牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究

论文摘要

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的广泛存在于人类与牲畜间的疾病。该病的宿主范围比较广,可感染大多数温血脊椎动物,人可通过接触患病动物及食用污染的牛奶制品等多种途径感染结核病,所以,牛结核病的传播严重影响人和动物的健康,每年都造成巨大的经济损失。目前,结核病主要以预防为主,卡介苗是唯一可用的预防性疫苗,但对成人其免疫效果不确定,对牛又影响常规检疫,所以,研发出有效的疫苗势在必行。细菌分泌的抗原由于具有激活免疫反应的能力而被重视,CFP-10、ESAT-6和CFP-7是牛结核分枝杆菌早期分泌蛋白,免疫蛋白ESAT-6和CFP-10的编码区仅存在于结核分枝杆菌基因组的RD-1区,而在BCG菌株中不存在。因此,将CFP-10、ESAT-6和CFP-7蛋白基因融合,以期能够产生更为有效的免疫效果,这对于研发牛结核病新型疫苗有着重要意义。乳酸乳球菌NZ3900作为天然的递呈外源抗原的载体,是食品级的安全微生物,且筛选时无添加抗生素,已广泛用于生物制药、疫苗研发等领域。因此,本试验以pNZ8149为载体,在NZ3900乳酸菌中表达牛分枝杆菌融合基因cfp10-esat6-cfp7,并对构建的重组乳酸菌在小鼠模型中进行免疫原性分析,为研制牛结核病新型疫苗奠定基础。本研究以pUC-cfp10-esat6-cfp7质粒作为模板,对目的融合基因cfp10-esat6-cfp7进行PCR扩增,然后与pMD18-T Simple Vector进行连接,构建重组克隆质粒pMD18-T（S）-cfp10-esat6-cfp7。利用Kpn I和Nco I限制性内切酶对pMD18-T（S）-cfp10-esat6-cfp7和pNZ8149进行双酶切,并切胶回收纯化。将纯化融合基因cfp10-esat-6-cfp7和表达载体pNZ8149进行连接,构建pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7重组表达质粒。将重组菌电转入宿主菌NZ3900中,构建pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900,从而获得携带目的基因cfp10-esat6-cfp7的重组乳酸菌。经过Nisin诱导,SDS-PAGE及间接免疫荧光鉴定实验,成功表达鉴定融合基因cfp10-esat6-cfp7的表达。之后,利用pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900重组乳酸菌免疫小鼠,利用流式细胞技术检测免疫小鼠脾细胞中T细胞亚群和产生IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的淋巴细胞比例,以及利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫小鼠血清中IgG水平。本研究成功地扩增了牛分枝杆菌融合基因cfp10-esat6-cfp7,与pMD18-T Simple Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-cfp10-esat6-cfp7。纯化的融合基因cfp10-esat-6-cfp7和表达载体pNZ8149连接,成功地构建了重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900。重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900经过Nisin诱导,并利用SDS-PAGE及间接免疫荧光试验,证明融合基因cfp10-esat6-cfp7在NZ3900中表达了33 kDa的外源蛋白。免疫小鼠后,流式检测结果显示,重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900免疫组脾细胞中CD4+T细胞的比例较pNZ8149/NZ3900组、PBS组和BCG组均略高,但无统计学差异（P>0.05）;CD8+T细胞的比例较pNZ8149/NZ3900组略高,较PBS组和BCG组明显增高,但未能达到差异显著性水平（P>0.05）;产生IL-2的细胞比例较pNZ8149/NZ3900组略高,较PBS组和BCG组明显增高,但差异仍不显著（P>0.05）;产生IFN-γ的细胞比例较PBS组和pNZ8149/NZ3900组略高,但远不及BCG组,差异显著（P<0.05）;产生TNF-α的细胞比例与BCG组、pNZ8149/NZ3900组基本一致,没有差异（P>0.05）。利用酶联免疫吸附实验检测得到重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900组小鼠血清中的IgG抗体水平略高于PBS组和pNZ8149组,低于BCG组,且差异均不显著（p>0.05）。可见,重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900仅能诱导小鼠体内产生一定水平的细胞免疫,为牛结核病新型疫苗的研制提供了依据。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 包艳红

导师: 姜秀云

关键词: 牛分枝杆菌,融合基因,重组乳酸菌,免疫检测

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000272

总页数: 63

文件大小: 1285K

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