首页> 正文

重组酶的设计合成、分离纯化及固定化

2020-12-02阅读(765)

重组酶的设计合成、分离纯化及固定化

论文摘要

作为一种天然催化剂,酶在催化过程中具有高底物特异性、高产物特异性和高催化效率等特点。然而,在酶较为复杂的分离纯化过程中,易失活以及无法回收再利用等缺点也严重限制了其在工业应用的发展。以克服上述酶的缺陷并发挥酶的优异性能为目的,本研究提出了一种高效的分离纯化及固定化的集成化方法来实现这一目的。构建并表达了两种含有融合蛋白标签的β-葡萄糖苷酶（GLEGB,GLEH）。一方面利用ELP标签的温度响应行为,实现目标酶分子的一步快速分离纯化;另一方面利用GB、His标签来强化目标酶在载体材料上的固定化。具体内容如下:（1）设计并通过全基因合成了由ELP纯化标签和石墨烯结合多肽标签的双标签重组β-葡萄糖苷酶质粒pET-GLEGB,由ELP标签和6His标签组成的的二元标签重组β-葡萄糖苷酶质粒pET-GLEH。通过双酶切及PCR验证后证明了重组质粒被成功构建,通过基因测序得到了正确的DNA序列。（2）将β-葡萄糖苷酶转入到受体菌BL21中并在25°C下进行诱导表达。将得到的含有目的酶的粗酶裂解液利用ELP对盐度及温度的敏感性,在25°C,不同浓度的（NH4）2SO4的条件下进行ITC纯化重组酶,并根据酶活回收率及纯化倍数确定最优的（NH4）2SO4浓度为0.5 M。使用一次ITC纯化得到的目的酶的回收率为97.2%,该方法明显优于商业化Ni-NTA亲和层析纯化法的80.6%。（3）利用GB标签的强疏水性,使之与疏水性的碳材料产生较强的吸附力,从而实现通过简单的物理吸附法将GLEGB稳定地固定化于载体材料界面。GLEGB在载体材料GO和C3N4表面的固载量分别能达到698.2 mg g-1和527.3 mg g-1。同时,ELP标签还提高了β-葡萄糖苷酶的热稳定性,当在60°C下水浴30 min后,游离GLE和GLEGB剩余的相对酶活分别为45.6%和56.3%,而游离Glu只有4.0%。含有ELP和GB标签的游离酶及固定化酶的贮藏稳定性和重复使用性都有了明显的提升。（4）为了进一步提高固定化酶的操作稳定性和循环利用性能,利用生物矿化固定化酶技术将重组酶GLEH固定化于由纳米级的层状花瓣自组装形成的微米级有机-无机杂化纳米花中。利用6His标签和Cu2+配位作用,将纯化后的GLEH直接进行生物矿化,合成了复合磷酸铜纳米花GLEH-NF。对比Cu2+浓度、酶浓度、制备温度和时间的变化对复合纳米花GLEH-NF形貌及催化性能的影响,并提出了复合纳米花的形成机理。利用超声波辅助法在15 min内即可实现高固载率（81.2%）和酶活回收率（90.3%）。GLEH-NF和游离酶相比,具有129%的相对酶活。通过该方法制备的固定化酶具有高稳定性,重复使用16次后,仍可保留近70%的初始酶活。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 酶与酶工程
  •     1.1.1 β-葡萄糖苷酶概述
  •     1.1.2 酶工程
  •   1.2 酶的分离纯化
  •     1.2.1 酶的纯化方法
  •   1.3 融合蛋白技术及类弹性蛋白
  •     1.3.1 融合蛋白
  •     1.3.2 类弹性蛋白
  •   1.4 酶的固定化
  •     1.4.1 固定化方法及原理
  •     1.4.2 新型固定化酶载体
  •   1.5 研究意义及内容
  •     1.5.1 选题目的及意义
  •     1.5.2 研究内容
  • 第二章 重组β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验试剂及设备
  •     2.2.1 菌株与质粒
  •     2.2.2 实验试剂
  •     2.2.3 主要仪器设备
  •     2.2.4 溶剂配制
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 单克隆的获取
  •     2.3.2 重组表达质粒的提取
  •     2.3.3 双酶切反应
  •     2.3.4 大肠杆菌BL21 感受态制备
  •     2.3.5 重组质粒转入表达菌株
  •     2.3.6 重组酶的诱导表达
  •     2.3.7 SDS-PAGE电泳检测
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 重组质粒的构建
  •     2.4.2 重组表达质粒的酶切验证
  •     2.4.3 Glu与 GLEGB的诱导表达
  •   2.5 小结
  • 第三章 重组β-葡萄糖苷酶的纯化及固定化
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验试剂及仪器设备
  •     3.2.1 实验试剂
  •     3.2.2 主要仪器设备
  •     3.2.3 相关试剂配制
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 重组酶GLEGB的分离纯化
  •     3.3.2 蛋白浓度测定
  •     3.3.3 酶活测定
  •     3.3.4 载体材料的制备
  •     3.3.5 β-葡萄糖苷酶的固定化
  •     3.3.6 重组酶及固定化酶的稳定性
  •     3.3.7 动力学常数测定
  •     3.3.8 圆二色谱分析
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 重组酶GLEGB的纯化
  •     3.4.2 重组酶GLEGB的固定化
  •     3.4.3 最适反应条件
  •     3.4.4 游离酶和固定化酶的稳定性
  •     3.4.5 动力学常数
  •   3.5 小结
  • 第四章 重组β-葡萄糖苷酶GLEH的生物矿化
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验试剂及仪器设备
  •     4.2.1 实验试剂
  •     4.2.2 主要仪器设备
  •     4.2.3 相关试剂配制
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 GLEH的克隆和表达
  •     4.3.2 GLEH的分离纯化
  •     4.3.3 复合纳米花GLEH-NF的制备
  •     4.3.4 复合纳米化GLEH-NF的稳定性测试
  •     4.3.5 酶活评价指标
  •     4.3.6 动力学常数
  •     4.3.7 荧光标记复合纳米花
  •   4.4 结果与讨论
  •     4.4.1 重组酶GLEH的质粒构建、诱导表达及纯化
  •     4.4.2 复合纳米花的制备及表征
  •     4.4.3 复合纳米花的最适反应pH及温度
  •     4.4.4 复合纳米花的稳定性
  •     4.4.5 动力学常数
  •   4.5 小结
  • 第五章 结论及创新点
  •   5.1 本研究主要结论
  •   5.2 本研究创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在学期间的学术成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 戎军辉

    导师: 王赟

    关键词: 分离纯化,酶固定化,生物矿化,葡萄糖苷酶,融合蛋白

    来源: 江苏大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 江苏大学

    分类号: Q814

    总页数: 78

    文件大小: 6091K

    下载量: 135

    相关论文文献

    • [1].塔希纳病毒的重组酶介导扩增快速检测方法[J]. 疾病监测 2020(03)
    • [2].重组酶介导扩增方法快速检测A族乙型溶血性链球菌[J]. 中国国境卫生检疫杂志 2018(05)
    • [3].基于同源重组技术的表达CRE重组酶的减毒沙门菌的构建及功能初步研究[J]. 中国兽医科学 2018(10)
    • [4].重组酶介导扩增方法快速检测黄热病毒[J]. 中国卫生检验杂志 2016(01)
    • [5].重组酶聚合酶扩增技术的研究进展[J]. 检验检疫学刊 2016(05)
    • [6].一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析[J]. 食品与发酵工业 2018(11)
    • [7].小麦蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及重组酶性质[J]. 食品科学 2017(02)
    • [8].条件基因打靶研究存在的主要问题及对策[J]. 遗传 2011(05)
    • [9].阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶的基因克隆及重组酶性质分析[J]. 中国生物工程杂志 2010(05)
    • [10].新型定点重组酶系统在植物基因转化和基因叠加中的应用前景[J]. 遗传 2008(02)
    • [11].Cre/Loxp重组酶系统与转基因[J]. 安徽农业科学 2010(08)
    • [12].西尼罗病毒的逆转录重组酶介导扩增检测方法[J]. 微生物学通报 2020(02)
    • [13].一种酸性真菌α-淀粉酶的异源表达与重组酶性质[J]. 食品与发酵工业 2013(08)
    • [14].位点特异性重组系统的机理和应用[J]. 中国科学:生命科学 2010(12)
    • [15].检测鱼传染性造血器官坏死病毒重组酶聚合酶扩增方法的建立及初步应用[J]. 动物医学进展 2020(02)
    • [16].重组酶介导恒温扩增快速检测人鼻病毒的方法学研究[J]. 中国卫生检验杂志 2020(19)
    • [17].重组酶聚合酶扩增技术检测结核分枝杆菌[J]. 中国微生态学杂志 2019(02)
    • [18].侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌[J]. 疾病监测 2019(05)
    • [19].重组酶Xar的表达纯化及性质研究[J]. 河南农业科学 2016(05)
    • [20].重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病原快速检测中的应用[J]. 中国兽医学报 2016(10)
    • [21].Cre重组酶的研究进展[J]. 东北农业大学学报 2009(12)
    • [22].鲤疱疹病毒Ⅱ型RAA-LFD检测方法的建立[J]. 检验检疫学刊 2020(03)
    • [23].猪嵴病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条（RPA-LFD）快速诊断方法的建立与应用[J]. 中国兽医科学 2020(07)
    • [24].重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展[J]. 中国动物检疫 2016(08)
    • [25].噬菌体phiC31位点重组酶系统在植物转基因中的应用[J]. 安徽农业科学 2014(05)
    • [26].Cre-loxP系统及其衍生系统方法学的研究和在神经科学中的应用[J]. 药学学报 2020(09)
    • [27].五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立[J]. 解放军医学杂志 2017(06)
    • [28].诱导性表达Cre重组酶转基因载体的构建及鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(46)
    • [29].塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报 2018(05)
    • [30].重组酶介导扩增方法快速检测寨卡病毒[J]. 中国国境卫生检疫杂志 2018(03)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    重组酶的设计合成、分离纯化及固定化
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2025 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6