草鱼NRF2/ATF4通过相互作用上调HO-1的表达对抗内质网应激

论文摘要

内质网（ER）对细胞应激（包括代谢不平衡和/或蛋白质折叠不平衡）有很好的感觉和反应。对于第一个对内质网应激反应的受体,PERK与其他近端信号分子一起启动转录和翻译调节程序,称为未折叠蛋白反应（UPR）。持续的内质网应激的结果是活性氧物质的积累,以至于促进氧化应激状态。PERK信号通过激活核转录相关因子2（NRF2）和转录调节因子4（ATF4）来连接ER应激反应与氧化应激信号。NRF2同属于CNC家族,在其C-端含有一个典型的BRLZ结构域,并能通过调节下游靶基因血红素加氧酶1（HO-1）来减缓内质网应激程度。为了研究草鱼NRF2基因在内质网应激中的作用,我们重新克隆并鉴定了草鱼（Ctenopharyngodon idella）NRF2的开放阅读框（ORF）,发现这条ORF（1782bp）是能够编码593个氨基酸的多肽并且包含了一个保守的bZIP结构域。系统进化树显示草鱼NRF2与其它鱼类的NRF2在进化上有着更为密切的关系。不同时间段TM（衣霉素）刺激CIK细胞后,RT-PCR检测发现CiNRF2 mRNA水平明显上调。以CiBIP为靶标,过表达CiNRF2后CiBIP mRNA明显下调而干扰后RT-PCR检测CiBIP明显上调,证明CiNRF2可以缓解内质网应激。为了研究鱼类NRF2在内质网应激中的保护机制,我们将CiNRF2和Ci ATF4序列分别亚克隆到表达载体pEGFP和pCMV-FLAG中以进行CO-IP和GST-Pulldown分析实验。结果表明,CiNRF2可以与CiATF4相结合。为了研究相互作用的分子机制,分别构建不同结构体后进行CO-IP和GST-Pulldown分析,结果发现ΔNeh2结构域可能与CiATF4的相互作用有关。同时,克隆了Ci HO-1的启动子序列,将pGL3-HO-1重组质粒分别与pcDNA3.1-Ci NRF2或pcDNA3.1-Ci ATF4共转染到草鱼卵巢细胞（COs）中。结果表明,Ci NRF2和CiATF4均极显著地提高了PGL3-HO-1的荧光素酶活性。同时,分别转染不同结构体发现Neh4,5结构域能提高pGL3-HO-1的荧光素酶活性。最终,CCK-8实验证明CiNRF2通过上调HO-1的活性来提高细胞活力。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈欣

导师: 胡成钰

关键词: 内质网应激

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q953

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.001796

总页数: 58

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