七鳃鳗pdcd基因家族分子进化和L-PDCD5介导细胞凋亡的研究

论文摘要

程序性细胞死亡（Programmed cell death,PDCD）基因在细胞存活、凋亡和死亡的调节中起着重要作用。为了深入了解PDCD家族的进化和分子功能,本文对东北七鳃鳗（Lampetra morii Berg）三代测序文库和 ESTs（Expressed Sequence tags）进行筛查,首次在七鳃鳗中发现了类似程序性细胞死亡的基因,进而为PDCD家族在进化过程中结构和功能的演变提供研究基础。研究分析表明,L-pdcd基因家族的核苷酸序列及其表达蛋白质的氨基酸序列分别与人的pdcd基因家族序列具有高度的相似性,本文将这些基因分别命名为 L-pdcd2、L-pdcd4、L-pdcd5、L-pdcd6 和 L-pdcd10。本文对来自脊椎动物的PDCD家族进行了包括基因的直系同源物、保守的同线性、功能结构域和系统发育树等方面的分析,发现L-PDCD蛋白家族之间含有不同的结构域和三级结构,但与其它物种对应的亚型却没有明显差异。在pdcd基因家族的进化上,七鳃鳗与其它物种都有很强的保守性。此外,本文还进行了无颌脊椎动物和颌骨脊椎动物之间的遗传图谱比较,以观察L-pdcd基因家族的同线性关系。在研究L-pdc究基因家族的分布和应对病原体的免疫反应过程中,通过半定量分析发现,L-pdcd基因家族成员在七鳃鳗的不同组织中分布有显著差异,并且它们均呈现广谱性表达。实时定量PCR研究发现,在转录水平上L-pdcd基因家族通过抑制或干扰细胞凋亡来应对革兰氏阴/阳性菌和病毒的刺激。为了检测在病原体刺激下L-PDCD家族蛋白水平变化情况,Western Blotting实验和高效液相色谱-质谱联用技术检测证明了 L-PDCD5蛋白本身以三聚体形式稳定存在于七鳃鳗体内,当不同病原体刺激七鳃鳗后,L-PDCD5蛋白以二聚体或单体形式来参与七鳃鳗免疫反应。在蛋白质功能研究中,激光共聚焦和流式细胞术检测发现在七鳃鳗白细胞和人的MCF-7细胞的培养基中分别加入rL-PDCD5蛋白后,rL-PDCD5蛋白通过内吞方式穿过细胞膜由细胞质向细胞核迁移来诱导细胞的凋亡。此外,在细胞中分别过表达L-pdcd2/5这些基因来研究它们在细胞凋亡中的作用。激光共聚焦检测发现L-PDCD2/5蛋白在细胞中定位是不同的,并且活细胞工作站观察到随着L-pdcd5基因在HeLa细胞中转染时间的延长,出现细胞膜鼓泡、细胞核形态发生改变以及L-PDCD5蛋白出现颗粒状等现象。CCK8（Cell Counting Kit 8）和流式细胞术实验发现L-pdcd2/5基因的转染可诱导细胞的凋亡,但L-pdcd5基因的过表达诱导细胞凋亡的能力更强。为了研究L-PDCD5激活凋亡调节的机制,实时定量PCR和Western Blotting实验发现L-PDCD5 过表达引起的细胞变化与 BAX（BCL-2 Associated X Protein）和 TP53（Tumor suppressor gene）信号传导途径有关。综上所述,本文的生物信息学数据不仅可以很好地诠释L-PDCD家族的进化,还揭示了凋亡过程中L-PDCD家族的保守性,并为PDCD家族介导的七鳃鳗免疫调节研究提供了新的视角。此外,本文进一步对L-pdcd基因家族成员中L-PDCD5免疫学功能进行初探,验证了该家族可以在七鳃鳗的细胞免疫反应及免疫防御中发挥重要作用。

论文目录

摘要

Abstract

英文缩略词对照表

第1章绪论

1.1 程序性细胞死亡

1.2 pdcd基因家族的概述

1.2.1 pdcd基因家族的分类

1.2.2 pdcd基因家族的分布

1.2.3 PDCD蛋白家族的结构

1.2.4 PDCD蛋白家族的功能

1.3 本文研究现状及其重要意义

第2章七鳃鳗pdcd基因家族起源进化分析

2.1 方法

2.1.1 生物信息学软件

2.2 结果

2.2.1 L-pdcd基因家族成员识别

2.2.2 L-PDCD蛋白家族系统发育分析

2.2.3 L-PDCD蛋白家族Motif分析

2.2.4 L-PDCD蛋白家族结构域分析

2.2.5 L-PDCD蛋白家族三级结构模拟

2.2.6 L-pdcd基因家族外显子分析

2.2.7 L-PDCD蛋白家族同线性分析

2.3 讨论

第3章七鳃鳗pdcd5基因分子克隆及蛋白表达和多克隆抗体制备

3.1 材料

3.1.1 动物材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 L-pdcd5基因的克隆

3.2.2 L-pdcd5基因的原核重组载体构建

3.2.3 L-PDCD5蛋白表达和纯化

3.2.3.1 L-PDCD5蛋白小量诱导表达

3.2.3.2 L-PDCD5蛋白大量表达并纯化

3.2.3.3 L-PDCD5蛋白浓度测定

3.2.4 L-PDCD5蛋白多克隆抗体的制备及检测

3.2.5 L-pdcd5基因的真核重组载体构建

3.3 结果

3.3.1 L-pdcd5基因全长cDNA的扩增

3.3.2 L-pdcd5原核重组质粒的构建

3.3.3 L-PDCD5蛋白表达和纯化

3.3.4 L-PDCD5多克隆抗体效价和特异性检测

3.3.5 L-pdcd5真核重组质粒的构建

3.4 讨论

第4章七鳃鳗pdcd基因家族在各组织的分布及不同抗原刺激下的免疫应答

4.1 材料

4.1.1 动物材料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 七鳃鳗各组织总RNA的提取

4.2.2 七鳃鳗各组织cDNA模板的制备

4.2.3 半定量检测L-pdcd基因家族在各组织的分布情况

4.2.4 实时定量PCR检测不同抗原刺激后L-pdcd基因家族的变化

4.2.5 流式细胞术和Western Blotting实验检测GCRV和鳗弧菌刺激后L-PDCD5蛋白的变化

4.2.6 数据统计

4.3 结果

4.3.1 七鳃鳗各组织RNA的提取及cDNA模板的制备

4.3.2 半定量检测L-pdcd基因家族的分布情况

4.3.3 实时定量检测L-pdcd基因家族应答三种抗原刺激下表达情况

4.3.4 GCRV和鳗弧菌刺激七鳃鳗白细胞后L-PDCD5蛋白结构发生改变

4.4 讨论

第5章七鳃鳗重组PDCD5蛋白的内吞及诱导细胞凋亡

5.1 材料

5.1.1 实验材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器

5.2 方法

5.2.1 激光共聚焦检测白细胞中L-PDCD5蛋白定位以及rL-PDCD5蛋白对白细胞的影响

5.2.2 流式细胞术检测七鳃鳗白细胞内吞rL-PDCD5蛋白效率

5.2.3 高内涵检测rL-PDCD5蛋白对MCF-7细胞影响

5.2.4 流式细胞术检测rL-PDCD5蛋白对MCF-7和H293T细胞的影响

5.2.5 数据统计

5.3 结果

5.3.1 L-PDCD5定位在七鳃鳗各组织细胞的细胞质中

5.3.2 七鳃鳗白细胞对rL-PDCD5蛋白的内吞

5.3.3 MCF-7细胞对rL-PDCD5蛋白的内吞

5.3.4 rL-PDCD5蛋白能进入MCF-7和H293T细胞内诱导细胞凋亡

5.4 讨论

第6章转染L-pdcd5基因参与细胞凋亡过程及分子机制

6.1 材料

6.1.1 实验材料

6.1.2 主要试剂

6.1.3 主要仪器

6.2 方法

6.2.1 激光共聚焦检测L-pdcd2/5在HeLa和H293T细胞中过表达

6.2.2 活细胞工作站检测L-pdcd5在HeLa细胞中过表达

6.2.3 CCK8和流式细胞术检测L-pdcd2/5在H293T细胞中过表达

6.2.4 实时定量PCR检测过表达L-pdcd5的H293T细胞中凋亡相关因子的变化

6.2.5 Western Blotting检测过表达L-pdcd5的H293T细胞中凋亡相关因子的变化

6.2.6 数据统计

6.3 结果

6.3.1 过表达L-pdcd5在HeLa细胞中的定位

6.3.2 过表达L-pdcd5诱导HeLa细胞形态发生变化

6.3.3 过表达L-pdcd5在H293T细胞中的定位

6.3.4 过表达L-pdcd5诱导H293T细胞凋亡

6.3.5 过表达L-pdcd5引起H293T细胞中凋亡相关重要通路分子的变化

6.4 讨论

结论

本论文的创新点

参考文献

附录A 东北七鳃鳗pdcd基因家族序列号

附录B 半定量检测L-pdcd基因家族的分布情况

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 关鑫

导师: 逄越

关键词: 七鳃鳗,家族,凋亡反应,免疫

来源: 辽宁师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 辽宁师范大学

基金: 国家自然科学基金项目七鳃鳗免疫蛋白LIP的基因表达调控及其对病原体防御作用的分子机制(项目编号:31772884)

分类号: Q953

DOI: 10.27212/d.cnki.glnsu.2019.000123

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七鳃鳗pdcd基因家族分子进化和L-PDCD5介导细胞凋亡的研究

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