺癌的发病风险。2 9548G/A位点可能同时增加了家族性和散发性乳腺癌的发病风险。3在线粒体编码区COX基因的7100-7700bp及9300-10000bp基因片段上,散发性和家族性乳腺癌及其一级亲属的单核苷酸多态性分布频次较正常对照组高,提示肿瘤细胞内线粒体的损伤积累较快、较多,也提示细胞内的氧化损伤与乳腺癌的发病风险具有相关性。
金雄杰[10]2002年在《中国人肺癌线粒体DNA突变及多态性的研究》文中研究说明线粒体是哺乳动物细胞中除细胞核外唯一具有DNA的细胞器，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有独立的一套遗传调控系统。人类mtDNA为双链闭环DNA，由16，569个碱基对组成，编码13个参与氧化磷酸化过程的多肽。mtDNA突变可引起神经系统、心肌组织等多种能量代谢旺盛的组织和器官的疾病。近年来，在膀胱癌、头颈部肿瘤、胰腺癌、肺癌、肝细胞癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌和胃肠道肿瘤等多种肿瘤细胞中发现了同质性mtDNA突变，对于mtDNA与肿瘤发生的关系目前尚有很多争议。由于肿瘤中mtDNA的高拷贝、同质性突变等特点，有人提出mtDNA突变有希望成为肿瘤早期诊断的分子标记。为了探讨mtDNA突变在肺癌发生中的意义、mtDNA突变在肺癌早期诊断中作为分子标记的可能性以及mtDNA多态性与肺癌易感性的关系，我们检测了肺癌mtDNA突变，分析了肿瘤中mtDNA同质性突变的形成原因。 本研究中，我们提取了58例中国人肺癌患者的癌组织、相应的病灶远端正常肺组织和外周淋巴细胞的总DNA，用Nest-PCR的方法扩增58个相互重迭且涵盖mtDNA全长序列的片段，通过对这些PCR片段的测序，确定肺癌中mtDNA突变和mtDNA多态性。结果发现： 1．在36例(62.1％)肺癌组织中检测到66个mtDNA突变，其中包括58个点突变，4个插入突变，4个缺失突变，所有的插入突变和缺失突变均发生在D-loop区的重复序列中，点突变均为T-C或G-A间的碱基置换。 2．这些突变散在地分布于mtDNA的全长序列中，其中D-loop区的突变率较高，占27.3％(18/66)；在多肽编码区共检测到43个点突变，其中20个为不改变氨基酸的同义突变；其余5个点突变发
参考文献：
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[10]. 中国人肺癌线粒体DNA突变及多态性的研究[D]. 金雄杰. 中国协和医科大学. 2002
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