李静[1]2004年在《农杆菌介导的几丁质酶基因转化仙客来的研究》文中研究说明仙客来(Cylamen premium Mill)是世界着名的花卉之一,种质资源丰富,栽培品种繁多,深受人们的喜爱。人们对仙客来的育种工作也从未间断。现今,仙客来的抗性育种已是育种的一个新方向。仙客来真菌病害对仙客来可造成巨大破坏,严重影响经济效益。本试验以仙客来的幼嫩叶片为外植体,采用叶盘转化法,将外源几丁质酶基因通过农杆菌介导转化仙客来,初步建立了仙客来再生体系和遗传转化体系,经PCR检测得到阳性转化植株,实验结果如下:1、不同激素对再生的影响: 所选用的两种生长素,即2,4-D和NAA均可诱导愈伤组织,2,4-D的诱导效果好于NAA,是仙客来再生的适宜激素。2、再生体系的最佳培养基:诱导愈伤组织培养基为MS附加2,4-D1.0mg/L和BA 0.2mg/L。分化培养基为MS附加BA2.0mg/L、2,4-D0.5mg/L和KT 0.2mg/L;生根培养基为1/2MS,附加NAA0.5mg/L。3、选择压的确定:载体含有NPTⅡ选择标记基因,使转化体带有卡那霉素抗性,试验得到的卡那霉素的选择压力为40mg/L。4、仙客来转化体系的适宜条件:经表面灭菌的外植体叶片在MS附加2,4-D1.0mg/L和BA0.2mg/L的愈伤诱导培养基上预培养3天,在活化好的浓度为OD600=0.5的菌液中直接侵染10min,在不附加激素的含乙酰丁香酮100uol/L的MS培养基上共培养3天,可得到相对较高的转化率。5、转化植株的检测:以几丁质酶基因两端序列合成引物,对转化体进行PCR扩增,6株再生植株中,4株呈阳性,阳性率为66.7%,占总转化外植体的0.29%,转化率低,PCR检测结果可初步证明外源基因整合到仙客来的基因组中。
陈莉[2]2007年在《麝香百合和仙客来转Mn-SOD基因植株的获得及其耐热性鉴定》文中认为本研究以麝香百合、仙客来为材料,通过农杆菌介导法将Mn-SOD基因转入植株中,通过筛选、检测,获得转Mn-SOD基因植株,并研究高温逆境胁迫对转基因和未转基因植株的生理机制的影响,从而为提高其耐热、抗衰老及其他方面的抗胁迫能力,实现品种的抗性改良奠定基础。主要研究结果如下:1通过农杆菌介导法获得麝香百合抗性植株通过研究Mn-SOD基因转化中影响叶片转化效率的多种因素,包括Kan浓度、抑菌素浓度、预培养时间、共培养时间,侵染菌液浓度和侵染时间等,确立了50mg/LKan,500mg/LCef,2d的预培养,3d的共培养,OD600为0.6,侵染10min的麝香百合遗传转化体系,并获得了百合抗性植株。2筛选出仙客来块茎诱导不定芽培养基和不定芽生根培养基以仙客来种子萌发产生的块茎为外植体,诱导分化不定芽的最适培养基为MS+2.0mg/L6-BA+1.0 mg/L NAA,并且遮光处理可提高分化率。仙客来不定芽最适生根培养基为1/2MS+1.0mg/LIBA或MS+1.5mg/LNAA。3外源基因的检测对31个百合抗性株系进行PCR扩增,结果有9个株系扩增出663bp的特异条带,而对照百合植株无特异性条带出现,初步证明外源基因已转入百合植株中。分别对PCR检测呈阳性的5个仙客来株系(由周连霞师姐转化所得)和9个百合株系进行Southern杂交检测,有3个仙客来株系检测到一条杂交带,证明Mn-SOD基因已经转入到仙客来基因组中;而在百合株系中,未检测出杂交条带。4转Mn-SOD基因仙客来和百合组培苗对高温的抗性测定了转基因和对照仙客来和百合组培苗在36℃高温胁迫下的生理反应,结果显示,转基因仙客来的SOD活性始终高于对照植株,细胞膜透性和MDA的含量上升的速度低于对照植株,可溶性蛋白含量高于对照植株,表明转基因植株的耐热性高于对照植株;转基因百合的SOD活性也高于对照植株,细胞膜透性上升的速度低于对照植株,可溶性蛋白含量高于对照植株,但MDA在转基因百合和对照百合植株中差异不明显。
陈彦[3]2006年在《小盐芥总DNA导入紫薇的研究》文中提出本文在研究紫薇的生物学特性的基础上，将小盐芥总DNA通过花粉管通道导入紫薇，获得耐盐转化幼苗。 (1)生殖生物学特性。苯胺蓝染色法显示，从授粉到花粉萌发不足0.5h，开花后24h花粉管进入子房进行受精，由此确定花粉管通道导入外源基因的最佳时机是开花后22～24h。此外，紫薇花粉量大，萌发率高，大量花粉管穿过花柱进入子房，子房内胚珠多数，为外源DNA的进入提供更多的通道和机遇。 (2)花粉活力。碘-碘化钾法和过氧化物酶法可以根据染色深浅准确判断花粉活力的强弱。 (3)种子萌发和育苗。水和化学试剂浸种都能够促进平皿中紫薇种子萌发，其中45℃温水恒温4h、共浸泡24h的种子萌发率最高。相同处理的种子在基质中的出苗率均低于平皿中的发芽率。 (4)盐胁迫对种子萌发及幼苗的影Ⅱ向。0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％NaCl溶液抑制紫薇种子萌发。0.1％NaCl是3～4cm高幼苗的最适胁迫。 (5)DNA提取及RAPD-PCR反应条件的初步优化。SDS-高盐低pH法适合提取盐生植物DNA；用CTAB浸提前先用缓冲溶液洗去多糖适合紫薇叶片DNA的提取，且65℃温育0.5h、5％PVPP效果最佳。RAPD-PCR的关键因素是模板的有效浓度。 (6)小盐芥总DNA导入紫薇。利用直接滴加和切花柱后滴加共获得8106粒转化种子。0.3％NaCl溶液浇灌1个月后，共得到12棵耐盐幼苗。
参考文献：
[1]. 农杆菌介导的几丁质酶基因转化仙客来的研究[D]. 李静. 东北农业大学. 2004
[2]. 麝香百合和仙客来转Mn-SOD基因植株的获得及其耐热性鉴定[D]. 陈莉. 西北农林科技大学. 2007
[3]. 小盐芥总DNA导入紫薇的研究[D]. 陈彦. 南京林业大学. 2006