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水稻黄叶候选基因的功能研究

2020-12-02阅读(78)

水稻黄叶候选基因的功能研究

论文摘要

叶绿体的正常发育对于植物生长至关重要。叶色突变体的研究是探明叶绿体发育过程中基因功能的有效途径。近年来,叶色突变相关基因的研究已取得较好进展,对水稻叶色突变体的报道主要包括黄化、白化、亮绿、条斑条纹、温敏变色、转绿和转紫等。在前期的研究中,用60Co-γ射线辐射的籼稻9311后代中筛选到一个黄叶突变体。以黄叶突变体和野生型为材料,结合重测序、图位克隆技术和转录组测序技术,在图位克隆定位的区间内筛选到13个差异表达的基因,为了进一步确定各个基因是否与黄叶突变有关,本研究开展的工作及其结果如下:1.利用CRISPR/Cas9系统构建水稻黄叶突变体候选基因的编辑载体及其遗传转化。利用黄叶候选基因的外显子区域2个不同靶位点序列设计合成特异引物,构建了13个候选基因的pC1300-Cas9编辑载体。将构建成功的载体,通过农杆菌介导的方式遗传转化水稻品种日本晴,而BGIOSGA012976和BGIOSGA010427的基因编辑载体同时转化9311品种。除了BGIOSGA010427（受体9311）、BGIOSGA010449、BGIOSGA012911、BGIOSGA012927四个基因的遗传转化处于分化阶段外,其余候选基因都得到T0代转基因阳性植株。利用特异性引物的扩增序列分析基因编辑频率,结果显示T0-Cas9-12976转基因植株的编辑率为18.5%,T0-Cas9-10448编辑率为18%,T0-Cas9-12931编辑率为41.3%,T0-Cas9-12963编辑率为15.4%,T0-Cas9-12987编辑率为51.5%,T0-Cas9-10427和T0-Cas9-10375编辑率为0。pC1300-Cas9-12976 T0代转基因编辑植株的叶色与黄叶相似,与日本晴和9311均存在叶色差异。2.利用RNAi技术构建黄叶候选基因BGIOSGA012976和BGIOSGA010427的干涉表达载体及其遗传转化。在13个差异表达的基因中,BGIOSGA012976和BGIOSGA010427基因经预测属于镁离子螯合酶I亚基的家族成员,但其生物学功能目前仍未见报道。在9311和黄叶突变体中,这两个基因都存在SNP。利用两次酶切分别将目的基因BGIOSGA012976和BGIOSGA010427第一链和第二链插入到目标载体DS1301,两个黄叶候选基因的干涉载体已构建成功,通过转化水稻9311后,BGIOSGA010427得到一株阳性转基因植株,其叶色偏绿,表型与9311相似,因此BGIOSGA010427基因与黄叶的相关性需进一步的确定。3.利用超表达技术构建黄叶突变候选基因BGIOSGA012976和BGIOSGA010427的超表达载体及其遗传转化。利用生物信息学软件对候选基因BGIOSGA012976和BGIOSGA010427进行分析,设计特异引物,构建了超表达载体。其中pCAMBIA1302-C10427和pCAMBIA1302-C12976完成农杆菌介导的水稻遗传转化,籼稻的遗传转化存在较大的难度,目前遗传转化正在分化阶段。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文章综述
  •   1.1 叶色形成研究进展
  •     1.1.1 叶色突变的来源及分类
  •     1.1.2 叶绿体合成途径
  •     1.1.3 叶绿体降解途径
  •     1.1.4 水稻叶色突变相关基因的研究进展
  •     1.1.5 水稻叶色突变的研究意义及应用
  •   1.2 CRISPR/Cas9 概述
  •   1.3 RNA干涉概述
  •   1.4 本研究的主要内容、目的及意义
  • 第二章 水稻黄叶候选基因敲除载体的构建及遗传转化
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 实验材料
  •     2.2.2 实验菌株和载体
  •     2.2.3 实验试剂
  •     2.2.4 实验主要试剂配方
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 基因的生物信息学分析
  •     2.3.2 基因编辑目的序列的选择
  •     2.3.3 SK-gRNA重组载体构建
  •     2.3.4 pC1300-Cas9-12976 重组载体构建及阳性鉴定
  •     2.3.5 pC1300-Cas9-12976 重组载体电击转化农杆菌及阳性鉴定
  •     2.3.6 根癌农杆菌EHA105 介导的pC1300-Cas9 重组载体的水稻遗传转化
  •     2.3.7 转基因T0代植株的阳性鉴定
  •     2.3.8 转基因阳性植株中黄叶突变候选基因编辑检测
  •     2.3.9 T0-Cas9-12976 转基因植株的表型观察
  •   2.4 实验结果与分析
  •     2.4.1 生物信息学分析结果
  •     2.4.2 靶序列选择及引物设计
  •     2.4.3 SK-gRNA-12976 重组载体构建及阳性鉴定
  •     2.4.4 pC1300-Cas12976 重组载体构建及阳性鉴定
  •     2.4.5 pC1300-Cas9-12976 重组载体农杆菌电击转化及阳性鉴定
  •     2.4.6 基因编辑载体的遗传转化
  •     2.4.7 T0转基因植株的阳性鉴定
  •     2.4.8 转基因植株中靶基因的检测
  •     2.4.9 T0-Cas9-12976 转基因植株的表型观察
  •   2.5 讨论
  • 第三章 两个水稻黄叶候选基因RNA干涉表达载体及遗传转化
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料及方法
  •     3.2.1 实验材料
  •     3.2.2 实验试剂
  •     3.2.3 实验菌株与载体
  •     3.2.4 实验主要试剂配方
  •     3.2.5 实验仪器与设备
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 RNAi引物的设计
  •     3.3.2 9311总RNA的提取及RNA反转
  •     3.3.3 干涉表达载体的构建
  •     3.3.4 RNAi表达载体转入农杆菌
  •     3.3.5 RNAi表达载体的遗传转化
  •   3.4 实验结果与分析
  •     3.4.1 9311cDNA Actin检测
  •     3.4.2 目的基因第一链与DS1301 的组装
  •     3.4.3 目的基因第二链与重组载体DS1301 的组装
  •     3.4.4 RNA干涉表达载体的农杆菌转化
  •     3.4.5 RNA干涉表达载体的水稻遗传转化
  •     3.4.6 RNA干涉表达载体的转基因植株阳性鉴定及表型观察
  •   3.5 讨论
  • 第四章 两个水稻黄叶候选基因超表达载体的构建及遗传转化
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 实验材料
  •     4.2.2 实验菌株和载体
  •     4.2.3 实验试剂
  •     4.2.4 实验主要试剂配方
  •     4.2.5 实验主要仪器
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 超表达载体引物的设计
  •     4.3.2 9311RNA的提取及RNA反转
  •     4.3.3 超表达载体的构建
  •     4.3.4 超表达载体的农杆菌电击转化
  •     4.3.5 超表达载体的水稻遗传转化
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 目的基因的扩增
  •     4.4.2 TA克隆阳性鉴定
  •     4.4.3 TA重组载体和pCAMBIA1302 载体质粒DNA的酶切
  •     4.4.4 阳性克隆鉴定
  •     4.4.5 超表达载体的农杆菌电击转化
  •     4.4.6 超表达载体的遗传转化
  •   4.5 讨论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 在读期间发表的学术论文
  • 参与的学术会议

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 何福收

    导师: 谭艳平

    关键词: 水稻黄叶突变体,镁离子螯合酶,超表达

    来源: 中南民族大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 中南民族大学

    基金: 湖北省自然科学基金一般项目(No.2018CFB481),湖北重点实验室建设基金(项目编号:2018BFC360)

    分类号: Q943.2;S511

    总页数: 89

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