李博[1]2003年在《鸡抗球虫免疫反应研究》文中认为试验对比研究AA肉鸡雏鸡免疫E.tenella、E.maxima毒株及其早熟株之后肠道粘膜免疫、细胞免疫水平的变化，说明粘膜免疫、细胞免疫在抗球虫免疫中的重要作用；证明此两种球虫的早熟株和毒株均能够有效地刺激鸡体的免疫反应。 AA肉鸡在7日龄时分组分别经口免疫E.maxima毒株、早熟株，E.tenella毒株、早熟株，每只鸡免疫1000个孢子化卵囊。21日龄时每组分出一半鸡进行第二次免疫。 用免疫组化ABC法检测鸡用上述球虫进行第一、二次免疫后小肠或盲肠、盲肠扁桃体和脾脏中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的动态变化。发现在上述组织器官中CD4~+T淋巴细胞在第一次免疫后迅速反应、增殖，说明其在球虫感染早期起重要的抗球虫作用。CD8~+T淋巴细胞在第一次免疫后反应比CD4~+T淋巴细胞反应慢，但在第二次免疫后反应迅速且大量增殖，说明其在抗球虫再次感染中起到重要作用。同时发现免疫E.maxima比免疫E.tenella在鸡肠道粘膜中引起CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的反应更强烈，而免疫E.tenella比免疫E.maxima在鸡盲肠扁桃体中引起CD8~+T淋巴细胞的反应更强烈。同种球虫早熟株免疫鸡与毒株免疫鸡的反应基本一致。 用淋巴细胞转化试验MTT法检测鸡用上述球虫进行第一、二次免疫后血液中T淋巴细胞活性，从而检测细胞免疫水平的动态变化，发现鸡体细胞免疫水平在免疫上述球虫后均升高，免疫二次的鸡细胞免疫水平比未进行第二次免疫的鸡更高；同种球虫免疫毒株比免疫早熟株引起鸡体细胞免疫水平更高；免疫E.maxiam比免疫E.tenella引起鸡体的细胞免疫水平更高。 用石蜡切片HE染色观察鸡用上述球虫进行第一、二次免疫后肠绒毛长度的变化，发现球虫免疫会对其寄生部位肠道粘膜造成一定损伤，第一次免疫后第12天可自行恢复，第二次免疫后恢复速度快，第4天可自行恢复。同种球虫免疫早熟株对鸡肠道粘膜造成的损伤比免疫毒株轻微；免疫E.maxima比E.tenella对鸡肠道粘膜造成的损伤轻微。
张步彩[2]2006年在《鸡柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫程序、交叉免疫及稳定性研究》文中提出鸡球虫病的免疫预防研究越来越受到人们的重视。寻找免疫原性好的保护性抗原，是完成基因工程苗和核酸疫苗研究的前提。实践证明，激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。DNA疫苗的一个显着优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆，尤其是联合应用一些细胞因子，构建调节型DNA疫苗，更有诱人的应用前景。国内外关于DNA疫苗免疫程序的研究，还很少有人涉及，一个好的免疫程序对生产实践具有不可低估的应用价值。本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)免疫调节型DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2、pVAX1-pEtK2-IL-2进行免疫程序筛选，在此基础上再进行交叉免疫与稳定性试验。主要包括以下几个方面： 1 鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫剂量的研究 鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)免疫调节型DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2设计了200μg、100μg、50μg、25μg四个剂量组，pVAX1-pEtK2-IL-2设计了100μg、80μg、50μg、25μg四个剂量组，均经胸部肌肉二周龄首免，叁周龄加强免疫接种，第四周龄攻鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊5×10~4个／羽。第五周龄剖杀所有试验鸡，观察增重、盲肠病变记分、克盲肠内容物卵囊数和抗球虫指数。结果表明，重组质粒pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2剂量50μg免疫保护效果最为明显，ACI可达189.90；重组质粒pVAX1-pEtK2-IL-2剂量80μg免疫时ACI可达184.87。说明pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-250μg和pVAX1-pEtK2-IL-2 80μg每羽的免疫组具有较高的抗球虫指数，免疫效果优于其它剂量组。 2 鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫途径的研究 DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2以剂量50μg／羽、pVAX1-pEtK2-IL-2以剂量80μg/羽经胸部肌肉注射、颈部皮下注射、翼下静脉注射、口服、滴鼻滴眼五种途径二周龄首免叁周龄加强免疫。鸡只处理、攻虫量、观察项目及抗球虫指数计算与上述免疫剂量研究试验相同。实验结果表明，两种DNA疫苗均以胸部肌肉注射免疫保护效果明显，抗球虫指数(ACI)均达180以上。 3 鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫次数和首免日龄筛选试验 鸡E.tenella DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2、pVAX1-pEtK2-IL-2分别设计一周龄首免不加强免疫、一周龄首免二周龄加强免疫、二周龄首免不加强免疫、二周龄首免叁周龄加强免疫四个试验组。pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2以剂量50μg/羽、
闫鸿斌, 贾万忠, 田广孚, 才学鹏[3]2010年在《鸡抗球虫免疫机理研究进展》文中研究表明鸡球虫病是由顶复器门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoasida)、真球虫目(Eucoccidiorida)、艾美耳科(Eimeriidae)、艾美耳属(Eimeria)的球虫引起的一种呈全球性分布的原虫病,发病率高达50%~70%,死
雷晨昱[4]2008年在《鸡巨型艾美耳球虫抗原EmTFP250的免疫原性研究》文中研究说明鸡球虫病是一种严重危害鸡生长发育的寄生原虫病,是危害养禽业发展的重大疾病之一。其传统的化学药物防治办法还存在诸多问题,因而促使本病的防治由药物转向疫苗。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。核酸疫苗(nucleic acid vaccine)是一种新的生物技术疫苗,具有可靠的安全性、高温稳定性、能诱导机体产生全面的免疫应答等优点。巨型艾美耳球虫(E.maxima)是诱发鸡球虫病的4种常见球虫之一,危害巨大。EmTFP250是巨型艾美耳球虫无性生殖阶段抗原,该基因是TRAP(thrombospondin-related anonymous protein)(TSP相关蛋白)家族的一员,属于微线蛋白。基因序列全长7990bp,开放阅读框7083bp,预测其编码246kDa的蛋白。本研究根据EmTFP250基因抗原表位的分布情况,将巨型艾美耳球虫基因EmTFP250分为八段,分别命名为Em1(231-1187)、Em2(1124-1988)、Em3(1850-3113)、Em4(3071-4214)、Em5(4133-49 64)、Em6(4916-5882)、Em7(5783-6341)和Em8(6242-7310)。分别设计引物,进行分段克隆,然后克隆入pcDNA4.0真核表达载体,用于免疫雏鸡,检测其对巨型艾美耳球虫感染鸡的保护作用。以纯化的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊为材料提取总RNA,然后采用RT-PCR技术分别克隆出EmTFP250基因的各个片段,即Em1(231-1187)、Em2(1124-1988)、Em3(1850-3113)、Em4(3071-4214)、Em5(4133-4964)、Em6(4916-5882)、Em7(5783-6341)和Em8(6242-7310)。测序结果表明Em1、Em2、Em3、Em4、Em5、Em6、Em7和Em8分别含980、881、1297、1149、810、1014、579和1092个碱基,且分别编码326、293、432、383、270、338、193和364个氨基酸。将克隆得到的八段基因分别与国外发表的EmTFP250基因全序列进行分段比较,核苷酸序列同源性和氨基酸同源性均为99%以上。利用DNA重组技术,分别构建pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em2、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em4、pcDNA4.0-Em5、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em7、pcDNA4.0-Em8真核表达质粒。酶切鉴定正确后,分别用重组质粒免疫14日龄雏鸡,1周后取注射部位、非注射部位肌肉组织,用RT-PCR方法检测保护性抗原的转录情况。结果表明Em1、Em2、Em3、Em4、Em5、Em6、Em7和Em8基因均能在注射部位肌肉里成功转录。pcDNA4.0空质粒、重组质粒pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em2、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em4、pcDNA4.0-Em5、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em7、pcDNA4.0-Em8经腿部肌肉注射分别于14、21日龄两次免疫雏鸡,并设感染非免疫和非感染非免疫对照组。28日龄经口接种新鲜E.maxima孢子化卵囊,一周后宰杀全部实验动物,分别对小肠病变计分、每克粪便中卵囊数(Oocysts per gramfeces,简称OPG)、增重和抗球虫指数(ACI)四个指标进行统计,检测各重组质粒保护力的大小。结果表明,所构建的真核表达质粒pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em2、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em4、pcDNA4.0-Em5、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em7、pcDNA4.0-Em8对感染巨型艾美耳球虫鸡均有不同程度的保护效果,其中以重组质粒pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em8组保护效果最好,有可能作为侯选的巨型艾美耳球虫DNA疫苗。
刘立恒[5]2009年在《柔嫩艾美耳球虫比较蛋白组及免疫蛋白组研究》文中指出鸡柔嫩艾美耳球虫是艾美耳属最重要的虫种之一,它能专一性感染鸡。鸡感染球虫后,轻则造成体重减轻,肉料比下降并且并发血便；重则使鸡大批死亡,给养禽业带来严重的经济损失。柔嫩艾美耳球虫的某些专一性蛋白在寄生虫发育的特定阶段发挥着重要的作用。我们采用二维电泳方法,使用pH3-10线性胶条对柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊两个时期的可溶性蛋白进行了比较分析。凝胶通过考马斯亮蓝G-250染色并用ImageMasterTM图像分析软件分析,发现柔嫩艾美耳球虫卵囊蛋白丰度和种类在孢子化过程中发生了较大变化。选择18个在两个时期均出现的蛋白点；15个只在未孢子化卵囊阶段出现的蛋白点和21个仅出现于孢子化卵囊阶段的蛋白点通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)和串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)分析,将分析结果利用'Mascot'server和'Mascot in house'search engine,分别通过NCBI数据库和柔嫩艾美耳球虫蛋白序列数据库检索。有43个蛋白点能检索到柔嫩艾美耳球虫已知或与复顶门其它寄生虫或四膜虫具有同源性的蛋白。其中烯醇酶、肌动蛋白解聚因子、核糖体蛋白大亚基和19Kd子孢子抗原在未孢子化卵囊阶段丰度小于孢子化卵囊阶段,而乳酸脱氢酶丰度在未孢子化卵囊阶段高于孢子化卵囊阶段。柔嫩艾美耳球虫的丙酮酸激酶、假定蛋白、甘露醇磷酸化酶、天冬氨酸蛋白酶和14-3-3蛋白以及7个与复顶门其它寄生虫或四膜虫具有同源性的蛋白仅发现于未孢子化卵囊阶段,它们包括间日疟原虫假定蛋白和6-磷酸果糖激酶、四膜虫多腺苷酸结合蛋白、隐孢子虫蛋白酶亚基、环形泰勒虫假定分泌蛋白、弓形虫真核转录起始因子等。仅存在于柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊阶段的蛋白包括子孢子抗原、柔嫩艾美耳球虫未知蛋白和表面抗原10等已知的柔嫩艾美耳球虫蛋白和4个与复顶门其它寄生虫或四膜虫具有同源性的蛋白。它们包括四膜虫胞质动力蛋白、假定蛋白、膜骨架蛋白等。采用比较蛋白组学研究方法,选择柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和第二代裂殖子两个阶段的可溶性蛋白进行二维电泳分析,构建了稳定的二维电泳参考图谱。凝胶经染色和图像分析,发现在两个时期凝胶上平均分布有678、660个蛋白点。有14个蛋白点在两个时期均恒定表达。8个蛋白点经分析和数据库检索后鉴定为包括乳酸脱氢酶、19KD子孢子抗原、微线蛋白-2、烯醇酶和肌动蛋白解聚因子在内的已知柔嫩艾美耳球虫蛋白和1个与环形泰勒虫蛋白酶亚基具有同源性的蛋白。为了进一步了解柔嫩艾美耳球虫的免疫机制,本实验采用了免疫蛋白组学的方法,对柔嫩艾美耳球虫生活史中叁个不同阶段的可刺激宿主产生抗体的蛋白分别进行了筛选,以期发现新的免疫原性蛋白。运用免疫蛋白组学方法鉴定了柔嫩艾美尔球虫未孢子化卵囊具免疫原性蛋白。约101个蛋白点被鸡抗柔嫩艾美耳球虫血清识别。根据其中46个蛋白点分析结果,有14个蛋白点被鉴定为柔嫩艾美尔球虫已知蛋白,这些蛋白包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、肌动蛋白解聚因子、免疫球蛋白重链结合蛋白、丙酮酸激酶、β微管蛋白、柔嫩艾美耳球虫假定蛋白、子孢子抗原等。17个蛋白点鉴定为与复顶门其它寄生虫或草履虫和四膜虫具有同源性的蛋白(包括堆型艾美耳球虫热休克蛋白、草履虫假定蛋白、疟原虫假定蛋白和6-磷酸果糖激酶等)。将剩余蛋白点的分析数据通过'Mascot in house' (version 2.1) search engine利用柔嫩艾美尔球虫蛋白数据库检索,检索到12个未知的推测蛋白。将该蛋白氨基酸序列与NCBI蛋白数据库比对,发现9个与复顶门其他寄生虫具有同源性的蛋白。它们包括：弓形虫3-磷酸甘油醛脱氢酶、真核生物翻译起始因子和肌球蛋白A；间日疟原虫SNF2家族N末端封闭蛋白；牛巴贝斯虫肌球蛋白B和延胡索酸酶；环形泰勒虫假定分泌蛋白；小泰勒虫丙酮酸脱氢酶β亚基和隐孢子虫蛋白酶亚基等。采用免疫蛋白组学方法以人工感染鸡柔嫩艾美耳球虫制备的高免血清为一抗,对鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性蛋白的免疫原性进行了系统分析。约有80个具有免疫原性的蛋白点被抗血清识别。选择其中PVDF膜与凝胶匹配完全的40个点经质谱分析和NCBI数据库检索,有22蛋白点鉴定为柔嫩艾美耳球虫已知蛋白,包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微线蛋白、微管蛋白、子孢子抗原、表面抗原10、微线蛋白3、柔嫩艾美耳球虫未知蛋白、烯醇酰基还原酶和转氢酶等；另外还发现8个和复顶门其它寄生虫或草履虫具有同源性的蛋白,包括堆型艾美耳球虫RB1-a未知蛋白、隐孢子虫二氢叶酸还原酶合成酶以及草履虫假定蛋白等。将剩余的10个蛋白点分析数据通过柔嫩艾美耳球虫蛋白序列数据库进一步分析,8个由柔嫩艾美耳球虫基因组序列推测的未知蛋白被成功鉴定。将检测结果氨基酸序列比对(NCBI数据库),发现3个其它虫种蛋白与未知蛋白具有较高同源性,包括疟原虫ATP合成酶、弓形虫肌球蛋白A和丝盘虫的假定蛋白等。采用免疫蛋白组学方法,以人工感染鸡柔嫩艾美耳球虫制备的高免血清为一抗,对鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子可溶性蛋白具有免疫原性蛋白进行研究。有85个具有免疫原性的蛋白点被血清识别。选择其中PVDF膜与凝胶匹配完全的44个点进行质谱鉴定和NCBI数据库检索,26个蛋白点鉴定为柔嫩艾美耳球虫已知蛋白(包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微线蛋白、微管蛋白、表面抗原等),另有3个蛋白点的鉴定结果与堆型艾美耳球虫热休克蛋白、弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸化酶和草履虫假定蛋白具有较高同源性。将剩余的15个蛋白点分析数据通过柔嫩艾美耳球虫蛋白序列数据库检索,发现11个由柔嫩艾美耳球虫基因组序列推测的未知蛋白。将检测结果氨基酸序列比对(NCBI数据库),除检索到1个柔嫩艾美耳球虫SAG12外,还检索到6个和其它虫种具有同源性的蛋白,它们包括弓形虫的膜骨架蛋白、线粒体F1-ATP合成酶β亚基受体,3-氧化酰基载体蛋白合酶和过氧化氢酶；恶性疟原虫Vp26蛋白和丝盘虫的假定蛋白等。
刘颖丽[6]2012年在《Repair_PSⅡ基因重组蛋白和DNA疫苗抗柔嫩艾美耳球虫保护效果》文中提出鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫引起的严重危害养鸡业发展的寄生虫病之一，其中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）致病力最强。目前，本病的防治主要依赖化学药物和活虫苗，但存在药物残留、耐药虫株、高成本及活虫苗散毒等弊端，难以大规模应用。鸡球虫基因工程疫苗仍是当前鸡球虫免疫预防研究的热点和趋势，但目前报道的该类疫苗保护效果尚不理想。因此，本研究克隆新的鸡球虫疫苗候选基因，然后利用该基因制备亚单位疫苗和核酸疫苗，最后探讨制备的疫苗刺激鸡体产生的免疫应答和抗鸡球虫保护效果，对鸡球虫基因工程疫苗开发和研制具有重要意义。柔嫩艾美耳球虫Repair_PSII基因克隆及原核表达：利用cDNA文库测序技术从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中筛选获得一个新基因，含有一个816bp的开放阅读框，编码271个氨基酸，具有Repair_PSII蛋白家族的保守结构域，是一个跨膜蛋白。用原核表达技术成功表达重组REPAIR_PSII蛋白，以可溶形式表达，可被抗柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊多抗识别，IFA显示Repair_PSII在柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段表达。重组Repair_PSII蛋白抗柔嫩艾美耳球虫保护效果：用重组Repair_PSII蛋白经不同免疫途径免疫雏鸡，观察其诱导的免疫应答和抗柔嫩艾美耳球虫攻击的保护效果。结果表明皮下免疫组和口服工程菌组可刺激鸡体产生特异性抗体和细胞介导的免疫应答（IL-2和IFN-γ、CD4~+与CD8~+T淋巴细胞、T淋巴细胞刺激指数与对照组相比差异显着）。攻虫实验表明，皮下免疫组和口服工程菌组鸡卵囊数减少，盲肠病变减轻，体重增加。综合评价ACI值分别为173.2和165.6。pVAX1-Repair_PSII真核表达质粒构建及抗柔嫩艾美耳球虫保护效果：将Repair_PSII基因亚克隆到pVAX1中构建真核表达质粒并在Hela细胞表达。结果成功构建pVAX1-Repair_PSII真核表达质粒，IFA、SDS-PAGE和Western blot确定Repair_PSII蛋白得到表达。用pVAX1-Repair_PSII重组质粒肌注免疫雏鸡，观察其诱导的免疫应答和抗柔嫩艾美耳球虫攻击的保护效果。结果表明Repair_PSII核酸疫苗可刺激鸡体产生特异性抗体和细胞介导的免疫应答（IL-2和IFN-γ、CD4~+与CD8~+T淋巴细胞、T淋巴细胞刺激指数与对照组相比差异显着）。攻虫实验表明，免疫Repair_PSII核酸疫苗可以减少卵囊数，减轻盲肠病变，增加体重。综合评价ACI值为178.7。本研究克隆了一个新的柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因Repair_PSII，Repair_PSII重组蛋白和Repair_PSII核酸疫苗均显示了良好的抗柔嫩艾美耳球虫效果，对鸡球虫病免疫预防具有重要理论意义和应用前景。
隋煜霞[7]2015年在《鸡球虫四种重组蛋白体外对鸡外周血单个核细胞功能的影响》文中研究表明鸡球虫病(Coccidiosis)是近年来限制养鸡业集约化发展的一类由艾美尔属(Eimeria)的9种球虫引起的寄生虫病。该病主要以肠道病变为主,可引起鸡消瘦、腹泻、拉血便,严重的可引起动物死亡,给养鸡业带来了巨大的经济损失。目前,各种抗球虫药物的使用依然是防治该病的主要措施,但是虫株对于药物的耐药性,以及对于禽类食品安全问题的的重视,人们开始寻找能够有效防治球虫病的方法。疫苗免疫不存在药物残留问题,而且安全高效。近几年,鸡球虫病的各种疫苗研究已逐渐引起研究人员的重视,并取得了一定的成果。正确的认识和掌握鸡球虫的生物学特性和抗鸡球虫的免疫保护机制,成为寻找更好的免疫保护抗原,研制免疫保护力强的鸡球虫病疫苗的重要前提,也是防治球虫病的的重要理论依据。本实验室已经从几种鸡球虫中获得多种抗原基因,,并成功构建了重组质粒。本试验在此基础上选取鸡堆型艾美尔球虫抗原3-1E、巨型艾美尔球虫抗原EM6、EM8和堆型艾美尔球虫抗原MIF进行了了重组表达,进而研究这四种重组蛋白体外对鸡外周血单个核细胞多种功能的影响。1鸡球虫四种蛋白的表达及体外与鸡外周血单个核细胞的结合试验根据实验室构建的重组质粒,表达纯化3-1E、EM6、EM8和MIF四种重组蛋白,无菌采集鸡抗凝血,分离外周血单个核细胞,将重组蛋白以5μg/mL的浓度加入细胞悬液中,放置细胞培养箱内培养2h后收集细胞,应用免疫荧光抗体技术,激光共聚焦显微镜下观察检测发现重组蛋白EM8和MIF能够与鸡外周血单个核细胞结合,其余两种蛋白没有结合。2鸡四种重组蛋白对鸡外周血单个核细胞细胞因子表达的影响根据GenBank中鸡IL-4、IL-17、IFN-γ和TGF-β的序列登录号设计合成符合荧光定量试验的PCR引物探针。以GAPDH为内参,用3-1E、EM6、EM8和MIF四种重组蛋白按浓度梯度分别刺激外周血单个核细胞后收集细胞提取RNA后合成cDNA为模板,进行荧光定量检测试验,分析细胞在不同浓度重组蛋白刺激后的细胞因子的mRNA转录水平,结果发现,重组蛋白刺激单核细胞后,细胞因子IL4、IL/17D、IFN-y和TGF-β4均有不同程度的变化,其中四组实验组的INF-γ的变化均比较显著(p<0.05);另外,重组蛋白EM6、EM8可比较显着的引起四种细胞因子变化(p<0.05)。3鸡球虫四种重组蛋白对鸡外周血单个核细胞增殖的影响为了检测3-1E、EM6、EM8和MIF对鸡外周血单个核细胞的增殖作用,将不同浓度的重组蛋白分别与细胞共培养24小时后,利用CCK-8法检测增殖效果。结果发现,四种重组蛋白对细胞具有一定的刺激其增殖的作用。且在一定浓度下增殖情况比对照组差异显着(P<0.05),其中重组蛋白EM8和MIF在几个浓度梯度下的增殖情况均极显着高于对照组(P<0.01)。4鸡球虫四种重组蛋白对鸡巨噬细胞吞噬功能和分泌NO的影响为了检测重组蛋白3-1E、EM6、EM8和MIF对鸡的巨噬细胞功能的影响,本试验检测了巨噬细胞对中性红的吞噬能力,并测定了不同浓度重组蛋白作用巨噬细胞后细胞培养液中的NO浓度。试验结果表明,重组蛋白EM8和MIF均能够使巨噬细胞的吞噬功能和NO分泌功能增强,而其余重组蛋白产生效果并不明显5重组蛋白EM8和MIF对鸡外周血T细胞和单核细胞的不同调节作用外周血单个核细胞有两个主要的亚群单核细胞和T细胞,它们在固有免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。不同的蛋白分子对不同类型的细胞具有多种不同的调节作用。在本试验中,我们研究了重组蛋白EM8和3-1E对鸡外周血单个核细胞两个亚群细胞不同的调节作用。试验发现重组蛋白EM8和MIF均能够与单核细胞和T细胞表面结合,流式细胞技术发现两种蛋白均能够促进单核细胞MHCI、MHCⅡI类分子的表达,使单核细胞活化。
黄艺华[8]2016年在《鸡堆型艾美耳球虫Rhomboid增强型核酸疫苗构建及免疫保护作用》文中认为鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳球虫属7种球虫引起的肠道寄生虫疾病,其中堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)是其主要病原之一。鸡球虫子孢子入侵到肠道上皮细胞并增殖使其严重受损从而导致饲料转化率降低、增重降低,这给养禽生产业造成极大的损失。过去,鸡球虫病主要靠药物防治,但是由此引发球虫耐药株的产生和药物残留等严重问题,现在球虫疫苗免疫防治逐渐替代药物防治,其中筛选有效的免疫抗原是制备高效新型球虫疫苗的基础和关键。Rhomboid属于广泛分布的丝氨酸蛋白酶家族,在球虫发育和信号转导中执行各种各样功能,特别是在球虫入侵过程中发挥着重要的作用,可能是其潜在的免疫性抗原。根据GenBank柔嫩艾美耳球虫Rhomboid基因序列(DQ323509.1)设计特异性引物,以堆型艾美耳球虫c DNA为模板PCR扩增包含Rhomboid基因ORF片段。抗原表位分析后设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接于pGEX-6p-1原核表达载体并成功构建重组质粒pGEX-Rhomboid。将此质粒转入E.coli Rosetta中IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有36 ku预期蛋白表达。纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗Rhomboid多抗。ELISA检测多抗效价达216,Western-blot检测表明制备的多抗具有良好的反应性和特异性。本试验同时构建pc DNA-Rhomboid及pc DNA-IFN-γ-Rhomboid重组真核表达质粒,体外瞬时转染表明Rhomboid及IFN-γ均可在BHK21细胞内表达,可用作免疫动物DNA疫苗使用。试验雏鸡分为5组,分别为两个真核质粒免疫组即pc DNA-Rhomboid质粒免疫组(Rho组)和pc DNA-IFN-γ-Rhomboid质粒免疫组(IFN-γ-Rho组),两个攻虫对照组即PBS注射攻虫组(PBS组)和pc DNA3.1空白质粒注射组(pc DNA组)和不攻虫对照组(Control组)。在14及21日龄时,除Control组每只鸡分别胸部肌肉注射100μL PBS或100μg pc DNA3.1、pc DNA-Rhomboid或pc DNA-IFN-γ-Rhomboid,在28日龄时,感染组雏鸡口服接种孢子化卵囊1×105个。分别在14、21、28、35及42日龄时,检测每组雏鸡淋巴细胞增殖功能、血清中抗Rhomboid IgG抗体变化及体增重变化,35日龄时,检测各组的十二指肠病变计分、克粪便卵囊数量(OPG)值并计算抗球虫指数(ACI)。结果表明,Rho组与IFN-γ-Rho组的淋巴细胞增殖活性及特异性IgG抗体随着免疫次数增加显着或极显着高于对照组;Rho组与IFN-γ-Rho组ACI分别为166.35和172.40,起到较好的抗球虫保护作用。综上,Rhomboid可以作为一种抗球虫的潜在候选基因,鸡IFN-γ可以起到免疫佐剂作用。本研究为研制抗球虫病疫苗提供了理论和物质基础。
闫鸿斌[9]2007年在《鸡球虫病活疫苗的研制》文中研究表明鸡球虫病是一种呈全球性分布的原虫病，其发病率可高达50％～70％，死亡率为20％～30％，严重者高达80％。每年，全世界因球虫病造成的经济损失超过30亿美元。虽然使用抗球虫药这种传统方法在球虫病防治中发挥了积极的作用，但是球虫耐药株的不断出观、公众对药物残留的恐惧以及新药研制的缺乏，使得活疫苗接种在不久的将来会成为控制球虫病的主要措施。因此，我们开展了本项研究，并取得如下结果：(1)改进了单卵囊分离技术，成功分离到柔嫩、毒害、巨型、堆型、和缓、布氏和早熟艾美耳球虫兰州株；克隆了堆型艾美耳球虫全长1.7Kb的18S rRNA基因，分析了其遗传、进化特点，为从分子水平上研究艾美耳球虫种系发生、遗传进化、虫种分类与鉴定等奠定了基础。(2)测定了所分离虫株的毒力(即致病性)。实验证实：每只鸡感染6×10~4个孢子化卵囊时，引起较严重的肠道病变，生长严重受阻：每只鸡感染9×10~5～1.2×10~6个孢子化卵囊时，约半数感染鸡致死；而1.8×10~6个孢子化卵囊的感染剂量可致全部感染鸡死亡。这为进行疫苗配制及其免疫效果评价时选择适宜的攻虫剂量提供了参考依据。(3)研制出四价鸡球虫病活疫苗(LCV)、五价鸡球虫病活疫苗(LCV-1)和六价鸡球虫病活疫苗(LCV-2)，在实验条件下，给5-10日龄雏鸡经口接种疫苗，两周后用与疫苗同源的混合孢子化卵囊大剂量攻虫，以相对增重率、死亡率、肠道剖检病变计分，平均OPG值和抗球虫指数(ACI)为评价指际，观察了这叁种疫苗的安全性和免疫效果。筛选出了最佳免疫剂量，结果也证实了这叁种疫苗安全性高，免疫保护效果显着，与国内外同类疫苗相当。(4)对比研究了LCV-2号对笼养和平养鸡的免疫效果，证实LCV-2对笼养鸡和平养鸡都有较强的免疫效果，而且LCV-2安全性高，即使漏免也不会造成鸡只发病。(5)评价了两种β-葡聚糖对LCV的免疫增强效果。结果表明，在攻虫后7天和14天，所有免疫组鸡的体重均极显着(P＜0.01)高于攻虫对照组、香菇糖组和酵母糖组，而香菇糖+LCV免疫组和酵母糖+LCV免疫组鸡的体重均又显着高于LCV免以组，攻虫后14天，香菇糖+LCV免疫组体重还显着高于酵母糖+LCV免疫组；在攻虫后卵囊排出量、免疫器官指数尤其胸腺指数和脾淋巴细胞增殖等指际上都有类似结果。说明两种β-葡聚糖都能作为鸡球虫疫苗的免疫增强剂，增强疫苗的免疫效果，其中香菇β-葡聚糖优于酵母β-葡聚糖。
周婷婷[10]2008年在《五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较》文中认为鸡球虫病是一种寄生在细胞内的原虫疾病,给养禽业所带来的经济损失极为严重。堆型艾美耳球虫属于中等毒力的小肠感染的球虫,其分布很广各种年龄鸡均可感染,感染后产生的免疫力弱,常引起亚临床型球虫病。受感染鸡群增重受阻和产蛋量下降。这种亚临床型球虫病不易引起人们的重视,常引起饲料报酬降低和继发感染,该球虫实际引起的损失,比一般认识要大的多,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,应用药物防治遇到了球虫耐药性和药物残留的问题,大大限制了养禽业发展,球虫防治需要寻求新的途径。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。DNA疫苗的一个显着优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,尤其是联合应用一些细胞因子,构建调节型疫苗,更有诱人的应用前景。为此我们选择堆型艾美耳球虫3-1E抗原基因分别与鸡细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因,通过DNA彭耳技术串联为一体,插入到相关真核表达载体当中,分别构建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3-1E-IL-17、pVAX1.0-3.1E-IL-18五种DNA疫苗,进行动物免疫保护性试验比较这些DNA疫苗的免疫保护效果。实验具体分为以下几个部分:1堆型艾美耳球虫3-1E基因的克隆、鉴定及序列分析根据已发表的E.acervulina3-1E基因序列,利用电脑软件设计一对引物,从E.acervulina孢子化卵囊中提取总RNA,然后应用RT-PCR技术扩增出E.acervulina 3-1E基因并与PMD18-T载体连接,对其进行酶切鉴定、PCR鉴定和序列分析。结果表明,扩增产物大小为528bp,与GenBank上登录的E.acervulina3-1E比较,其核苷酸序列同源性为99%。2堆型艾美耳球虫3—1E基因的原核表达及表达产物纯化将E.acervulina3-1E基因克隆至原核表达载体PET-28(a)中并转化入大肠杆菌E.ColiBL21,通过IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE电泳显示,表达的融合蛋白的分子量22kD左右,且在诱导表渤小时表达量最多。细菌经超声波裂解破碎,TritonX-100洗涤,得到的包涵体被纯化,SDS-PAGE电泳显示,PET-28(a)-3-1E表达的重组蛋白大部分存在于上清中,包涵体中含量很少。3 DNA疫苗的构建利用重组DNA技术,构建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3.1E-IL-17和pVAX1.0-3.1E-IL-18疫苗,酶切鉴定正确后,将重组质粒按100ug/羽鸡分别接种14日龄雏鸡,7天后取注射部位肌肉、非注射部位肌肉,用RT-PCR和Western-blot检测保护性抗原的转录与表达情况。结果表明3-1E、IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因均能在注射部位转录与表达,但在非注射部位均未检测到转转录或表达产物。4堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护性实验实验动物分为pVAX1.0-3-1E组、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ组、pVAX1.0-3-1E-IL-2组、pVAX1.0-3-1E-IL-17组、pVAX1.0-3.1E-IL-18组、非感染非免疫组、感染非免疫组以及3-1E蛋白组。每组30只实验鸡。制备好的基因疫苗和蛋白疫苗经肌肉1日龄、21日龄两次注射雏鸡,28日龄经口接种新鲜的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊。34日龄扑杀,分别作十二指肠病变记分、OPG值、增重、抗球虫指数(ACI)几个指标测定,确定其保护力的大小。结果表明,带有ChIFN-γ和IL-2的E.acervulina免疫调节型DNA疫苗保护效果比相对应的DNA疫苗和蛋白疫苗好。构建的E.acervulina免疫调节型DNA疫苗的保护效果以pVAX1.0-3-1E-IFN-7和pVAX1.0-3-1E-IL-2最好,其增重最大,十二指肠病变记分和OPG值最小,ACI分别为180.36,180.04;其次为pVAX1.0-3-1E-IL-18和pVAX1.0-3-1E-IL-17组,ACI分别为176.07,174.7;pVAX1.0-3-1E,3-1E蛋白保护效果一般,ACI分别为171.31,160.3。
参考文献：
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[5]. 柔嫩艾美耳球虫比较蛋白组及免疫蛋白组研究[D]. 刘立恒. 南京农业大学. 2009
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[7]. 鸡球虫四种重组蛋白体外对鸡外周血单个核细胞功能的影响[D]. 隋煜霞. 南京农业大学. 2015
[8]. 鸡堆型艾美耳球虫Rhomboid增强型核酸疫苗构建及免疫保护作用[D]. 黄艺华. 东北农业大学. 2016
[9]. 鸡球虫病活疫苗的研制[D]. 闫鸿斌. 中国农业科学院. 2007
[10]. 五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较[D]. 周婷婷. 南京农业大学. 2008
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