胎肝细胞对HBV感染应答基因的初步分离和鉴定

王方^[1]2004年在《胎肝细胞对HBV感染应答基因的初步分离和鉴定》文中提出乙型肝炎(hepatitis B, HB)是目前广泛流行于世界的传染病,据推测全球HBV携带者数量超过3.5亿,其中5%发生肝癌,约25%~40%发展成肝硬化及重型肝炎,每年死于HBV相关性疾病的患者达1 000~2 000万。随着乙型肝炎疫苗的普遍使用,乙型肝炎的水平传播已基本得到控制,而宫内感染,即HBV经胎盘传播给胎儿引起的感染,新生儿出生后用乙肝疫苗和特异性高效价免疫球蛋白不能阻断其传播,因而成为我国乙型肝炎传播的主要途径。到目前为止,乙型肝炎宫内感染的分子发病机制尚不明确,在治疗上尚未获得突破性进展,因此,HBV宫内感染分子致病机制的研究是迫切需要阐明的、非常重要而艰巨的课题。我国大部分慢性乙型肝炎系宫内感染而来,易形成长期免疫耐受和复杂疾病谱,从HBsAg携带、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等,所以宿主对病毒的反应在发病机制中起重要作用。目前感染病的宿主反应性研究日益受到重视,其中HBV感染后的宿主与复杂疾病谱之间的关系成为研究的热门领域。已进行的研究结果显示HBV-宿主相互作用不仅仅发生在细胞表面,很可能是一个非常复杂的相互作用网络,HBV与宿主组织细胞之间这种特定的相互作用决定着病毒的存活与疾病的发生、发展及转归,而这种相互作用反映在基因水平上则表现为病毒感染后宿主细胞基因表达谱的改变。已有的研究结果提示完整的HBV感染肝细胞基因表达谱的研究,有可能使我们更深入地认识HBV的分子致病机制,从而有助于发现更多的、更有效的抗病毒作用靶标。随着分子生物学技术的发展,克隆和鉴定HBV感染肝细胞相关的应答基因成为可能。目前尚未见应用SSH技术分离HBV感染肝细胞后差异应答基因的研究报道。本项研究拟采用SSH技术,研究 HBV感染培养人胎肝细胞后的差异应答基因谱,结合序列分析技术阐明其结构,以期进一步阐明其功能,获得HBV与宿主细胞相互作用的关键因素及HBV感染的分子机制,为发现阻断病毒感染的新途径和抗病毒新靶标奠定基础。我们分离和培养原代22周龄以上胎肝细胞,并将肝细胞和HBV病毒颗粒孵育。应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中 cccDNA。我们比较了几种常用的鉴定HBV感染指标的敏感性和特异性。根据文献报道纤维结合素(fibronectin,FN)作为一种细胞外基质可以促进培养细胞的生长和增殖,人类肝脏血窦FN可以促进肝细胞对HBV病毒的摄取,所以我们用FN包被培养皿了解FN对HBV感染培养人胎肝细胞的影响。HBV成功感染胎肝细胞后我们以感染胎肝细胞作为检测相(tester),以未感染胎肝细胞作为驱动相(driver),用抑制性消减杂交技术检测HBV感染胎肝细胞后差异表达基因,将消减后产生的cDNA片段插入质粒,建立消减cDNA文库,并用斑点杂交法进行筛选。筛选后的差异表达基因进行测序并在GeneBank中进行比较分析。主要结果:1.原代培养人胎肝细胞可以被HBV成功感染。胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2日出现阳性,培养上清和细胞中HBV DNA定量自第4日起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6日出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9日出现阳性。免疫组化检测细胞核中HBcAg最早出现阳性,可以作为一种敏感而简便的检测早期感染的方法,而PCR检测感染肝细胞中的cccDNA出现时间较晚,但经过绿豆芽核酸酶鉴定,特异性高。2.FN可以促进HBV感染离体培养人胎肝细胞。FN包被后HBV感染胎肝细胞的时间提早(未包被时肝细胞中HBcAg自第2日检出,cccDNA自第8日检出,而包被时HBcAg自第1日即可检出,cccDNA自第2日即可检出),感染细胞数量增加(未包被时感染的细胞数量约10%,而包被后感染的细胞数量增加到90%以上)。3.获得仅在检测相表达或比在驱动相表达增高5倍以上的克隆70个,经测序并进行同源性分析显示有16个差异表达cDNA片断。其中5个基因和已知基因片断的同源性为84%~50%,可能为新的cDNA片断,正在进行Northern 杂交鉴定,其他11个cDNA片断和已知基因的同源性为100%。主要创新点:1.比较了几种常用的鉴定HBV感染的方法,发现免疫组化检测细胞核中HBcAg较其它方法敏感,PCR检测 cccDNA经过绿豆芽核酸酶鉴定,特异性高。2.发现纤维结合素FN可以促进HBV感染培养人胎肝细胞。3.用SSH技术分析了胎肝细胞对HBV感染后的差异应答基因谱变化,发现HBV感染胎肝细胞过程可能涉及到物质代谢和信号传导等途径;发现5个可能的新基因片段,其功能尚待进一步明确。

汤勃^[2]2003年在《早期人胎肝细胞乙型肝炎病毒感染相关分子的探索研究》文中研究说明乙型病毒性肝炎(hepatitis B，乙型肝炎)是危害我国人民健康最严重的疾病之一，我国携带HBsAg的总人数超过1亿人。虽然已有相关疫苗和众多药物，但5%~10%的人群对现有乙型肝炎疫苗反应低下，且药物疗效难以令人满意。近年来公共卫生环境的改善，虽然使乙型肝炎的水平传播及围产期传播明显下降，然而乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)宫内感染尚无有效预防手段，且宫内感染一旦发生，出生后大多进展为慢性乙型肝炎而持续携带，严重危害个体及其周围人群的健康。此外，约5%~10%人群对疫苗不产生有效应答，在相当长的一个时期内，HBV感染人将持续存在。因此，研究HBV感染的分子机制，是寻找更加有效的疫苗和药物，并最终攻克其防治难题的重要途径。 一般认为，HBV和其他病毒类似，需要通过宿主细胞表面的受体或类似结构，进入细胞并进行自我复制。HBV受体的探索虽然已经有近20年的历史，先后发现10余种可能的蛋白质，但均未获得广泛承认。一方面表明受体研究方法仍需改进，其次提示参与HBV入侵靶细胞的分子可能不止一个。乙型肝炎的宫内感染同样涉及HBV受体问题，其机制虽不明确，胎肝细胞仍是HBV的主要靶细胞。已知乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性的母亲孕早期(first trimester，0~12周)宫内感染罕见，而孕中晚期感染率显着升高。提示早期胎肝细胞由于分化程度低，未能表达HBV受体而不易感，随孕期延长而向成人肝细胞表型逐渐分化，其间表达了HBV受体分子，导致HBV入侵定植而发生宫内感染。 基于上述假设，我们设计了10种培养条件，在自行设计的无血清培养基中添加不同的细胞分化诱导物，包括表皮生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、苯巴比妥钠、全反式维甲酸等，分离孕10周龄人胎肝细胞进行原代培养，观测肝细胞形态及功能指标变化，并定时给予HBV感染，观察能否在体外诱导胎肝细胞出现HBV易感性；为检测肝细胞内HBV 共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，我们改进了现有的PCR检测法。在上述实验的基础上，建立了双重削减策略，以抑制性削减杂交对比HBV易感性出现前后的细胞mRNA变化，从而筛选出与HBV感染有关的基因序列。 主要结果如下： 1．HBV cccDNA的改良PCR检测法简便快速，敏感性及特异性均好。参考国外文献设计了跨越HBV基因组松驰环DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)单链区的PCR引物，实验表明单纯使用此种引物，在较多反应模板的情况下将不能区分cccDNA和rcDNA。我们在PCR扩增前使用单链核酸特异性的绿豆芽核酸酶(mung bean nuclease，MBN)消化模板，发现从105~102不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后，均可扩增出相应条带；而105个rcDNA样品经过MBN消化后无法扩增任何相应条带。提示MBN预处理显着提高了PCR检测HBV cccDNA的特异性。2．适当浓度的苯巴比妥钠可以促进孕10周龄人胎肝细胞分化成熟，并诱导HBV易感性的出现。以非灌流法分离孕10周龄人胎肝细胞，细胞活力良好；接种后微量蓖麻毒素A亚单位处理能够有效纯化肝实质细胞。以自行设计无血清培养基为基础，建立10种培养条件，发现添加2.5mM苯巴比妥钠在培养10日后，仍可以保持胎肝细胞呈典型多边形形态，在抑制了胚胎特异性基因如甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)表达的同时，促进了成熟肝细胞特异性基因如白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的表达。由此提示苯巴比妥钠可诱导人胎肝细胞向成熟肝细胞表型分化。HBV体外感染实验发现，培养基中添加苯巴比妥钠可诱导孕10周龄人胎肝细胞在培养第6日起出现HBV易感性，并保持至第10日培养结束。其他培养条件及阴性对照、空白对照均不能被HBV成功感染。3．“双重削减”策略鉴别出HBV易感性出现前后基因表达变化。 我们在本研究的最后部分创立了双重削减策略，即实验组内检测相与驱动相之间的抑制性削减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)，以及实验组和背景组之间的对比削减，实验结果发现，此种策略减少了无关新基因对实验结果判断的干扰。 重复苯巴比妥钠诱导实验表明，HBV易感性出现可能与胎肝细胞遗传背景无关；以添加苯巴比妥钠的培养组为实验组，未添加的为背景组；选择易感性出现前的培养第3日为驱动相、易感性出现后的第6日为检测相，同时以SSH检测实验组和背景组的基因变化。通过校验步骤，实验中多个关键环节的结果均符合预期；最终的SSH实验结果显示，“虚拟”对照削减成功显示出预知的条带，且明显减少了驱动相和检测相之间相同基因cDNA的数量。 两组差异基因T/A克隆效率分别为97%和94%，随机挑取96个白色克隆，扩增插入片段后点膜建立4个cDNA阵列膜，分别以4种探针杂交，在背景组中鉴别出3个差异克隆，在实验组中鉴别出7个差异克隆。测序后获得10个不同的人类蛋白质基因，根据既往国内外有关研究结果进行简单筛选，发现其中蛋白酶体酶26s亚单位、血清粘蛋白和D-钙粘蛋白前体最有可能与HBV感染人胎肝细胞有关。 本课题创新点：1． 改良了HBV cccDNA的PCR检测法，明显提高了其特异性。2． 自

张克^[3]2005年在《乙型肝炎病毒体外感染胎肝细胞及阿德福韦耐药的初步研究》文中研究指明乙肝病毒感染仍然是一种严重影响人类健康的全球性疾病,全球大约有20亿人曾经感染过乙肝病毒,其中超过3.5亿人成为慢性感染者,每年可导致120万患者死亡,而且每年有32万患者死于乙肝病毒感染导致的肝癌。我国属于肝炎高发区,现患乙型肝炎为2800万。 治疗慢性乙型病毒性肝炎的主要手段是抗病毒,而且主张长期治疗。主要药物是:干扰素、拉米夫定、阿德福韦。采用干扰素治疗的主要问题是:胃肠道外给药,副作用较多。拉米夫定耐受性好,片剂,可以明显抑制HBV复制,但存在高变异耐药问题,报道拉米夫定服用1年后发生YMDD变异率最高可达32%的,一旦产生耐药,药效降低10000倍。针对耐拉米夫定的患者,国外主要采用阿德福韦替代或联合拉米夫定治疗,阿德福韦是单磷酸腺苷的核苷酸类似物,在体内通过细胞激酶作用被磷酸化为具有活性作用的二磷酸阿德福韦,二磷酸阿德福韦抑制HBV DNA多聚酶或逆转录酶作用。该药不久将在我国上市用于治疗慢性乙型肝炎,随着临床用药的日益普及,如何监控治疗过程中耐药性的产生将是一项重要的研究课题。 乙肝患者中25%～40%最终将死于肝硬化和肝癌,失代偿性肝硬化的5年生存率约为15%,对于重症肝病的治疗,以保守治疗为主,不能解决根本问题,最终只能寄希望于原位肝移植。 由于健康供体肝脏的严重短缺且费用昂贵,仅有少数需要肝移植患者可以接受原位移植治疗。肝细胞移植技术有可能解决不能进行肝移植患者,同时也更适合我国大量患者的经济承受能力。肝细胞移植治疗重症肝病,具有创伤性小、费用低廉、安全性高,免疫原性小,而且一个供体可以为多个受体提供细胞来源。经过多年的基础研究,肝细胞移植已经应用于临床,目前已有多位

参考文献：

[1]. 胎肝细胞对HBV感染应答基因的初步分离和鉴定[D]. 王方. 第叁军医大学. 2004

[2]. 早期人胎肝细胞乙型肝炎病毒感染相关分子的探索研究[D]. 汤勃. 第叁军医大学. 2003

[3]. 乙型肝炎病毒体外感染胎肝细胞及阿德福韦耐药的初步研究[D]. 张克. 第一军医大学. 2005

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