周莹冰[1]2003年在《反义人血管生成素重组逆转录病毒载体的构建及其体外功能的初步研究》文中研究指明新生血管生成是许多病理及生理过程中非常关键的环节。在恶性肿瘤中，无论是原发瘤生长，还是向远隔部位转移，均依赖于肿瘤细胞或宿主细胞不断释放致血管生成因子诱导新生血管的生成，通过新生毛细血管为肿瘤提供必要的营养，带走肿瘤代谢产物，为肿瘤的生长和转移提供必要的条件。已有研究证实：针对不同的致血管生成因子或分子的拮抗剂在体内实验中可抑制肿瘤的生长。因此，干预肿瘤诱导的血管生成过程，可能会抑制肿瘤生长及转移。血管生成素(angiogenin，简称ANG)是1985年从人结肠癌细胞系HT-29细胞培养上清中发现的一种分子量为14.1KD的单链碱性蛋白，与血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)一样，具有较强的促新生血管内皮细胞生长的作用。它通过与血管内皮细胞表面受体α-actin结合，经细胞内吞作用进入到内皮细胞内，激活内皮细胞蛋白水解酶活性，降解基底膜成分，为内皮细胞迁移和形成新的毛细血管提供条件。近年的研究表明，ANG在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，参与了肿瘤血管的发生与成熟过程，与肿瘤的快速生长和转移有密切关系。由于ANG参与血管生成的发生与发展，因此ANG拮抗剂的研究在临床上具有一定的潜力和应用价值。目前，国内外对于ANG拮抗剂的研究主要是针对已经生成的ANG蛋白及ANG与其受体之间的相互作用的不同环节。如：ANG的单抗mAb26-2F、cAb26-2F；针对ANG受体结合位点的互补肽chANG、chGNA，还有用噬菌体文库建立的拮抗肽ANI-E；肌动蛋白及抗肌动蛋白抗体；新生霉素，白介素-1等等。最近，有文献报道，利用反义寡核苷酸能直接抑制或封闭ANG的转录与表达，从而抑制人类某些肿瘤的移植瘤在无胸腺小鼠体内的生长。本实验所构建的反义ANG逆转录病毒载体是应用反义基因技术原理，通过载体表达的反义RNA与ANG的mRNA特定序列的碱基互补配对结合成反义RNA-靶RNA二聚体，在mRNA剪切、转运和翻译叁个水平上有效抑制了ANG蛋白的分泌，与反义寡核苷酸相比，由于转染到细胞内的反义基因可以利用载体进行复制，因此，只要该载体不被机体清除，表达基因功能不被抑制，基因产物就可长期维持。本实验采用逆转录病毒作为表达载体，首先，通过RT-PCR合成人ANG成熟肽<WP=10>cDNA，再将cDNA反向插入逆转录病毒载体，获得重组质粒载体，经PA317包装细胞包装成假病毒后转染目的细胞A549，利用逆转录病毒转染效率高，外源基因表达稳定等优点，以达到抑制细胞内ANG蛋白的表达，从而在根本上阻断肿瘤细胞分泌ANG所引起的异常血管增生，达到抑制肿瘤发展与转移的目的，为将反义ANG基因应用于抗血管生成的基因治疗奠定了基础。方法1. RT-PCR扩增出人ANG成熟肽cDNA将人肺癌细胞株A549用RPMI1640培养基培养至细胞数达到107左右，Trizol提取细胞总RNA，紫外定量后，稀释为1μg/μl。取1μl总RNA为模板，加入P1、P2引物各10pmol，总反应体系为50μl，放入PCR热循环仪中，反应条件为：48℃ 45min，94℃ 2min，进入循环：94℃ 30s，62℃ 1min，68℃ 1min，循环35次后，68℃ 7min，4℃保存。取5μl反应产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，观察PCR结果。2. PCR产物克隆于T载体中PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与pMD18-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，从转化的平板上挑取克隆，质粒提取试剂盒提取质粒，送交TaKaRa公司测序。3. 逆转录病毒质粒载体的构建T-ANG重组质粒用BamH I酶切，回收ANG cDNA片段；逆转录病毒质粒载体pBabe/neo也用BamH I酶切使之线性化，回收纯化后用碱性磷酸酶去除末端磷酸。将线性化的pBabe/neo与ANG片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，从转化的平板上挑取克隆，酶切鉴定方向，分别获得正义与反义的逆转录病毒重组质粒。4. 重组逆转录病毒的包装与滴度的测定用DMEM高糖培养基培养PA317细胞达60%~70%融合时，将正义重组质粒(s-pBabe)、反义重组质粒(as-pBabe)及空质粒(pBabe)用电穿孔的方法转入PA317包装细胞中，并设未转染组对照，转染48h后，细胞按1:4传代，并用含500μg/ml G418的DMEM高糖培养基进行筛选。待抗性细胞稳定后，收集含假病毒颗粒的培养上清液转染NIH3T3细胞，进行病毒的滴度测定。5. ELISA测定重组载体对ANG表达的影响选择高滴度的病毒液转染A549细胞，并设未转染组对照，用含500μg/ml G418的RPMI1640培养基进行筛选。待抗性细胞稳定后，按8×102的数量接种96孔板，72h后取培养上清与ANG标准品(浓度分别为0，78，156，312，625，1250，2500，5000pg/ml)加到ELISA试剂盒的微量滴定孔中，按试剂盒说明书进行操作，最后在<WP=11>450nm处用HTS7000型酶联仪测定每孔的吸光度值，通过与人ANG的标准曲线进行比较后对培养基中ANG水平进行定量分析，确定培养上清中ANG的含量。结果1. RT-PCR扩增ANG基因并克隆于T-载体中以人肺癌细胞株A549中提取的总RNA为模板，经RT-PCR扩增出大小为385bp的人ANG基因片段，经纯化后克隆于T-载体中，转化大肠杆菌DH5α，挑取3个克隆，经BamH I酶切鉴定均含有插入片段，挑取其中一个克隆做序列测定，结果与文献报道的完全一致。2. 人ANG?
周莹冰, 刘松青, 唐敏[2]2004年在《反义人血管生成素的真核表达载体的构建及其体外功能的初步研究》文中提出目的 构建含反义人血管生成素的真核表达载体 ,并转染人肺癌细胞株A5 4 9,使之特异性地封闭A5 4 9细胞中血管生成素的表达 ,以达到抑制肿瘤生长的目的。方法 用RT PCR的方法合成血管生成素的cDNA ,将其反向克隆入逆转录病毒质粒载体中 ,通过PA317细胞包装为假病毒颗粒 ,体外转染肺癌细胞株A5 4 9。结果 构建出含反义血管生成素的逆转录病毒载体 ,感染A5 4 9细胞后 ,能有效抑制A5 4 9细胞血管生成素蛋白的表达。结论 利用反义血管生成素的逆转录病毒载体能够有效抑制培养细胞血管生成素的表达 ,为今后的体内应用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 反义人血管生成素重组逆转录病毒载体的构建及其体外功能的初步研究[D]. 周莹冰. 第叁军医大学. 2003
[2]. 反义人血管生成素的真核表达载体的构建及其体外功能的初步研究[J]. 周莹冰, 刘松青, 唐敏. 重庆医学. 2004