导读:本文包含了多表位肽疫苗论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,疫苗,免疫,病毒,肿瘤,佐剂,细胞。
多表位肽疫苗论文文献综述
张富东[1]（2019）在《口蹄疫多表位靶向疫苗的构建及黏膜免疫效果》一文中研究指出口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病,主要侵害猪、牛、羊等家畜和其它野生偶蹄动物。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。世界动物卫生组织(OIE)将FMD列为动物A类烈性传染病,严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易,对国家的政治、经济具有深远的影响。黏膜作为机体与外界连通的门户,对于FMDV的侵入有很大的助力作用。微皱褶细胞(Microfold cell,简称M细胞)是黏膜免疫反应中摄取抗原的第一个细胞,是黏膜相关淋巴组织的初始效应位点。摄取抗原是诱导免疫反应最关键的一步。所以M细胞在病原微生物从呼吸道入侵和黏膜免疫呈递抗原中均发挥重要的作用。本研究成功构建了两株重组乳酸乳球菌,分别命名为NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1。利用乳酸乳球菌表达(NICE)系统表达目的蛋白TB1和TB1-Co1,研究重组乳酸乳球菌的免疫效果以及靶向M细胞的可行性,为口蹄疫新型疫苗的研发和口蹄疫的防治提供新途径。本研究的主要内容如下:1.TB1和TB1-Co1的合成及其生物信息学分析:根据乳酸乳球菌密码子的偏好性对多表位TB1和TB1-Co1的编码基因进行优化合成,连接到克隆载体pUC57上。通过生物信息学得到多表位TB1和TB1-Co1具有作为良好抗原的潜力,对进一步的研究打下理论基础。2.目的蛋白在乳酸乳球菌中的表达及鉴定:将目的基因片段TB1和TB1-Co1连接到表达载体pNZ8148上,得到重组质粒pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1,电转化到乳酸乳球菌NZ9000中,通过质粒提取、双酶切鉴定、测序分析筛选出阳性重组乳酸乳球菌,得到重组菌NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1。使用诱导剂nisin诱导目的蛋白表达,并对表达条件进行优化。Western blot检测可见目的条带,表明目的蛋白在乳酸乳球菌NZ9000中得到表达。3.重组乳酸乳球菌(NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1)黏膜免疫效果分析:用重组乳酸乳球菌经灌胃免疫小鼠,进行免疫原性分析,其中PBS作为空白对照,NZ9000/pNZ8148作为空载体对照,灭活苗作为阳性对照组。结果显示,实验组肠道黏液中sIgA水平明显高于阴性对照组和空载体对照组,但血清内特异性IgG抗体效价比较低;实验组小鼠淋巴细胞中CD4~+细胞和CD8~+细胞的比值高于阴性对照组;小鼠脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖明显;细胞因子检测结果表明,与阴性对照组相比,实验组的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的量都有不同程度的增高,以上结果表明,重组乳酸乳球菌作为口服活载体疫苗可以诱导小鼠产生FMDV特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。4.靶向实验:用诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1和NZ9000/pNZ8148-TB1接种小鼠,获取小鼠小肠组织做成石蜡切片,经荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察。结果表明,前者的红色荧光和绿色荧光的结合较多。这表明Co1对M细胞具有靶向作用,可增强机体的免疫应答。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-05-01）
李国,樊超强,赵敦勇,张天一,陈琨[2]（2019）在《DEC-205靶向的肝素酶CD4~+CD8~+T细胞表位肽纳米颗粒疫苗的抗肿瘤免疫效应研究》一文中研究指出目的探索肝素酶CD4~+CD8~+T细胞表位肽纳米颗粒疫苗诱导CTL抗肿瘤免疫反应的可行性,并研究其抗肿瘤免疫杀伤效应。方法根据文献报道方法制备肝素酶表位肽纳米颗粒疫苗;采用流式细胞术检测DEC-205靶向的肝素酶表位纳米颗粒疫苗与树突状细胞(DC)的结合力及入胞效率;采用标准4h~(51)Cr释放实验检测负载DEC-205靶向的肝素酶纳米颗粒疫苗诱导的效应细胞对胃癌及结肠癌细胞的杀伤效率;采用ELISA CD4~+CD8~+T细胞表位DEC-205靶向纳米颗粒疫苗,其颗粒直径为(208±15.3)nm,Zeta电位为(-28.8±2.5)mV;纳米颗粒对多肽的封包率为(22±3.6)%。纳米颗粒疫苗可与树突状细胞有效结合,并可以有效进入树突状细胞内,这种结合和内吞作用随着加入的纳米颗粒的浓度增加而增加。体外杀伤实验结果显示,在效靶比为80∶1时CD4~+CD8~+表位肽纳米颗粒疫苗诱导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效率可达70%,与单用CD8~+表位肽相比具有统计学意义(P<0.01);T细胞增殖实验结果提示,CD4~+CD8~+表位肽组细胞的细胞增殖率显着高于单独使用CD8+表位肽组,细胞因子检测结果提示CD~4+CD8~+表位肽组细胞培养上清中IL-2、IL-12、IFN-γ浓度显著高于单独使用CD8~+表位肽组(P<0.01)。结论采用DEC-205靶向PLGA颗粒包裹CD4~+CD8~+表位肽能够更加有效递送抗原信息,能更加有效地诱导CTL反应杀伤肿瘤细胞,本研究为TAA为基础的肿瘤免疫治疗提供一种新的方式。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2019年04期）
王月鹏[3]（2019）在《HIV-1多表位疫苗MEP1的表位保守性及佐剂比较研究》一文中研究指出艾滋病一直是困扰全球人类生命安全的重大传染性疾病。虽然高效抗逆转录病毒疗法(HARRT)极大程度上控制了HIV感染者的疾病进程,但依然无法阻断艾滋病毒的传播和感染,HIV治疗型疫苗可以有效降低艾滋病的传播速率和减缓患者的疾病进程。目前为止,世界范围内依然没有针对HIV的有效疫苗,为了实现中国HIV-1疫苗从0到1的跨步,本课题组针对中国人群优势MHC限制性和中国HIV-1流行趋势研发的多表位蛋白疫苗MEP1,包含9个CTL表位和1个Th表位富集区,并获得了国家专利授权。前期研究中表明MEP1蛋白在BALB/c小鼠模型中具有较好免疫原性,并且其诱导的免疫反应和中国人群的MHC限制性显着相关。如今中国HIV-1流行病毒株出现新的变化趋势,中国HIV流行株的表位保守性可能出现变化,需要分析这些变化对MEP1诱导的免疫反应的影响,同时探索不同佐剂于MEP1蛋白联合免疫诱导的免疫反应差异,优化MEP1的疫苗方案,本课题针对这两个问题开展了研究。1、中国HIV-1流行株变化趋势对多表位蛋白MEP1免疫作用的影响(1)MEP1所包含的CTL表位的保守性分析及其MHC限制性评价。以2014-2017年中国HIV-1流行株的数据为研究对象,通过数据库分析,分析MEP1所包含的9个CTL表位的保守性变化情况,并分析每个表位在不同HIV-1病毒亚型中的保守性差异,利用在线软件分析突变表位的MHC限制性和TAP亲和力。MEP1所涉及的9个CTL表位的保守性较好,氨基酸残基的突变多为同型氨基酸突变,不影响表位的MHC限制性评价和TAP亲和,保守性基本不受2014至2017年的年份变化的影响。P2、P3、P4、P6、P7、P8存在亚型偏倚型突变,表现为在不同HIV病毒亚型内表位的氨基酸突变呈现不同趋势,氨基酸残基的突变以同型氨基酸突变为主,非同型氨基酸残基突变几率极小,9个表位均具有较好的在保守性。(2)转基因HLA-A11/DR1小鼠体内免疫研究验证突位点对HLA-A11限制性CTL表位的影响。将MEP1蛋白免疫人转基因HLA-A11/DR1小鼠,以不同突变位点的表位体外刺激免疫小鼠脾细胞,通过比较不同表位的反应强度,观察突变位点对A11限制性表位的影响模型。结果表明不同氨基酸突变的A11限制性表位仍可产生特异性细胞免疫应答,说明MEP1依然适用于如今的中国HIV-1流行株的变化情况,多表位蛋白MEP1具有一定应对HIV-1病毒表位突变的能力。2、不同佐剂联合多表位蛋白MEP1免疫BALB/c小鼠的比较研究(1)多表位蛋白MEP1联合不同佐剂的免疫应答特征评价。将表达纯化的MEP1蛋白,采取前期研究确定的叁次免疫策略,进行BALB/c小鼠体内免疫研究。通过体液免疫应答和细胞免疫应答检测比较MF59和铝佐剂两种候选疫苗佐剂对MEP1诱导的免疫反应的差异。MF59和铝佐剂均能增强MEP1诱导的体液和细胞免疫应答,其中MF59促进MEP1诱导Th1/Th2均衡的细胞免疫应答,铝佐剂促进MEP1诱导Th1偏倚型的细胞免疫应答。(2)多表位蛋白MEP1联合不同佐剂在早期免疫中的免疫应答特征评价。过体液免疫应答和细胞免疫应答检测比较MF59和铝佐剂四种候选疫苗佐剂对MEP1诱导的免疫反应的差异。MF59和铝佐剂可促进MEP1诱导更强的免疫应答,铝佐剂能促进MEP1蛋白在早期免疫中更快产生较高水平的免疫应答,确定了以铝佐剂与MEP1蛋白的免疫策略。3、结论HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1具有良好的免疫原性,其所涉及的9个CTL表位均具有较好的保守性,P2、P3、P4、P6、P7和P8存在亚型偏倚型突变,绝大多数突变不影响表位的MHC限制性评价,MEP1依然适用于如今的中国HIV-1流行株的变化情况。铝佐剂更适合作为MEP1免疫策略的选择,铝佐剂可显着增强MEP1诱导的免疫应答,特别在早期免疫应答中,铝佐剂可使MEP1即可诱导出较强的体液和细胞免疫。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2019-02-01）
肖国辉[4]（2018）在《问号钩端螺旋体c-di-GMP信号通路初步探究及其多表位联合疫苗的研发》一文中研究指出钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的在全球广泛流行的人兽共患疾病。其中问号钩端螺旋体是最主要的致病性钩体,它在污染的土壤、水和不同的宿主之间穿梭时,经历温度、pH、渗透压等多种条件的改变。因此钩体应该具备完善的胞外信号转导系统,可以通过感知胞外环境变化调整自身的生理代谢以适应变化的环境。Cyclic di-GMP(c-di-GMP)是一种新发现的细菌第二信使,可以通过感知信号的变化调控细菌的诸多生理行为比如细胞周期、毒力、生物的形成、运动性和趋化性等等。二鸟苷酸环化酶(diguanylatecyclases,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)分别负责细菌 c-di-GMP 的合成与降解。c-di-GMP 通过与受体分子结合导致受体分子空间结构和活性改变,进而影响受体参与的代谢活动,导致激活或者抑制因子下游基因的转与表达,从而影响细菌的生理代谢活动。本研究中,我们运用生物信息学方法系统性分析了 15种钩端螺旋体c-di-GMP代谢相关酶的分布及进化情况,结果发现15种钩端螺旋体基因组中都含有大量的c-di-GMP合成酶和降解酶基因,表明在钩体中c-di-GMP是一个非常重要的第二信使。鉴于问号钩端螺旋体是国内主要流行的致病性钩体种类,因此我们深入分析了问号钩端螺旋体赖株56601的c-di-GMP信号通路。结果发现问号钩体基因组中含有25个c-di-GMP代谢相关基因,分别编码13个GGDEF结构域蛋白,3个GGDEF-EAL结构域蛋白,5个EAL结构域蛋白和4个HD-GYP结构域蛋白,且大部分c-di-GMP代谢酶与信号感知结构域相耦联。运用双荧光报告质粒系统检测问号钩体c-di-GMP代谢相关基因的酶活性,结果显示大部分DGCs和PDEs具有合成或降解c-di-GMP的能力。当我们分别删除LA1483基因的GAF信号感知结构域和LA2932基因的PAS信号感知结构域后发现LA1483和LA2932蛋白失去合成c-di-GMP的能力,表明PAS和GAF结构域对DGCs蛋白执行合成酶功能非常重要。而我们删除LA2528基因的REC结构域序列后发现其仍然可以合成c-di-GMP。当问号钩体从28°C培养条件转移至37℃培养条件时,HPLC-MS/MS测量钩体c-di-GMP含量发现,c-di-GMP水平下降,real-time PCR检测发现c-di-GMP代谢相关基因的表达模式多样化。通过real-time PCR检测c-di-GMP代谢相关基因的mRNA相对表达丰度,发现大部分的基因表达量非常低,而LA1483基因表达量非常高,几乎是其他基因的几百倍。当问号钩体感染小鼠J774A.1细胞后,HPLC-MS/MS检测发现,问号钩体胞内c-di-GMP水平下降,然而real-time PCR结果显示感染期间似乎并不影响c-di-GMP代谢相关基因的表达。此外,通过EMSA实验我们鉴定出了两个能与问号钩体能够c-di-GMP发生结合的PilZ结构域蛋白。钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的再现性人兽共患病,全世界每年有将近50万份该病例报告。疫苗接种是预防和控制钩体病的最有效的措施。目前广泛应用的钩体疫苗还是灭活的钩体全菌疫苗。然而钩体全菌疫苗表现短时间免疫原性,副作用,血清群特异性明显等缺点,使得该疫苗的应用受到极大的限制。因此,开发一种通用的、高效力的和低毒性的钩体疫苗显得尤为急切。钩体外膜蛋白(Outer Membrane Proteins)OMPs,位于菌体表面,直接参与细菌与宿主的相互作用,且在不同血清型中比较保守,使得其成为目前钩体病疫苗开发的热点,但仍不能克服其血清群特异性免疫的特点。本实验中我们根据之前实验筛选和鉴定的钩体外膜蛋白OmpL1,LipL21和LipL32中的六个优势T-细胞和B-细胞联合抗原表位肽序列人工合成一条六表位肽联合DNA序列。通过DNA重组技术将六表位肽DNA序列串联四次,合成一条四重复的六表位肽融合序列,简称为r4R,并且克隆至pET28a表达载体中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组质粒很好地表达了目的蛋白,且诱导表达的蛋白以可溶性形式存在。Western bolt实验证实r4R重组蛋白可以与钩体抗血清反应。通过MAT(Microscopic agglutination tests)检测r4R抗血清的交叉免疫反应,发现r4R抗血清可以与国内流行的主要血清型钩体产生凝集反应,表明r4R疫苗可能具有交叉保护效果。ELISA检测r4R抗血清发现IgG1和IgG2a水平明显升高,且IgG2a>IgG1。添加r4R刺激经r4R疫苗免疫后的小鼠脾细胞,经CCK-8试剂盒检测发现显着性促进脾细胞的增殖。ELISA检测脾细胞培养上清液发现IFN-γ水平明显升高。这些结果表明r4R疫苗倾向诱导Th1细胞免疫。在钩体攻毒实验中,我们发现免疫r4R疫苗后显着提高豚鼠的存活率,而PBS对照组的豚鼠则全部死亡。HE染色观察组织病变情况,r4R免疫的豚鼠各组织没有明显的病理改变,而PBS对照组豚鼠各组织均出现明显的病理改变。(本文来源于《浙江大学》期刊2018-03-01）
张尔夫[5]（2018）在《肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗构建及其免疫原性检验》一文中研究指出目的:肺孢子菌肺炎(Pneunocystis pneumonia,PCP),是由机会性致病真菌——肺孢子菌(Pneumocystis,Pc)所引起的一种感染性疾病,最常发生于肺部,严重可致死。PCP最开始引起人们的关注是由于研究揭示了它与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染密切相关,特别在1981年将PCP定义为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的标志性疾病;近年来的流行病学资料显示,随着器官移植、恶性肿瘤、长期应用激素等非HIV感染的免疫功能抑制患者增多,在这类患者中并发PCP的临床病例不断上升,PCP再次引起了国内外研究者的极大关注。目前PCP临床治疗主要以复方磺胺甲基异恶唑为主,虽然能够取得一定的疗效,但因其毒副作用较大,造成部分患者不能耐受,加之出现的耐药性等问题,药物防治PCP面临严峻挑战。于是,国内外研究者纷纷将注意力转移到针对PCP的新防治策略及相关疫苗的开发上。先前有研究发现,作为Pc抗原成分之一的P55蛋白,在抗PCP中具有重要作用。机体主动免疫天然P55蛋白后,产生的免疫反应可以使机体在感染的初期得到一定程度的保护,故有研究者认为P55蛋白最有希望成为抗PCP的候选疫苗之一。然而,由于P55蛋白存在5种变异体,再加上到目前为止Pc在体外很难培养出足够的数量用于抗原制备,以致抗原的来源受阻,造成P55蛋白疫苗的开发一直没有取得有效进展。基于上述原因,本课题组利用生物信息学和分子生物学技术,人工设计构建了包括5种变异体有效抗原表位在内的p55多表位串联基因(p55TAG),并在前期研究中用原核表达载体及真核表达载体验证出p55TAG能有效表达出目的抗原蛋白,且该基因的分子疫苗在免疫抑制的大鼠PCP模型中具有一定的免疫保护潜力。但因Pc作为一种机会性感染真菌,主要侵犯免疫功能低下患者,对于这类人群采用常规单一的分子疫苗往往难以达到预期的免疫效果,于是课题组提出采用异质性“初次-加强免疫策略”(prime-booststrategy),即用两种异质的分子疫苗进行免疫,以提高疫苗抗PCP的效果。根据上述构想,本研究计划首先利用腺病毒载体搭载p55TAG构建一个重组腺病毒载体疫苗;其次验证其在真核细胞HEK293中的蛋白表达情况;最后用包装好的重组腺病毒载体疫苗免疫小鼠,检测小鼠体内相关免疫指标,以分析构建疫苗的免疫原性。期望能为抗PCP感染的异质性“初次-加强免疫策略”提供一种具有“加强免疫”作用的制剂,为最终建立有效的抗PCP疫苗奠定前期实验基础。研究方法:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增用BglⅡ和XhoⅠ双酶切pMD18-T克隆载体上p55TAG目的基因,产物测序鉴定;PCR扩增鉴定正确的目的基因,产物胶回收。2.p55TAG重组腺病毒载体构建经EcoRI酶切的腺病毒连接质粒pHBAd-EF1-MCS-GFP与p55TAG目的基因进行连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,PCR扩增Amp+LB培养基上的单克隆菌落,产物测序鉴定。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装将重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染进HEK293细胞后观察GFP表达及CPE改变,包装后的重组腺病毒命名为pHBAd-p55TAG。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定及真核细胞中目的蛋白表达提取pHBAd-p55TAG核酸,PCR扩增后产物测序鉴定;对重组腺病毒在HEK293细胞内所表达的蛋白进行SDS-PAGE与Western blot鉴定。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验5.重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定用pHBAd-p55TAG反复感染HEK293细胞叁次,收集最后一次的病毒液,CsCl梯度离心法纯化病毒,TCID50法测定纯化后的病毒滴度。6.重组腺病毒载体疫苗免疫动物将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠,按随机分组原则分为pHBAd-GFP、pHBAd-p55TAG、PBS叁组,每组10只;腹腔单针免疫,注射量为50μl/只。7.重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验于免疫后的第3d、1w、2w、3w末采集小鼠血清,MSD法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子的水平;ELISA法检测3w末小鼠血清中IgG总抗体、IgG1和IgG2a抗体亚类的水平;流式细胞术对3w末小鼠脾细胞进行CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群分析,同时用qPCR法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子相对表达量变化。8.统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差(X±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05表示有统计学差异。结果:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增结果从本室保存的载体上经酶切、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,结果在1200bp左右处出现特异条带(p55TAG基因片段全长1164bp),测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致。2.p55TAG重组腺病毒载体构建结果转化后,从Amp+LB平板挑选8个单克隆菌落,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,有6个转化子在1500bp处出现特异性条带,选取阳性PCR产物进行测序,测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致,证明重组腺病毒载体成功构建。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装结果重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,48h后观察到GFP明显表达,证明转染成功;8d后细胞出现典型CPE现象,证明重组腺病毒包装成功。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定结果PCR扩增pHBAd-p55TAG,产物电泳后在1500bp出现特异性条带,测序结果与原始p55TAG目的基因序列比对结果一致,证明包装出的腺病毒中携带有p55TAG目的基因。5.p55TAG重组腺病毒在HEK293细胞中蛋白表达结果Western blot显示:与空载病毒相比,重组腺病毒在60kDa处有一明显条带,与预期结果相符,证明pHBAd-p55TAG在HEK293细胞中成功表达出目的蛋白。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验6.重组腺病毒的扩增、纯化后滴度测定结果pHBAd-p55TAG扩增叁代,纯化后的病毒采用TCID50法测定的病毒滴度为1.99×1010PFU/ml,可用于下一步动物免疫实验。7.鼠脾CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群流式分析结果流式细胞术分析3w末小鼠脾T淋巴细胞,统计学分析结果显示;pHBAd-p55TAG组的CD4+T淋巴细胞升高水平相较于pHBAd-GFP和PBS组具有统计学意义(P<0.05;P<0.01);而在各组CD8+T淋巴细胞水平比较中,pHBAd-p55TAG组CD8+T淋巴细胞升高水平相较于PBS组具有统计学意义(P<0.05)。8.鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子变化水平分析结果MSD法检测鼠血清中四种细胞因子的浓度随时间变化水平,统计学分析结果显示:pHBAd-p55TAG组细胞因子IFN-γ和IL-17浓度升高水平相比其他两组具有统计学差异(P<0.01);而IL-2和IL-4的变化则不具有统计学意义(P>0.05)。9.鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类变化水平分析结果ELISA法检测3w末鼠血清中IgG抗体和IgG2a亚类的变化水平,与其他两组相比,pHBAd-p55TAG组显着升高(P<0.01),而抗体IgG1亚类在叁组之间的变化水平无统计学意义(P>0.05);计算叁组IgG2a与IgG1比值,进行统计学分析结果显示pHBAd-p55TAG组与其他两组比较具有统计学差异(P<0.05)。10.鼠脾细胞中四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测结果pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组相比PBS组四种细胞因子的表达量均有所升高,pHBAd-p55TAG组相较于PBS组,除IL-4外,其余叁种细胞因子的升高水平都具有不同程度的统计学差异,其中IL-17的升高具有极显着差异(P<0.001);在pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组的统计学比较中,只有IL-17的升高水平具有统计学意义(P<0.001)。结论:1.本研究成功构建出p55多表位串联基因腺病毒载体;2.包装后的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗,可在真核细胞HEK293中成功表达出目的蛋白;3.构建的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠后,能诱发小鼠体内细胞和体液免疫反应,验证其具有一定的免疫原性,为进一步抗肺孢子菌感染新策略、新疫苗研究奠定了实验基础。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-03-01）
张萍[6]（2017）在《H5、H1亚型多表位重组腺病毒疫苗的制备及安全性评价研究》一文中研究指出禽流感病毒(AIV)是一种人畜共患传染病的病原体,影响着全球人类的所有经济和健康问题。大多数禽流感病毒亚型很少甚至不能引起水禽患病,但家禽中爆发禽流感与死亡率高密切相关。虽然禽流感病毒很少传播给人类,该病毒经过突变或重组后具有引发危及生命的感染能力。新的流感病毒株的不断出现,使预测其表现、传播、毒力或人与人之间的传播潜力颇具挑战性。由于很难预测哪些病毒株或什么位置突变将引起下一次流感大流行,所以很难提前做好准备。疫苗接种能够起到有效预防作用,因此研究新型疫苗尤为重要。流感重组腺病毒疫苗能够刺激机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,且重组腺病毒载体具有稳定性好、安全性高和宿主范围广等优点,近年来受到人们广泛的关注,具有良好的发展前景。生物反应器微载体培养技术由于其培养表面积大、易于对细胞进行实时检测和控制,在疫苗生产领域被广泛应用。阴离子交换层析具有灵敏度高、选择性好、分离速度快等优点,分子筛层析具有操作条件温和、对于高分子物质分离效果好等优点,目前这两种层析纯化方法较为常用。本实验室构建了以季节性流感H5亚型和大流行性流感H1亚型HA(HA1)基因为主,以禽流感H1、H7和H9亚型HA抗原Th表位及M1表位为表达盒的重组腺病毒疫苗。通过7L生物反应器微载体培养系统对H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒进行大量培养,将发酵产物处理后,采用阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化,鉴定正确后,进行安全性评价试验。生物反应器培养HEK-293细胞,经过多次优化试验,确定培养参数为:温度:37℃、pH:6.9、搅拌速率:30r/min、溶氧:50%、CO2浓度:5%。培养24h后,85%以上细胞贴壁微载体,24-36h细胞增长率较高,48h更换培养液,84h细胞总数增长了4倍,之后细胞生长呈现下降趋势。利用生物反应器微载体培养技术大量扩增H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒,当HEK-293细胞长满微载体表面80-90%时,以5MOI接种H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒,48h后收取病毒液,处理后测得病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL。利用生物反应器培养的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒的病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,经过阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化后,病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,两步纯化的回收率分别为30.8%和89.3%,总回收率为27.5%,对纯化后的样品进行PCR鉴定,结果表明基因未丢失。检测260nm和280nm处吸光值OD260/OD280=1.25,符合纯度要求。将发酵和纯化后的重组腺病毒进行小鼠免疫实验研究和安全性评价。研究结果表明,经过两步纯化后的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗能够刺激机小鼠产生特异性抗体及细胞免疫应答,且两步纯化疫苗组的细胞因子水平高于其他疫苗组。安全性评价试验结果表明,两步纯化的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗的安全性良好。总之,本实验初步证明了生物反应器微载体培养系统扩增的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗,经阴离子交换层析和分子筛层析纯化后,能使小鼠产生体液免疫和细胞免疫,具有一定的保护性作用。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2017-05-01）
梁忠祥[7]（2017）在《小反刍兽疫多表位疫苗抗原的设计及其免疫效力评价》一文中研究指出小反刍兽疫病毒(PPRV)属于麻疹病毒属(Morbillivirus),是引起山羊和绵羊等小反刍动物急性传染病的病原,该病特点是高发病率和高死亡率,被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物传染病,我国将其列为I类动物疫病。最初,PPRV仅在山羊和绵羊上有报道,但近几年病毒种间传播的病例被不断出现。尽管该病毒只有一个血清型,但有四个基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),具有区域性分布的特点,目前该病主要分布于非洲和亚洲,正威胁欧洲。HN和F蛋白是镶嵌在病毒囊膜上的糖蛋白,HN蛋白能够与淋巴细胞上的SLAM受体相互作用介导病毒入侵,这可能是导致机体免疫抑制的主要原因。在病毒侵入过程中,F蛋白能够起到融合细胞膜和病毒囊膜的作用。另外,PPRV能引起机体强烈的细胞免疫和体液免疫应答,而HN和F蛋白则是主要的保护性抗原。本研究希望筛选出HN和F蛋白的B细胞抗原表位,进而设计小反刍兽疫多表位疫苗候选抗原。利用本实验室构建的pET21a-rPPRV-HN-F质粒,经过转化、诱导表达和纯化获得了rPPRV-HN-F蛋白;经过反应原性检测,发现rPPRV-HN-F蛋白与羊源PPRV阳性血清具有明显的反应原性,用该蛋白制备了与PPRV具有良好反应原性的单克隆抗体和多克隆抗体。同时,提取了PPRVVeroE6细胞毒培养基中的糖蛋白(PPRV-Glycoprotein),制备了小鼠多克隆抗体,经过反应原性和特异性检测发现效果良好。对China/Tib/07株和Nigeria 75/1毒株HN蛋白与羊SLAM受体复合物结构进行模拟,确定了相互作用的关键氨基酸。结合模拟的结构,利用免疫信息学工具对HN和F蛋白的B细胞表位进行了预测。将人工合成的表位肽包被在氨基化酶标板上,用间接ELISA方法检测了表位肽与PPRV特异性抗体的反应原性,发现了一批共11条具有反应原性的表位肽。将筛选的具有反应原性的部分表位肽串联,经过生物合成获得了一定纯度的多表位抗原。免疫小鼠检测了抗体水平和T淋巴细胞增殖情况,发现多表位抗原能使小鼠产生特异性的抗体。流式细胞术检测发现CD3~+CD4~+T淋巴细胞和CD3~+CD8~+T淋巴细胞有不同程度的升高,尤其是CD3~+CD8~+T淋巴细胞。本研究为小反刍兽疫表位疫苗研制奠定基础,对小反刍兽疫的预防与控制,甚至对全球消灭计划的实施都具有重大意义。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2017-05-01）
辛桂杰,朱海超,李昊,温剑平[8]（2016）在《最低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用》一文中研究指出目的:探讨采用最低限度免疫定义基因表达法制备丙型肝炎病毒(HCV)多表位DNA疫苗的可行性,阐明该方法在疫苗领域可能的应用价值。方法:采用人工合成和PCR方法制备长度为1 346bp的含有CMV启动子、HCV 1b亚型多表位和牛生长激素(BCG)多聚腺苷酸序列的最低限度免疫定义基因表达DNA疫苗,命名为M-HCV-epi;同时制备结构基因被非HCV同源的DNA序列替换的相同长度DNA片段作为对照,命名为V-pcDNA3.1。12只ICQ小鼠随机分为实验组(n=6)和对照组(n=6),分别采用M-HCV-epi DNA和V-pcDNA3.1DNA各20μg皮下注射。QRT-PCR法检测免疫后小鼠脾细胞中干扰素γ(IFN-γ)mRNA的表达水平;人工合成3个HCV 1b亚型表位多肽和1条对照多肽。用上述合成的多肽刺激免疫后小鼠脾细胞,ELISA法检测脾细胞刺激上清中IFN-γ水平。结果:与对照组比较,实验组小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达水平升高(1.50±0.18)倍(P<0.05);加入aa35-44多肽的实验组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平较对照组明显升高(P<0.05)。结论:最低限度免疫定义基因表达法制备HCV多表位DNA疫苗可诱导细胞免疫反应,该方法在DNA疫苗领域可能具有应用价值。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2016年06期）
于思淼,马金柱,王歆桐,王梦瑶,崔玉东[9]（2016）在《金黄色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究》一文中研究指出金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)常引起皮肤和软组织感染。由于S.aureus致病因子众多,且过去的疫苗倾向于诱导机体产生体液免疫应答,因而免疫保护效果均不理想。已经证明,CD8~+T细胞免疫应答特别是Th1和Th17在预防S.aureus感染过程中发挥主要作用。因而,有必要研究S.aureus抗原启动CD8~+T细胞应答的多表位疫苗的免疫原性和免疫保护作用。本研究对S.aureus IsdB蛋白的CD8~+T细胞表位进行筛选,并将其与Tra P蛋白的CD8~+T细胞表位、Tra P和FnBPA蛋白的线性B细胞表位串联,构建重组多表位疫苗,并研究其免疫原性和免疫保护作用。首先对S.aureus IsdB蛋白的二级结构及其与MHC结合能力进行预测分析,筛选合成6个可能的候选表位。将IsdB和候选表位分别与弗氏佐剂乳化后接种BALB/c和C57BL/6小鼠,检测候选表位刺激脾脏CD8~+T细胞增殖及其分泌的细胞因子水平。结果,候选表位P4(287-306aa)和P1(159-178aa)可分别促进BALB/c和C57BL/6小鼠CD8~+T细胞增殖并分泌高水平IFN-γ及IL-17A,与PBS组比差异极显着,而IL-4和IL-10的水平几乎保持不变。表明P4和P1主要引起Th1/Th17型免疫反应,分别属于H-2d和H-2b型CD8~+T细胞表位,且高度保守。在该研究基础上,将鉴定的2个IsdB蛋白CD8~+T细胞表位(P1和P4)与已获得的2个Tra P的CD8~+T细胞表位(Tra P20-39和Tra P94-113)、1个Tra P的线性B细胞表位(Tra P154-163)和2个Fnbp A的线性B细胞表位(Fnbp A352-364和Fnbp A763-772)串联表达,构建成为重组表位疫苗并命名为ITF。将纯化后的ITF与弗氏佐剂乳化,以腿部肌肉注射免疫接种BALB/c和C57BL/6小鼠,检测ITF诱导机体产生免疫应答水平。结果,两种小鼠免疫ITF后均可产生强烈的细胞和体液免疫应答。S.aureus Newman株攻击后,在对照组存活率分别为10%和20%时,ITF诱导BALB/c和C57BL/6小鼠产生的免疫保护率分别为60%和70%。(本文来源于《第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2016-11-04）
蒋朋飞,张丽芳[10]（2016）在《衣原体外膜蛋白多表位疫苗的研发》一文中研究指出目的:衣原体是全球性性传播疾病的主要病原体之一,危害很大。尽管衣原体感染可以有效地利用抗生素进行治疗,但是极其容易复发。综合来说,最经济有效地控制衣原体传播的方式是利用疫苗进行预防。然而,至今为止,尚没有可以有效控制该病原体的安全疫苗。在衣原体疫苗研发方面,选择合适的抗原和有效的抗原释放载体是两个最主要的问题。衣原体的外膜蛋白既包含T-和B-细胞表位,又在不同血清型的衣原体间高度保守。这些特点使之成为研发衣原体疫苗的最佳候选抗原。然而,大规模商业化生产具有天然活性的外膜蛋白是非常困难的。因此,我们尝试采用富含T-和B-细胞表位的外膜蛋白多表位多肽片段作为抗原设计疫苗。而合成的多肽片段由于免疫原性较弱,势必限制其免疫保护作用的发挥。为了加强多表位片段的免疫原性,我们又尝试将其与抗原性较强且能自折迭形成病毒样颗粒(VLP)的乙肝核心抗原(HBcAg)相融合表达。而HBcAg具有N-端、C-端和主要免疫优势区(MIR)等叁个外源蛋白融合位点。本研究主要从外膜蛋白多表位与HBcAg的多种融合方式以及多个表位串联对其免疫原性和免疫保护性的影响着手探讨衣原体多表位疫苗的研发。材料和方法:首先,我们构建了经生物信息学筛选获得的外膜蛋白表位与HBcAg多种融合表达载体,并进行了原核表达和蛋白纯化及VLP的形成。然后,我们用各种融合VLP免疫小鼠,检测免疫后不同时间点血清IgG和分泌型IgA水平,并进行了CTL实验,检验各种VLP的免疫原性。最后,我们将各种融合VLP免疫后的小鼠生殖道感染衣原体,通过衣原体清除率和组织病理切片判断各种VLP的免疫保护性。结果:在免疫原性方面,多表位与HBcAg的叁种融合方式所表达的原核蛋白均能自折迭形成VLP,与合成多表位肽段相比,大大提高了多表位的免疫原性,其中,多表位与HBcAg的N-端相融合的VLP免疫原性最强。在免疫保护性方面,融合VLP免疫组对小鼠生殖道感染衣原体的清除率,显着性优于合成肽免疫组;从生殖道组织病理切片上判断,相对于合成肽免疫组,融合VLP免疫组对小鼠也具有明显高的保护性。另外,无论是免疫原性还是免疫保护性,多个表位的串联效果都要明显优于单个表位。结论:因此,我们的研究结果可为衣原体多表位疫苗的研发及抗原表位释放载体的研究提供实验依据,奠定坚实的基础。(本文来源于《浙江省免疫学会第十次学术大会论文集》期刊2016-08-05）
多表位肽疫苗论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的探索肝素酶CD4~+CD8~+T细胞表位肽纳米颗粒疫苗诱导CTL抗肿瘤免疫反应的可行性,并研究其抗肿瘤免疫杀伤效应。方法根据文献报道方法制备肝素酶表位肽纳米颗粒疫苗;采用流式细胞术检测DEC-205靶向的肝素酶表位纳米颗粒疫苗与树突状细胞(DC)的结合力及入胞效率;采用标准4h~(51)Cr释放实验检测负载DEC-205靶向的肝素酶纳米颗粒疫苗诱导的效应细胞对胃癌及结肠癌细胞的杀伤效率;采用ELISA CD4~+CD8~+T细胞表位DEC-205靶向纳米颗粒疫苗,其颗粒直径为(208±15.3)nm,Zeta电位为(-28.8±2.5)mV;纳米颗粒对多肽的封包率为(22±3.6)%。纳米颗粒疫苗可与树突状细胞有效结合,并可以有效进入树突状细胞内,这种结合和内吞作用随着加入的纳米颗粒的浓度增加而增加。体外杀伤实验结果显示,在效靶比为80∶1时CD4~+CD8~+表位肽纳米颗粒疫苗诱导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效率可达70%,与单用CD8~+表位肽相比具有统计学意义(P<0.01);T细胞增殖实验结果提示,CD4~+CD8~+表位肽组细胞的细胞增殖率显着高于单独使用CD8+表位肽组,细胞因子检测结果提示CD~4+CD8~+表位肽组细胞培养上清中IL-2、IL-12、IFN-γ浓度显著高于单独使用CD8~+表位肽组(P<0.01)。结论采用DEC-205靶向PLGA颗粒包裹CD4~+CD8~+表位肽能够更加有效递送抗原信息,能更加有效地诱导CTL反应杀伤肿瘤细胞,本研究为TAA为基础的肿瘤免疫治疗提供一种新的方式。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
多表位肽疫苗论文参考文献
[1].张富东.口蹄疫多表位靶向疫苗的构建及黏膜免疫效果[D].中国农业科学院.2019
[2].李国,樊超强,赵敦勇,张天一,陈琨.DEC-205靶向的肝素酶CD4~+CD8~+T细胞表位肽纳米颗粒疫苗的抗肿瘤免疫效应研究[J].免疫学杂志.2019
[3].王月鹏.HIV-1多表位疫苗MEP1的表位保守性及佐剂比较研究[D].安徽医科大学.2019
[4].肖国辉.问号钩端螺旋体c-di-GMP信号通路初步探究及其多表位联合疫苗的研发[D].浙江大学.2018
[5].张尔夫.肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗构建及其免疫原性检验[D].中国医科大学.2018
[6].张萍.H5、H1亚型多表位重组腺病毒疫苗的制备及安全性评价研究[D].吉林农业大学.2017
[7].梁忠祥.小反刍兽疫多表位疫苗抗原的设计及其免疫效力评价[D].中国农业科学院.2017
[8].辛桂杰,朱海超,李昊,温剑平.最低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用[J].吉林大学学报(医学版).2016
[9].于思淼,马金柱,王歆桐,王梦瑶,崔玉东.金黄色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究[C].第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编.2016
[10].蒋朋飞,张丽芳.衣原体外膜蛋白多表位疫苗的研发[C].浙江省免疫学会第十次学术大会论文集.2016
论文知识图
