树突状细胞调节T细胞免疫应答的分子机制研究

侯万秋^[1]2004年在《树突状细胞调节T细胞免疫应答的分子机制研究》文中提出本研究主要分析外源性免疫调节剂百日咳毒素,和内源性免疫调节剂细胞因子γ-干扰素,通过专职性抗原呈递细胞,树突状细胞(DC),调节T细胞免疫应答和自身免疫病的分子机制。 百日咳毒素做为一种免疫佐剂,被广泛应用于Th1细胞免疫反应介导的实验性自身免疫病的动物模型的诱导。百日咳毒素具有提升Th1细胞免疫反应的生物学作用,使疾病的低敏感动物品系转变为疾病的敏感型。但对于百日咳毒素如何加强Th1细胞免疫反应的细胞学基础,及其分子生物学机制仍未确定。DC对于免疫反应的诱导和维持起着非常重要的作用,它可以激活初始型T细胞和启动自身免疫反应。我们选择DC做为假定的细胞类型,来研究百日咳毒素的佐剂作用。发现百日咳毒素处理过的DC,可以替代百日咳毒素发挥佐剂作用,加强诱导Th1细胞免疫反应介导的实验性自身免疫葡萄膜炎。在体外,百日咳毒素处理过的DC,诱导T细胞分泌Th1细胞免疫反应细胞因子-γ-干扰素。百日咳毒素在体外诱导了DC的成熟,IL-12 和 TNF-α的分泌。在小鼠体内注射百日咳毒素处理过的DC,增加了小鼠血清中的IL-12含量。进而发现extracellular signal-regulatedkinase (ERK)介导了百日咳毒素对于DC的生物学活性。当ERK信号转导通路被抑制后,百日咳毒素处理过的DC的成熟程度和IL-12 和 TNF-α的产生明显降低。体外诱导T细胞分泌γ-干扰素的能力,和体内诱导实验性自身免疫葡萄膜炎的能力均受到抑制。因此,百日咳毒素通过DC的介导,促进实验性自身免疫葡萄膜 - 1 -炎诱导。该研究工作,一方面阐明了百日咳毒素在体内作为免疫佐剂的分子作用机制;另一方面,由于Th1细胞的分化是细胞免疫调节的关键问题,因为其在自身免疫病和器官移植排斥反应的诱导,和抗感染免疫反应中起着决定性作用。故百日咳毒素处理过的DC,提供了一个很好的体内外工作系统。其可用于研究Th1细胞的分化机制,特别是观察抗原呈递细胞,提供那些关键性分子作用于初始型CD4 T细胞,进而调节Th1细胞的分化。这些研究成果,也将为疫苗的设计和治疗自身免疫性疾病提供新的思路。 γ-干扰素,主要由活化的T细胞和NK细胞分泌,对多种不同类型的细胞行使免疫调节功能的细胞因子。晚近发现γ-干扰素也可以由抗原呈递细胞,比如,DC和巨噬细胞所分泌。近年来的研究显示,γ-干扰素对于Th1细胞免疫反应介导的多种实验性自身免疫疾病具有免疫保护作用,而在γ-干扰素基因敲除(GKO)小鼠观察到多种免疫细胞的功能缺陷。我们假定DC的功能是异常的,γ-干扰素的免疫保护作用来源于下调DC的功能,进而减弱T细胞的活化、增殖和分化。本研究采用GKO小鼠,研究γ-干扰素对DC功能和细胞免疫反应的调控作用。数据显示,GKO小鼠来源的骨髓源DC的体外分化和成熟没有明显改变,而其细胞因子分泌、趋化因子受体表达和体外趋化功能发生改变。给GKO小鼠腹腔注射LPS,驱动各器官的DC向脾脏迁移,观察到脾脏中积累大量DC。体内研究显示荧光素半抗原致敏的GKO小鼠,荧光素阳性的朗格汉氏细胞(LC)在引流LN中大量积累。在诱导实验性自身免疫葡萄膜炎的早期阶段,相对于免疫的正常小鼠而言,在免疫的GKO小鼠引流淋巴结中,观察到DC的数量和表达CD40的APC的数量大量增加。KLH抗原免疫GKO小鼠分析细胞免疫反应显示,抗原特异性淋巴细胞增殖、和细胞因子IL-2产生都明显增加。进一步研究发现,GKO小鼠中CD4和CD25双阳性调节性T细胞,在外周免疫器官的发育并没有受到影响。因此,γ-干扰素可以负调控DC的迁移及T细胞免疫应答。该研究为探讨内源性细胞因子γ-干扰素,如 - 2 -何调节机体免疫细胞,特别是DC,提供了一种可能的生物学机制;亦为基于γ-干扰素和DC的免疫治疗提供了新的思路。

张晓琳^[2]2007年在《慢性特发性血小板减少性紫癜中诱导血小板特异性T细胞免疫耐受的机制研究》文中认为慢性特发性血小板减少性紫癜(Chronic idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是以免疫介导的血小板破坏过多为特征的一种出血性疾病。临床上以粘膜出血,病程长,反复发作为特点。50%～60%的患者体内可检测到一种或几种针对血小板糖蛋白的自身抗体,其中约75%的抗血小板自身抗体是针对血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和Ⅰb/Ⅸ的,该抗体与血小板膜表面糖蛋白结合,随后致敏的血小板通过Fc受体被巨噬细胞吞噬或因补体活化而破坏。然而迄今为止,ITP的治疗仍以非特异性免疫抑制疗法为主,还未出现针对血小板反应性T细胞或B细胞的抗原特异性免疫抑制疗法。B细胞产生自身抗体需要自身抗原特异性T细胞的参与。研究表明ITP患者在T细胞亚群及功能等很多方面都可发现异常。更有大量实验证实,在ITP患者外周血中存在针对GPⅡb/Ⅲa等血小板膜蛋白的自身反应性CD_4~+T细胞。自身反应性T细胞识别血小板抗原特定表位,进而活化,分泌细胞因子,并与相应B细胞直接作用,激活B细胞,B细胞增殖分化为浆细胞,导致自身抗体的产生。因此,诱导GP反应性CD_4~+T细胞免疫失活将有可能为慢性ITP靶向性治疗提供新的思路。第一部分CTLA4-Ig诱导的无能T细胞在慢性ITP中的免疫调节作用目的;T淋巴细胞活化增殖并引起免疫应答需要双信号刺激;细胞受体(TCR或BCR)与抗原结合所提供的活化起始信号,即第一信号;细胞表面辅助分子与相应配体结合所提供的协同共刺激信号,即第二信号。两个信号缺一不可,如果缺失第一信号或传递受阻则免疫反应无法进行;如果缺失第二信号或传递受阻,则会导致T细胞对供体抗原的特异性免疫耐受状态,即T细胞无能。可见共刺激信号启动、维持并调节活化级联反应,为细胞抗原特异性激活所必需,决定了细胞是活化增殖、抑或转变为无能状态(anergy)甚至凋亡(apoptosis)。T细胞无能是确保机体T细胞产生抗原特异性耐受的主要机制之一,它的无反应状态不是被动的,而是具有主动的抑制效应。许多研究发现,无能T细胞可以主动抑制具有相同抗原特异性的其它效应性T细胞的增殖,并通过细胞—细胞接触抑制与之具有相同抗原特异性的T淋巴细胞的增殖,进而诱导反应性T细胞对特异性抗原的耐受,产生传染性耐受(infectious tolerance)或称连锁性抑制(linked suppression)效应。已有大量动物实验通过诱导无能T细胞能延长骨髓移植患者的存活时间,抑制变态反应性脑脊髓炎(EAE)的慢性复发过程、抑制重症肌无力的发生、减轻系统性红斑狼疮的症状。本课题通过诱导血小板糖蛋白(GP)特异性无能T细胞,诱导GP反应性T细胞耐受。并研究GP特异性无能T细胞的作用机制。方法;*制备人GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗原;*分离采集外周血单个核细胞(PBMC);*GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ反应性T细胞系的建立;*利用CTLA4-Ig诱导GP特异性无能T细胞;*人外周血树突状细胞(DC)的体外诱导及鉴定;*树突状细胞T细胞活化能力的检测;*无能T细胞抑制实验;①无能T细胞抑制效应检测;②细胞因子阻断实验;③无能T细胞抗原特异性实验。*ELISA方法检测培养体系中IL-10和TGF-β1水平;*Transwell实验;*无能T细胞对B细胞抗体产生的抑制作用。*统计学分析结果;1 ITP患者成熟树突状细胞T细胞活化能力显着高于健康者(P<0.05);不成熟树突状细胞的T细胞活化能力与健康者没有显着差别。2 ITP患者CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞在体外实验中能显着抑制自体GP反应性T细胞的增殖。此抗原特异性抑制效应依赖于抗原递呈细胞的存在。3 CTLA-Ig诱导的GP特异性无能T细胞不依赖于抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1发挥抑制效应,细胞—细胞接触是无能T细胞发挥作用的必备条件。其抑制效应并非组成性的,需要特异性抗原的刺激。4 CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞抑制了ITP患者自体树突状细胞的T细胞活化能力,使DC细胞获得了致耐受性。5 CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞可以显着抑制ITP患者自体B细胞分泌抗血小板抗体。结论;CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞通过抑制抗原递呈细胞,如树突状细胞的T细胞活化能力,抑制ITP患者GP反应性T细胞活化增殖,特异性抑制B细胞分泌抗血小板抗体。第二部分由CD4~+CD25~-T细胞诱导的血小板糖蛋白特异性CD4~+CD25~+调节性T细胞在慢性ITP中的免疫调节作用目的;CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是不同于Th1和Th2的具有免疫调节功能的T细胞群体。自然产生(naturally occurring)的CD4+CD25+Treg细胞可以非抗原特异性的抑制T细胞活化和增殖。但是抗原特异性的Treg则可以产生抗原特异性的免疫抑制作用。研究发现,ITP发病时自然产生的CD4+CD25+Treg细胞明显减少,CD4+CD25+Treg细胞在ITP发病中可能起重要作用。因此,本课题拟由ITP患者外周血CD4+CD25-T细胞诱导GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞,并研究其诱导免疫耐受的效果和作用机制。方法;*制备人GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗原;*分离采集外周血单个核细胞(PBMC);*GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ反应性T细胞系的建立;*人外周血树突状细胞(DC)的体外诱导及鉴定;*免疫磁珠法从ITP患者外周血分选CD4+CD25-T细胞;*体外诱导扩增GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞;*ELISA方法检测培养体系中IL-10和TGF-β1水平;*Transwell实验;*GP特异性调节性T细胞抑制实验;调节性T细胞抑制效应检测;细胞因子阻断实验;GP特异性Treg抗原特异性实验。*混合淋巴细胞反应,检测GP特异性调节性T细胞作用后树突状细胞T细胞活化能力的改变;*微阵列芯片分析;细胞RNA的提取;对样品RNA进行荧光标记;杂交与清洗;芯片扫描;芯片图像的采集与数据分析;芯片结果的分析*22K Human Genome Array芯片的质量控制*实时荧光定量PCR检测*统计学分析结果;1、由慢性ITP患者外周血CD4+CD25-T细胞可以诱导出GP特异性CD4+CD25+调节T细胞,该调节T细胞可以显着抑制ITP患者GP反应性T细胞的增殖,诱导GP特异性免疫耐受。2、GP特异性调节T细胞发挥免疫抑制效应需要细胞—细胞接触,并且不依赖于抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β1。3、GP特异性调节T细胞的免疫抑制效应具有抗原特异性,并且此抑制效应为非组成性的,它需要抗原的不断刺激。4、与GP特异性调节T细胞共同孵育后,ITP患者DCs获得致耐受性,该致耐受性DCs可进一步诱导其他GP反应性T细胞免疫耐受。5、免疫相关基因如TLR8、FasL、TGFBR3、DLL1、JAG2、CD200、TLR8、IL-1β、、MyD88、IFNGR1、IFNGR2、CCL17、CD209、RANK等可能参与了GP特异性调节T细胞诱导免疫耐受的过程。6、TLR、Notch、IFN-γ和TGF-β信号通路可能参与了GP特异性调节T细胞诱导免疫耐受的过程,其中TLR通路的作用可能最为重要。结论;由ITP患者外周血CD4+CD25-T细胞可成功诱导出GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞,此GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞可以通过调节树突状细胞的T细胞活化能力及TLR、Notch、IFN-γ和TGF-β等信号通路,诱导ITP患者自体树突状细胞获得致耐受性,从而进一步诱导自体GP反应性T细胞无能,诱导GP特异性的免疫耐受。

滕爱兰, 麻瑞芹, 黄国英, 张鸿英, 李靖红^[3]2013年在《维生素D与免疫的关系》文中研究指明维生素D参与钙、磷代谢,还是一类重要的免疫调节剂,对固有免疫和适应性免疫均有调节作用,维生素D不足可能导致异常反应如感染和自身免疫性疾病。有关维生素D对健康的潜在影响,正受到越来越多的关注。本文就维生素D的免疫调节作用作一概述。1维生素D的来源维生素D是一组具有生物活性的脂溶性类固醇衍生物。主要包括维生素D2和D3。维生素D2又名麦角钙化醇,主要

翟鹏, 李晓云, 刘昊, 宋铭忻, 路义鑫^[4]2019年在《旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响》文中提出为探讨旋毛虫排泄分泌(ES)抗原体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC2.4)在不同时间点对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将ES抗原(终浓度为15?g/mL,试验组)、重组小鼠IFN-γ(浓度为1 000 U/mL,阳性对照组)和RPMI 1640培养液(阴性对照组)加入到状态良好的树突状细胞中,并设无添加的空白对照组,分别刺激0、2、6、12、24 h后收集细胞,采用细胞免疫组织化学方法检测各组树突状细胞IDO的表达情况,实时荧光定量法检测各组IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αmRNA表达水平,W estern-blot方法检测各组IDO蛋白表达水平。结果显示,ES抗原、IFN-γ均能提高IDO在细胞质中的mRNA及蛋白表达水平,且与空白对照组呈显着性差异(*P<0.05,*P<0.01,***P<0.001);随着刺激时间的增加,IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αm RNA及IDO蛋白表达量均显着上升,且与空白对照组呈显着性差异(***P<0.001)。结果证实,ES抗原可刺激树突状细胞表达IDO,且存在一定的时间效应,可能与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。

参考文献：

[1]. 树突状细胞调节T细胞免疫应答的分子机制研究[D]. 侯万秋. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2004

[2]. 慢性特发性血小板减少性紫癜中诱导血小板特异性T细胞免疫耐受的机制研究[D]. 张晓琳. 山东大学. 2007

[3]. 维生素D与免疫的关系[J]. 滕爱兰, 麻瑞芹, 黄国英, 张鸿英, 李靖红. 中国临床研究. 2013

[4]. 旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响[J]. 翟鹏, 李晓云, 刘昊, 宋铭忻, 路义鑫. 中国兽医科学. 2019

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