导读:本文包含了萤光素酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:萤光,基因,报告,突变,生物,探针,细胞。
萤光素酶论文文献综述
李钊全,粟正英,梁丹丹,王春苗,蓝富[1]（2019）在《萤光素酶报告基因细胞模型在筛选靶向调控RAC1的大黄酸衍生物中的应用》一文中研究指出目的构建含RAC1启动子萤光素酶报告基因CNE1-RAC1-Luc2稳转细胞模型,探讨其在转录水平筛选靶向调控RAC1抗肿瘤活性的大黄酸衍生物中的应用。方法利用RAC1启动子序列,设计合成萤光素酶报告基因-慢病毒重组载体,感染鼻咽癌CNE1细胞,获得稳定表达萤光素酶的细胞;采用萤光素酶报告基因检测试剂盒,检测RAC1激活剂PMA和抑制剂NSC23766刺激该细胞后的萤光素酶发光值,并观察系列大黄酸衍生物对RAC1启动子萤光素酶活性的影响,Western blot验证细胞RAC1蛋白表达的变化。结果双酶切实验显示,含RAC1启动子萤光素酶报告基因的慢病毒表达载体构建成功;经嘌呤霉素筛选,获稳定表达萤光素酶的CNE1-RAC1-Luc2细胞,转染效率达90%以上; RAC1萤光素酶报告基因检测系统对RAC1激活剂和抑制剂反应灵敏,萤光素酶活性与Western blot实验中RAC1蛋白表达结果一致;系列大黄酸衍生物对CNE1-RAC1-Luc2细胞萤光素酶活性的调控作用与Western blot结果基本一致。结论成功构建了含RAC1启动子的萤光素酶报告系统的细胞模型,为高通量进行靶向RAC1药物的筛选提供一个实用的平台。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2019年07期）
王欢欢,张雷,葛莹,宋丹丹,楼立峰[2]（2019）在《鸡GNAS基因c.36-2277T>C突变对萤光素酶表达的影响》一文中研究指出为分析探讨鸡GNAS基因ENSGALT00000062075.1:c.36-2277T>C突变对转录调控的影响,本试验选择乌骨鸡和芦花鸡血液样本,构建了c.36-2277T>C突变点的不同基因型质粒,并转染鸡胚成纤维细胞后,检测双萤光素酶报告基因分析系统的表达。结果表明:样本芦花鸡均为TT基因型,乌骨鸡均为CC基因型;c.36-2277T>C突变点的上下游-175～+818 bp片段具有显着增强转录活性作用(P<0.01),且CC基因型活性极显着高于TT基因型(P<0.000 1)。转录因子预测结果表明:此993 bp片段中TGGCA结合蛋白位点数量最多;紧邻突变点分别为AP-1和ER-alpha/T3R-alpha结合位点。研究认为,GNAS基因c.36-2277T>C突变点的碱基类型会对基因转录调控进程产生重要影响,且该突变可能是通过与上下游转录因子结合位点共同作用来发挥效用。(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2019年02期）
张照研,王宇光,高月[3]（2018）在《CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建》一文中研究指出目的:克隆细胞色素P450 7A1(CYP7A1)基因启动子,构建以CYP7A1基因启动子为启动序列的双萤光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究CYP7A1基因转录调控提供有效筛选工具。方法:采用PCR方法克隆CYP7A1基因启动子序列,连接到pUC57载体中,双酶切后连接至萤光素酶报告质粒pGL3-Basic上,构建重组萤光素酶报告质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。结果:重组质粒经双酶切和测序,证实构建正确;pGL3-CYP7A1-promoter-luc质粒2、3转染HepG2细胞均具有显着性启动子活性,pGL3-CYP7A1-promoter-luc2转染24和48 h后经检测分别为对照组(pGL3-basic空载体)的13.1±2.8倍(P<0.001)和23.3±2.9倍(P<0.001);pGL3-CYP7A1-promoter-luc3转染24、48 h后,荧光响应值分别是对照组的8.4±1.6倍(P<0.001)和22.1±1.9倍(P<0.01),呈现强启动子活性。结论:构建了CYP7A1基因启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc,为后续深入研究药物对其调控作用机制奠定了基础。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2018年05期）
杨兴业[4]（2018）在《海肾萤光素酶生物发光探针的设计、合成及评价》一文中研究指出生物发光(bioluminescence)是发生在生物体内的一种特殊类型的化学发光,生物发光不依赖外界的光,是体内的化学物质在酶的催化作用下将化学能转变为光能的过程。生物发光成像技术具有非侵袭性、灵敏度高、选择性好、可视化及能够实现实时动态监测等优点已被广泛应用于各个领域。生物发光检测工具逐渐被开发出来,有些已经成功的应用到实际生产之中。常见的生物发光系统主要是萤火虫萤光素酶生物发光系统、腔肠素萤光素酶生物发光系统与生物发光细菌系统。以咪唑并吡嗪酮为母核的腔肠素底物分布广泛,能够被多种萤光素酶催化发出蓝色的光,而且不需要其他辅助因子。腔肠素萤光素酶生物发光系统比较简单、底物有很好的生物相容性、背景荧光低、受干扰少,有利于研究体内生理病理过程。腔肠素萤光素酶生物发光系统中研究最多的是海肾萤光素酶生物发光系统,在氧气的条件下底物被海肾萤光素酶氧化、环化,形成四元环中间体,四元环中间体很快发生裂解,产生CO2与激发态的酰胺类衍生物,酰胺类衍生物由激发态向基态跃迁的过程中,多余的能量以光子的形式释放,发射出蓝绿色的光。在腔肠素类似物的研究基础上,我们分别设计、合成了二种小分子的生物发光探针:硝基还原酶(NTR)探针和硫化氢(H2S)探针,用于硝基还原酶与硫化氢的体内外检测。本论文主要包括:一、前言;二、海肾萤光素酶底物的合成;叁、硝基还原酶探针的设计、合成以及评价;四、硫化氢探针的设计、合成以及评价。肿瘤细胞缺氧通常可导致胞内的还原酶水平升高,例如硝基还原酶(nitroreductase),在缺氧条件下,以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nico-tinamide adenine dinucleotide,NADH)作为电子供体,外源性芳香族硝基化合物在硝基还原酶的催化下发生单电子转移,生成硝基阴离子自由基,随后进一步被还原成羟胺或氨基。基于这种还原行为我们设计了硝基还原酶生物发光探针检测实体瘤的缺氧状况。以4-硝基苄基、2-硝基苄基取代腔肠素类似物的羰基,当硝基被还原成氨基后发生重排消除反应,释放出底物,被酶催化发光,从而实现检测硝基还原酶的目的。并且对探针的体外、细胞水平及动物水平的应用进行了考察。结果表明,探针A1、A2、A5的相对生物发光强度与溶液中硝基还原酶的浓度呈良好的线性关系。在其他相关性物质浓度是硝基还原酶浓度100倍以上情况下,探针A1、A2、A5相对生物发光强度是其他相关性物质3倍以上,说明我们设计的生物发光探针具有良好的选择性,在体外可实现对硝基还原酶的定性、定量检测。在细胞水平上研究结果显示探针A5表现出了良好的生物相容性,能够用于检测细胞内源性硝基还原酶水平。并且A5可以用来检测肿瘤区域的硝基还原酶水平,肿瘤区域生物发光强度与对照组相比增加了7倍。因此,我们设计的硝基还原酶探针能够用于检测肿瘤缺氧环境。硫化氢是调节血管、神经、免疫系统重要的信号分子,细胞一旦无法维持正常的硫化氢浓度,就会出现各种疾病。为了更好的了解硫化氢在机体内的产生、转运、代谢过程,我们开发了一种新型硫化氢检测方法。4-迭氮基苄基取代腔肠素类似物羰基后,底物不能被酶催化发光,当迭氮基被硫化氢还原生成氨基后发生重排消除反应,释放出底物,被酶催化发光,基于此我们设计了两个硫化氢探针。在分子水平上探针表现出优良的选择性、灵敏度,相同条件下,硫化氢探针相对生物发光强度是其他相关性物质的3倍以上。而且探针可以用于检测细胞中的硫化氢水平。在动物体内上,探针C1硫氢化钠组生物发光强度是生理盐水组的4倍。因此,我们设计的基于海肾萤光素酶硫化氢探针能够用于体内硫化氢的检测。我们以海肾萤光素酶生物发光体系为基础设计合成硝基还原酶和硫化氢探针,可以成功的用于细胞和生物体内硝基还原酶和硫化氢的检测,为研究与硫化氢相关的生理病理过程提供了一种新方法。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-21）
粟正英[5]（2018）在《基于人EGFR为靶点的萤光素酶报告系统的构建及在蒽醌类抗肿瘤药物筛选中的应用》一文中研究指出目的1.构建EGFR启动子萤光素酶报告基因A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2稳转细胞模型;2.利用EGFR萤光素酶报告系统在转录水平筛选靶向调控EGFR抗肿瘤的候选化合物;3.探讨靶向调控EGFR与抗肿瘤活性的关系,为抗肿瘤药物设计、合成和开发提供新的策略。方法1、利用Western blot技术检测鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌及人鼻咽正常上皮细胞和乳腺正常细胞的EGFR蛋白表达水平,确定EGFR高表达活性的细胞作为研究对象。2、利用基因重组技术,构建含EGFR启动子的萤光素酶报告基因重组慢病毒表达载体,分别感染具有EGFR高表达活性的A549和CNE1细胞,获得稳定表达萤光素酶的A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞系。3、通过萤光素酶实活性验对萤光素酶报告系统的关键条件进行优化,并检测化疗药物吉非替尼、顺铂、先导化合物大黄酸以及蒽醌化合物4a、B、C、H、I、J、K和N调控A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞EGFR启动子的活性。4、MTT法确定化疗药物吉非替尼、顺铂、先导化合物大黄酸以及蒽醌化合物4a、B、C、H、I、J、K和N对A549和CNE1两株细胞半数抑制浓度IC50,Western blot检测各种化合物对A549和CNE1细胞EGFR蛋白表达活性。5、以A549和CNE1细胞为研究对象,选择吉非替尼、大黄酸、顺铂、蒽醌化合物4a、B、C和H为受试物,联合照射,对各组细胞测定下列各项指标:(1)MTT检测各组细胞的生长抑制率;(2)细胞克隆形成实验检测各种化合物对A549和CNE1细胞放射增敏活性;(3)Western blot检测各组细胞EGFR蛋白表达水平;(4)彗星实验检测各组细胞DNA损伤的情况;6、免疫荧光法观察化疗药物紫杉醇、蒽醌化合物4a和H对A549和CNE1细胞F-actin微丝骨架形成的影响。结果1.Western blot检测结果显示,A549和CNE1细胞具有较高的EGFR蛋白表达活性;2.根据基因测序和质粒双酶切鉴定结果,含EGFR基因启动子萤光素酶报告基因的慢病毒表达载体成功构建,慢病毒感染A549和CNE1细胞经嘌呤霉素筛选后获得稳定表达萤光素酶的A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFRLuc2稳转细胞株。萤光素酶报告基因结果显示,A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞的萤光素酶表达活性分别是Negtive control组的49倍和43倍。3.萤光素酶报告基因系统试验条件优化结果表明,当接种细胞数为5000个/孔,反应温度为25℃,细胞裂解时间为5min时,细胞内萤光素酶表达量较高,因此选择该条件作为后续萤光素酶报告系统进行药物筛选的检测条件。萤光素酶报告系统检测发现,吉非替尼、蒽醌化合物4a、B、C、H对A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞EGFR启动子均具有良好的抑制作用;4.MTT实验结果显示,吉非替尼对A549和CNE1两株细胞均有较好的生长抑制活性,蒽醌化合物4a、B、C、H、I、N对CNE1细胞的半数抑制浓度性显着低于A549细胞;化合物H、N对A549和CNE1细胞半数抑制浓度与先导化合物大黄酸相比均显着降低(P<0.001)。5.Western blot实验结果表明,吉非替尼、化合物4a、B、C以及H可以通过靶向抑制EGFR基因启动子转录活性从而下调A549和CNE1细胞EGFR蛋白表达水平,且抑制活性均优于先导化合物大黄酸。6.各种化合物联合照射处理细胞后,(1)MTT实验结果表明,单独化合物及单独照射处理对细胞的生长抑制率均较小,但两者联合作用后,可显着增加A549和CNE1两株细胞生长抑制率,特别是蒽醌化合物4a、B、C、H联合照射组明显优于单独照射组(P<0.05);(2)克隆形成实验表明吉非替尼、蒽醌化合物4a、C、H对A549细胞具有良好的放射增敏作用,放射增敏比SER分别为1.462,1.619,1.708和1.290,放射增敏活性优于大黄酸;蒽醌化合物4a、C、顺铂与大黄酸相比对CNE1细胞具有明显的放射增敏活性,放射增敏比分别为1.256、1.184和1.206。(3)Western blot实验结果表明,射线可以激活肿瘤细胞EGFR蛋白表达水平,但照射联合吉非替尼、蒽醌化合物4a、B、C、H均可以显着下调A549和CNE1细胞EGFR表达水平。(4)单独照射对两种肿瘤细胞的DNA损伤效应并不明显,但照射联合吉非替尼、蒽醌化合物4a、C以及H处理细胞后彗星尾部DNA(Tail-DNA)含量明显大于单独用药组和单独照射组(P<0.005)。7.免疫荧光法检测结果显示,随着蒽醌化合物4a和H作用时间的延长,可明显降低A549细胞和CNE1细胞内F-actin微丝的表达量,细胞微丝骨架发生重排,细胞核周出现标志性的F-actin环,细胞骨架完整性丧失。结论1.成功构建了基于EGFR启动子的萤光素酶报告系统,获得了在转录水平上筛选靶向抑制EGFR的抗肿瘤药物筛选细胞模型。2.蒽醌化合物4a、B、C以及H对A549和CNE1细胞的生长抑制活性及靶向EGFR抑制活性均优于先导化合物大黄酸。3.无细胞毒浓度的蒽醌化合物4a、C以及H联合射线处理肺癌A549细胞和鼻咽癌CNE1细胞,具有放射增敏作用,其增敏活性优于先导化合物大黄酸。4.蒽醌化合物4a和H可抑制细胞内EGFR表达,减少EGFR下游信号通路的活化,促进细胞内F-actin微丝的解聚和重排从而引起肿瘤细胞微丝骨架破坏,导致肿瘤细胞死亡。(本文来源于《广西医科大学》期刊2018-05-01）
李慧[6]（2018）在《抗HER2海肾萤光素酶融合蛋白对HER2阳性循环肿瘤细胞的检测》一文中研究指出研究背景乳腺癌是全世界女性最常见的肿瘤,与此同时也是导致癌症相关性死亡的第二大癌症。约20%的乳腺癌患者过表达人类上皮细胞生长因子受体2(human endothelial receptor 2,HER2),HER2 是一种 185KDa 酪氨酸激酶受体,它由位于17号染色体上的原癌基因编码。HER2过表达又和药物治疗抵抗、疾病的复发和预后不良相关。尽管各种靶向治疗药物(如曲妥珠单抗)可以改善疾病的发展提高预后,但是仍然存在高度的复发和药物治疗抵抗风险,尤其是在肿瘤转移部位。目前,临床主要通过对乳腺癌患者原发肿瘤病灶进行免疫组织化学(IHC)以及基于基因萤光原位杂交(FISH)的方法评估患者是否适合采用抗HER2药物疗法。但是,乳腺癌是一种异质性疾病,基因的不稳定是其重要特征之一,虽然有许多研究证实乳腺癌患者原发肿瘤和其相对应的转移部位肿瘤HER2表达水平有高度的一致性,但是经过一系列治疗后,部分病人肿瘤原发部位和远处转移部位的抗原表型会发生改变,因此仅根据原发肿瘤表型制定个体化治疗方案是不准确的。现如今使用一种非侵入式的血液检测方法,即通过检测原位肿瘤或其转移灶释放到血液中的循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA以及肿瘤细胞来源的外泌体,来提示肿瘤的发展进程及耐药性等信息,为指导个体化治疗以及疾病的实时监测提供了可靠的依据。液态活检与现有传统活检方法相比,前者无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势,应用发展潜力巨大,主要检测对象包括:循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤 DNA(circulating tumorDNA,ctDNA)以及肿瘤外泌体(exosome)等,它们来源于肿瘤组织,可以实时监测肿瘤细胞生长进程及其耐药性,以便制定精准的个体化治疗方案。其中CTCs检测是“液态活检”的重要工具,是目前转化医学研究的热点。大量的临床研究结果提示,CTCs具有重要的临床应用潜能。循环肿瘤细胞(CTCs)是指从肿瘤原发部位或是远处转移部位上脱落并进入循环系统的癌细胞,并可以通过简单的血液检测来发现。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比,CTCs检测具有明显优势:(1)CTCs比传统方法更敏感地发现肿瘤的变化,并对肿瘤患者的预后、复发和转移进行监控;(2)只需要抽取病人少量外周血即可进行CTCs检测,是一种非侵入性的监测过程;(3)在疾病发展的不同阶段、不同时间均能进行多次检测。在许多恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、大肠癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等中均能发现CTCs,但血液中存在可检测CTCs的患者比例随癌症类型的不同而不同。循环肿瘤细胞在早期或转移性乳腺癌病人外周血中可以作为一种很容易检测的生物标志物可实时监控肿瘤的进展情况,用于乳腺癌早期转移的预测标志以及指导治疗。但是血液中存在大量的白细胞及红细胞,每1Oml血液中,CTCs的数目可能仅有几个到几十个,1Oml血液中含有的白细胞就高达1亿个,红细胞约有500亿个。所以必须采用非常灵敏的检测手段才能准确检测到癌症病人血循环中稀少的循环肿瘤细胞。外泌体是一种内体来源的微囊泡,体积小并具有特定的物理结构。肿瘤细胞来源的外泌体包含特定的抗原,具有潜在的免疫检测价值。因此,本课题使用一种来自海洋生物海肾的生物萤光蛋白序列,与HER2抗体的单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)结合,这种嵌合anti-HER2-Renilla萤光素酶融合蛋白可以靶向HER2阳性细胞表面抗原并且与相应的底物作用后释放萤光。利用这一原理,可对乳腺癌病人外周血中HER2阳性循环肿瘤细胞及表达HER2阳性抗原的外泌体进行检测。研究目的这项研究的目的是建立一个新的HER2阳性循环肿瘤细胞检测方法(抗-HER2-海肾萤光素融合蛋白检测方法),它可以为临床医生提供一个有价值的参考,帮助临床医生进行诊断和指导个体化治疗决策。研究方法1.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白质粒构建、转染及生物活性检测;2.细胞实验:(1)SK-BR-3 HER2阳性细胞和MDA-MB-231HER2阴性细胞的培养;(2)抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白与乳腺癌细胞系的选择性结合实验:LB942多功能微孔板分析仪检测抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白与HER2阳性细胞(SK-BR-3)和HER2阴性细胞(MDA-MB-231)的结合能力;(3)抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白特异性检测:用不同稀释浓度的HER2抗体与SK-BR-3细胞孵育,不同程度封闭HER2抗原结合位点,而后再将细胞与抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白孵育,检测光度值;(4)抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白敏感性检测:将不同细胞数的SK-BR-3细胞和固定细胞数的MDA-MB-231(105)混合后再与抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白一起孵育,检测抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白从大量背景细胞中检测出HER2阳性细胞的能力。3.小鼠体内实验:(1)建立小鼠皮下乳腺癌肿瘤模型,尾静脉注射抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白,分别在不同时间(2、4、6以及8小时)尾静脉注入底物,用小鼠成像仪检测生物光信号;(2)实验末期,小鼠心脏采血,检测小鼠血液中HER2阳性CTCs。4.乳腺癌病人血标本HER2阳性CTCs检测:收集乳腺癌及乳腺纤维腺瘤病人血标本,Ficoll密度梯度法分离出乳腺癌患者血液中外周血单个核细胞,与抗-HER2-海肾光素酶融合蛋白一起孵育后,LB942多功能微孔板分析仪检测生物光信号。5.循环肿瘤细胞筛选实验:(1)将不同细胞数SK-BR-3细胞和固定数量的MDA-MB-231(105)混合,再加入抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白,用包被有蛋白A/G的板子筛选出结合了抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白的HER2阳性SK-BR-3细胞,检测光度值;(2)将收集的乳腺癌病人血标本同样用蛋白A/G包被的板子筛选后,检测光度值;(3)细胞免疫荧光染色(IF)检测筛选出的细胞HER2的表达。6.细胞系来源的HER2阳性外泌体检测:用抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白法识别并结合HER2阳性细胞来源的细胞培养基中的外泌体,然后用试剂盒沉淀法提取外泌体,检测光度值。7.统计学分析:所有实验结果均采用单因素方差分析法或Student's t检验。所有实验重复3次,P<0.05被认为差异有统计学意义研究结果1.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白能够特异性的从大量背景细胞中有效识别HER2阳性细胞。2.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白无法识别小鼠乳腺癌肿瘤模型中的HER2阳性细胞,但是可检测到小鼠血样本中的HER2阳性细胞。3.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白可有效识别乳腺癌病人外周血中HER2阳性循环肿瘤细胞。4.蛋白A/G包被板子可有效筛选出结合了抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白的HER2阳性细胞。5.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白同样可以识别HER2阳性乳腺癌细胞系来源的外泌体。结论抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白可有效检测HER2阳性循环肿瘤细胞及HER2阳性外泌体。(本文来源于《山东大学》期刊2018-04-16）
袁明亮[7]（2017）在《海肾萤光素酶生物发光底物及探针的设计、合成和活性研究》一文中研究指出生物发光(Bioluminescence)是指生物体内的化学物质在酶的作用下产生可见光的现象,该过程不依赖于机体对光的吸收,是将生物能转化为光能的过程。而化学发光(Chemiluminescence)是不需要酶的参与,只依靠化学反应产生可见光的现象。生物发光现象广泛存在于自然界生物有机体中,包括细菌、昆虫和海洋生物等。生物发光成像(Bioluminescence imaging)是通过灵敏的光学检测仪器监控萤光素酶标记的细胞或基因在活体生物内的活动和行为过程的一种新兴的成像技术。生物发光成像技术具有操作简便快速、灵敏度高、能够实现实时动态观测以及非侵袭性等优点。生物发光成像技术在肿瘤生长监测和转移示踪、目标基因表达的检测、蛋白-蛋白相互作用、药物高通量筛选和细胞内ATP水平探测等领域有着不可替代的技术优势。海肾萤光素酶发光体系是常见的生物发光体系之一。该体系需要海肾萤光素酶(Renilla luciferase)、底物腔肠素(coelenterazine)以及分子氧的参与,最终产生可见光。海肾萤光素酶发光体系简单,不需要ATP、Mg2+等辅助因子,此外海肾萤光素酶能够表达于哺乳动物细胞中并且无细胞毒性。然而该体系在生命科学中若得到更广泛的应用,还需要克服以下缺点:第一,发射波长较短(450-475nm),容易被组织吸收,不利于动物成像;第二,稳定性较差,在中性或碱性介质中容易被氧化产生化学发光,从而升高了背景信号。目前,科学家们已经对腔肠素的C-2、C-5、C-6和C-8取代位置进行了修饰改造,然而具有较好性质的底物却寥寥无几,其主要原因是被改造的腔肠素类似物不能够很好地被海肾萤光素酶所识别。DeepBlueCTM是一种可以商业获得的腔肠素类似物,已经被用于生物发光共振能量转移研究,并且其化学结构简单,与天然的腔肠素相比少了两个羟基,所以在研究中科学家常以此为参照进行结构改造。本研究课题主要分为叁个部分:首先以DeepBlueCTM为参照进行结构改造,得到了一个活性更好的腔肠素类似物;在此基础上,运用前药策略设计评价了一批酯类腔肠素衍生物;最后设计并合成了一个用于检测毒性物质苯硫酚的生物发光和化学发光探针。本研究对海肾生物发光成像技术的推广与应用具有有较重要的意义。第一部分(底物改造):以DeepBlueCTM为参照对其进行结构改造,以获得波长红移且稳定的海肾萤光素酶发光底物。分别合成了两个含氧和含硫的腔肠素类似物,因为属于同一主族的氧和硫具有相似的性质,都能够与杂环形成p-π共轭,这样可使发射波长红移。然后采用了经过纯化的海肾萤光素酶对这些化合物进行了体外生物发光性质研究,并在细胞水平上作了相关研究。结果表明,在体外含氧的腔肠素类似物显示了较大的红移(63 nm),但是量子产率有所下降。在细胞水平上,含氧的腔肠素类似物表现出较低的发光强度,而含硫的腔肠素类似物的生物发光强度是最强的。第二部分(酯类腔肠素衍生物的设计):为了提高腔肠素类似物的稳定性并且延长发光时间,在发光最好的含硫腔肠素类似物的3位羰基上引入了保护基团,形成羧酸酯和碳酸酯结构。此保护基团可以在细胞内被酯酶、脂肪酶、亲核性物质水解,进而释放出含硫的腔肠素类似物,该底物再与细胞内的海肾萤光素酶作用产生生物发光。被保护的腔肠素类似物不能直接被海肾萤光素酶识别作用,因此不能产生光信号。此部分总共合成了 10个酯类腔肠素类似物,由于保护基团的位阻不同,其在细胞内持续发光时间的时间不同。此外也进行了体内研究,构建了裸鼠腋下移植瘤模型,结果表明这些化合物能够延长生物发光时间,达到了最初的目的。第叁部分(苯硫酚探针的设计):与荧光成像相比,生物发光成像具有一定的优势:不需要激发光照射、背景信号低、良好的生物相容性、灵敏度高等。因此,基于生物发光原理的探针已经成为了研究热点。目前大多数的生物发光探针都是基于对萤火虫萤光素结构的改造,而基于海肾萤光素酶体系的生物发光探针很少。我们设计并合成了一个用于检测毒性物质苯硫酚的生物发光和化学发光探针,在含硫的腔肠素类似物的3位羰基处引入了 2,4-二硝基苯醚,该保护基团能够被具有强亲核性的苯硫酚选择性地脱去,从而释放出含硫的腔肠素类似物。腔肠素类似物不仅能够产生生物发光,而且还能在体外通过DMSO等氧化物质产生化学发光。该探针具有较高的灵敏度和选择性,能够在水溶液、细胞以及血浆中检测毒性物质苯硫酚,是很有潜力的生物发光和化学发光探针。综上所述,为了找到量子产率高、发射波长红移的海肾萤光素酶发光底物,我们在DeepBlueCTM的C-8位引入了硫原子,使其与杂环形成p-π共轭,而且所改变的部分很小,尽量保证了底物与酶的识别作用,接着通过体外酶水平和细胞水平上的研究验证了这一设想。腔肠素3位羰基是其生物发光或化学发光的关键活性部位,如果运用前药原理先将羰基保护起来,并使其在特定的条件下被释放出来,就可以提高腔肠素及其类似物的稳定性。我们分别设计了 10个能够缓慢释放腔肠素类似物底物的酯类化合物和一个能够检测毒性物质苯硫酚的发光探针,接着对这些化合物进行了体内外活性评价。作为生物发光的重要成员,以腔肠素类似物为底物的生物发光还需要进一步地研究开发,而将前药原理运用到生物发光体系对海肾萤光素酶生物发光体系的应用和推广具有重要的意义。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-20）
崔琳,刘卫红,高原,王幼平,申意彩[8]（2016）在《miR-29a靶基因ITGβ_1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响》一文中研究指出目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β_1(integrinβ_1,ITGβ_1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(p MIR-ITGβ_1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ_1基因靶向调控的作用。方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成c DNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ_1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p MIR-Report上,构建出p MIR-ITGβ_1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定。将p MIR-Report Luciferase载体,所构建的p MIR-ITGβ_1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ_1的作用机制。结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建p MIR-ITGβ_1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ_1-3'UTR相应的碱基位点,并显着下调荧光素酶的表达。结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显着下调萤火虫荧光素酶的表达。(本文来源于《中国实验方剂学杂志》期刊2016年17期）
杨岭荣[9]（2016）在《萤光素酶报告基因检测法初步探究甲状腺肿瘤与女性体内孕激素水平关系》一文中研究指出甲状腺肿瘤是一种常见的颈部肿瘤,其发病率女性明显高于男性,因而很多学者认为这种差异性很可能与男女体内性激素水平有关。孕激素是一种雌性激素,主要在生殖、发育系统上发挥作用。但是随着孕激素类药物被广泛应用在医疗、畜牧业和农业等上,给社会带来巨大贡献的同时,也给环境带来了严重的激素污染,已经开始影响到生物体自身的内分泌系统。孕激素受体(Progesterone receptor,PR)属于核受体,只有当PR被孕激素激活后才能结合到孕激素受体应答元件的DNA区域,从而启动受体应答元件下游靶基因的表达。本课题利用这种机制并将萤光素酶报告基因克隆到受体应答元件下游,从而建立了一种高灵敏度、高通量的可用于孕激素水平生物检测的稳转细胞株,并将其应用于甲状腺相关肿瘤病人血液中的孕激素类物质水平的检测分析,以期探究孕激素类物质与甲状腺肿瘤发生的关联性。本研究共构建了含有孕激素受体基因的3种不同表达载体和3种含有不同串联倍数的孕激素受体应答元件片段的载体,通过萤光素酶的活性分析,利用质粒共转染技术将活性最高的一对重组质粒pEGFP-N2-hPR/pGL4-PRE4转染到HeLa细胞中,然后经过抗生素筛选和有限稀释法挑选出10个单克隆细胞株。再利用分子克隆技术、亚细胞定位技术鉴定出阳性单克隆细胞株。从第5代到第23代细胞的萤光素酶活性的检测结果表明该细胞株具有较强的遗传稳定性和较高的灵敏度,其检出限可以达到10 pM。因此,该稳转细胞株与萤光素酶活性检测技术结合起来即建立孕激素检测分析系统。同时,还观察到细胞株的萤光素酶活性随着外界环境中孕激素浓度的升高而增强,但是浓度高于106 pM孕激素反而会降低萤光素酶活性甚至是引起细胞死亡,这也可以说明环境中孕激素长期污染能给动物和人类健康造成危害,人类应该更加高度重视环境激素污染问题。为了研究孕激素水平和女性甲状腺肿瘤高发率之间的关联性,本研究利用孕激素受体的稳转细胞株检测分析系统对甲状腺相关肿瘤疾病的女性患者血清中孕激素水平进行检测分析。经过生物统计学分析发现,甲状腺癌病人的血清中孕激素水平低于与正常人血清中孕激素水平,并且有26.7%甲状腺肿瘤病人血清种孕激素平均水平低于1 nM,而正常组血清孕激素平均水平都高于1 nM;正常组中有22.7%样品的孕激素水平超过50 nM,而甲状腺肿瘤组中却没有。通过差异性分析显示甲状腺肿瘤组和正常组的孕激素水平存在显着性差异。尽管女性体内孕激素水平的波动较大,但本研究发现甲状腺肿瘤患者血液中的孕激素水平明显低于正常人血液中孕激素水平,提示在一定范围内甲状腺肿瘤患者肿瘤的发生与体内孕激素水平呈现负相关,故深入研究女性血液中孕激素水平可能对于甲状腺肿瘤早期诊断具有一定的参考价值。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2016-06-01）
张天超[10]（2016）在《新型萤火虫萤光素酶底物的设计、合成和活性研究》一文中研究指出第一部分 研究背景生物发光(bio luminescence)是一种生物体内合成的化学物质不依赖机体对光的吸收,但在特殊酶的作用下将化学能几乎100%转化为光能的发光现象。生物发光现象广泛存在于自然界生物有机体中,比如细菌、昆虫和海洋生物等。其中研究最为广泛的是萤火虫发光体系。生物发光成像(Bioluminescent imaging, BLI)是利用萤光素酶(luciferase)基因标记的细胞产生的萤光素酶与相应底物发生氧化反应,产生可见萤光进行生物体内成像的一项新兴技术。生物发光成像技术具有操作简便、结果直观、高特异性、高灵敏度以及对机体损伤小等优点。该项技术在医学、分子生物学、生物化学和微生物学等多个重要学科中得到广泛应用,在肿瘤生长监测和转移示踪、药物高通量筛选、基因治疗、目标基因表达的检测、干细胞示踪和蛋白-蛋白相互作用等多个领域有着不可替代的技术优势。第二部分 新型萤火虫萤光素酶底物的设计与合成现在应用的萤火虫萤光素酶底物是天然底物D-萤光素和氨基萤光素。萤光素自身的缺点成为生物发光成像技术推广的重要限制因素：第一、生物发光波长短；第二、体内稳定发光时间短；第叁、脑部成像灵敏度不足。为解决这些问题主要从两方面入手,一个是萤光素酶的修饰；另外一个是萤光素的修饰。我们采用氨基萤光素作为改造的母核,对6位的氨基进行环烷化,增加衍生物的脂溶性和体内的稳定性,以期得到具有较长生物发光波长和体内半衰期的生物发光底物。我们以4-氟硝基苯和多种环胺为起始原料,经过LiAlH4还原反应、钯碳-氢气还原反应、亲核取代反应、DBU脱硫反应以及氯化钯催化环合反应得到中间体,最后与半胱氨酸盐酸盐—水合物进行环合得到13个新型底物。第叁部分 新型萤火虫萤光素酶底物的生物活性评价我们对13个新型萤火虫萤光素酶底物完成生物发光性质测定、酶水平成像活性测定、细胞水平成像活性测试、裸鼠移植瘤模型成像活性测试、转基因鼠模型成像活性测试和裸鼠脑部移植瘤模型成像活性测试等活性研究。生物发光性质测定：利用荧光分光光度计测定新型萤火虫萤光素酶底物的生物发光波长。相较于天然底物D-萤光素和氨基萤光素,新型底物的生物发光波长均有不同程度的增大红移,有助于其在深层组织成像研究的应用。酶水平成像活性测定：利用活体动物成像仪测定新型底物在酶水平生物发光强度的底物浓度依赖性和ATP浓度依赖性。细胞水平成像活性测试：利用活体动物成像仪完成对ES-2-Fluc、4T1-Fluc、 A549-Fluc和U87-Fluc等四种细胞株生物发光强度的底物浓度依赖性和细胞浓度依赖性的测定。我们筛选出叁种成像较好的新型底物1.1、1.2和1.3。裸鼠移植瘤模型成像活性测试：构建裸鼠ES-2-Fluc移植瘤模型,腹腔注射新型底物1.1、1.2、1.3和D-萤光素、氨基萤光素,利用活体动物成像仪测定。新型底物1.1、1.2和1.3的生物发光强度明显强于D-萤光素和氨基萤光素。转基因鼠模型成像活性测试：尾静脉注射1mM新型底物1.3、天然底物D-萤光素和氨基萤光素。利用活体动物成像仪测定生物发光强度。裸鼠脑部移植瘤模型成像活性测试：构建裸鼠脑部ES-2-Fluc移植瘤模型,腹腔注射1 mM D-萤光素、氨基萤光素和新型底物1.3,利用活体动物成像仪测定。新型底物13在脑部的生物发光强度明显高于D-萤光素和氨基萤光素。第四部分结论我们为了克服目前天然底物D-萤光素和氨基萤光素生物发光波长较短、体内稳定发光时长不足和低血脑屏障通透性等缺点设计合成了叁个系列氮杂环烷氨基萤光素底物。其中新型底物1.1、1.2和1.3在体内成像产生的生物发光强于同等剂量天然底物D-萤光素10倍之多,并且具有长达7小时的体内稳定发光时长,远远超过D-萤光素的10分钟。最值得注意的是,在裸鼠脑部移植瘤模型成像活性研究中新型底物1.3的生物发光强度高出同等剂量天然底物D-萤光素30倍。这些新型萤火虫萤光素酶底物有望成为新的生物发光成像工具,扩展生物发光成像技术的新应用,有助于生物发光成像技术的推广。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-27）
萤光素酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为分析探讨鸡GNAS基因ENSGALT00000062075.1:c.36-2277T>C突变对转录调控的影响,本试验选择乌骨鸡和芦花鸡血液样本,构建了c.36-2277T>C突变点的不同基因型质粒,并转染鸡胚成纤维细胞后,检测双萤光素酶报告基因分析系统的表达。结果表明:样本芦花鸡均为TT基因型,乌骨鸡均为CC基因型;c.36-2277T>C突变点的上下游-175～+818 bp片段具有显着增强转录活性作用(P<0.01),且CC基因型活性极显着高于TT基因型(P<0.000 1)。转录因子预测结果表明:此993 bp片段中TGGCA结合蛋白位点数量最多;紧邻突变点分别为AP-1和ER-alpha/T3R-alpha结合位点。研究认为,GNAS基因c.36-2277T>C突变点的碱基类型会对基因转录调控进程产生重要影响,且该突变可能是通过与上下游转录因子结合位点共同作用来发挥效用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
萤光素酶论文参考文献
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[4].杨兴业.海肾萤光素酶生物发光探针的设计、合成及评价[D].山东大学.2018
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