陆生抑藻细菌分离鉴定及其对赤潮微藻米氏凯伦藻抑藻效果及机制研究

论文摘要

有害赤潮暴发能够破坏海洋生态系统,对水环境、人类健康及各国经济构成严重威胁。寻找有效赤潮防治手段成为当前研究的重要方向。有研究已表明海洋环境中存在对赤潮微藻生长具有显著抑制作用的微生物,且在有害赤潮防治方面表现出较大潜力。此背景下,本文从海水及河流入海口土壤中筛选对赤潮微藻米氏凯伦藻具有抑制效果的细菌,并探究其对米氏凯伦藻的生长抑制效果、抑制方式及抑制机理。主要研究结果如下:1、米氏凯伦藻抑藻细菌分离鉴定通过共培养实验,从海洋环境筛选到9株抑藻菌,从河口土壤筛选到5株抑藻菌,通过16S rRNA测序确定菌株种属信息,并构建系统发育树。其中,海洋环境筛选到的抑藻菌主要分布于海源菌属、盐单胞菌属、海杆菌属、副球菌属、红杆菌科、交替单胞菌属,48 h抑藻率可达58%-83%;土壤环境筛选到的抑藻菌主要分布于库克菌属、黄杆菌属、假交替单胞菌属,48 h抑藻率可达90%以上,且黄杆菌和假交替单胞菌皆以间接作用方式抑藻。2、假交替单胞菌胞外活性物质对米氏凯伦藻生长生理抑制机理（1）将假交替单胞菌无菌滤液与赤潮微藻米氏凯伦藻共培养,2%滤液体积下,藻细胞生长速度优于对照组,随着滤液体积增加,藻细胞生长受到抑制,4%滤液体积为“最低抑制浓度”,8%滤液体积为“饱和效应浓度”;并于倒置荧光显微镜下观察藻细胞数量及形态,发现随着滤液体积的增加及作用时间的延长,藻细胞逐渐破裂为细胞碎片,绿色荧光下呈现黄绿色。（2）通过流式细胞术检测藻细胞周期,发现4%滤液体积作用12 h,可将藻细胞周期阻滞在G2期;滤液体积增大至8%,藻细胞基因组DNA片段丢失,出现30%Sub-G1峰。因此推测滤液短时间、低浓度作用下,藻细胞周期被阻滞在G2期;长时间、高浓度作用下,藻细胞DNA片段丢失,可能发生藻细胞凋亡。（3）8%体积滤液胁迫下,藻细胞内活性氧累积,且作用3 h活性氧水平最高,荧光显微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色但形态发生不规则变化,作用6 h活性氧水平下降,此时藻细胞破裂呈现黄绿色。（4）不同体积滤液胁迫下,藻细胞内Caspase-3酶的活性增强,在6 h时活性达最高水平,外加活性氧抑制剂NAC后检测发现,藻细胞内Caspase-3酶活性显著降低,表明活性氧累积可激活Caspase-3酶活性。（5）流式细胞术检测表明,假交替单胞菌无菌滤液处理下,藻细胞发生凋亡,且随滤液增加,藻细胞凋亡率升高;此外,随着处理时间延长,凋亡率也随之增大。推测可能是Caspase-3酶的激活导致细胞凋亡发生,外加活性氧抑制剂NAC及Caspase-3酶抑制剂Ac-DEVD-CHO后,藻细胞凋亡率降低,表明ROS介导的Caspase-3酶依赖性凋亡通路参与了菌滤液所致藻细胞的凋亡。

论文目录

摘要

Abstract

第1章前言

1.1 中国海洋灾害现状

1.2 赤潮概述

1.2.1 赤潮的定义及暴发过程

1.2.2 赤潮的现状

1.2.3 国内赤潮的研究趋势

1.2.4 赤潮的危害

1.3 赤潮防治策略

1.3.1 赤潮暴发前的预防策略

1.3.2 赤潮暴发后的治理策略

1.4 抑藻细菌的多样性及抑藻机制研究进展

1.4.1 抑藻细菌的分布

1.4.2 抑藻细菌的多样性

1.4.3 抑藻细菌抑藻机制研究进展

1.5 选题依据

1.6 选题目的、意义及技术路线

第2章米氏凯伦藻抑藻细菌的分离鉴定及抑藻效果探究

2.1 引言

2.2 供试材料

2.2.1 米氏凯伦藻及其培养

2.2.2 细菌培养及培养基

2.2.3 实验仪器及药品

2.3 实验方法

2.3.1 抑藻细菌的分离纯化

2.3.2 抑藻细菌DNA的提取

2.3.3 16S rRNA基因序列的扩增

2.3.4 琼脂糖凝胶电泳

2.3.5 DNA序列分析

2.3.6 抑藻实验

2.3.7 陆生抑藻菌的抑藻方式

2.3.8 统计分析数据

2.4 结果与分析

2.4.1 抑藻细菌的分离鉴定

2.4.2 陆生抑藻细菌的抑藻效果

2.4.3 海洋抑藻细菌的抑藻效果

2.4.4 陆生抑藻细菌对米氏凯伦藻的作用方式

2.5 讨论

2.6 本章小结

第3章假交替单胞菌胞外活性物质对米氏凯伦藻生长生理抑制机理

3.1 前言

3.2 供试材料

3.2.1 米氏凯伦藻及其培养

3.2.2 细菌培养及培养基

3.2.3 实验仪器及药品

3.3 实验方法

3.3.1 假交替单胞菌无菌滤液的制备

3.3.2 假交替单胞菌无菌滤液作用下藻细胞密度变化测定

3.3.3 倒置荧光显微镜下藻细胞数量和形态变化观察

3.3.4 藻细胞周期阻滞检测

3.3.5 活性氧（ROS）的测定

3.3.6 米氏凯伦藻Caspase-3 活性测定

3.3.7 外加NAC后,测定米氏凯伦藻Caspase-3 活性测定

3.3.8 米氏凯伦藻细胞凋亡检测

3.3.9 外加抑制剂后,米氏凯伦藻细胞凋亡检测

3.3.10 统计分析数据

3.4 结果与分析

3.4.1 不同体积无菌滤液对米氏凯伦藻的生长抑制

3.4.2 倒置荧光显微镜下藻细胞数量及形态观察

3.4.3 假交替单胞菌无菌滤液对米氏凯伦藻周期分布的影响

3.4.4 假交替单胞菌无菌滤液胁迫下米氏凯伦藻细胞内活性氧的变化

3.4.5 假交替单胞菌无菌滤液胁迫下米氏凯伦藻细胞内Caspase-3 活性变化

3.4.6 外加NAC后无菌滤液胁迫下米氏凯伦藻细胞内Caspase-3 活性变化

3.4.7 假交替单胞菌无菌滤液胁迫下米氏凯伦藻藻细胞凋亡情况检测

3.4.8 外加抑制剂后无菌滤液胁迫下米氏凯伦藻细胞凋亡情况检测

3.5 讨论

3.5.1 无菌滤液胁迫下米氏凯伦藻的生长变化

3.5.2 生长抑制机理-米氏凯伦藻细胞周期阻滞

3.5.3 生理抑制机理-米氏凯伦藻细胞凋亡

3.6 本章小结

第4章结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

攻读硕士期间科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑宁宁

导师: 王仁君,高配科

关键词: 赤潮,米氏凯伦藻,抑藻细菌,周期阻滞,凋亡通路

来源: 曲阜师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,海洋学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 曲阜师范大学

分类号: X55;X172

总页数: 67

文件大小: 4824K

下载量: 82

陆生抑藻细菌分离鉴定及其对赤潮微藻米氏凯伦藻抑藻效果及机制研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢