段国辰[1]2003年在《八肽胆囊收缩素对内毒素休克时主动脉和肺动脉反应性变化的调节作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是一种脑—肠肽, 参与了多种生理及病理生理过程。已知CCK的作用主要由两种受体介导，即CCK-A受体（CCK-AR）和CCK-B受体(CCK-BR)。硫酸化八肽CCK（CCK-8）是具有CCK完全生物学功能的最小活性片段。以往对CCK的研究多偏重于其在消化系统、神经系统及内分泌功能活动中的调节作用。上世纪80年代末Riepl 和Guarini等相继报道CCK有改善失血性休克的作用,90年代初Holmgren报道CCK-8引起肺血流量增加。1996年我室首次发现CCK-8有明显抗内毒素性休克(ES)作用:可保护细胞、减轻脏器病理损伤，降低死亡率；ES时肺对CCK的清除作用降低，血液中CCK含量增加。CCK-8抗ES作用主要表现在改善ES时肺循环、体循环紊乱，即逆转ES时平均动脉压（MAP）的下降及ES早期的肺动脉压（PAP）增高，但其机制尚未完全阐明。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌产生的内毒素的主要成分，静脉注射LPS,可引起ES，而各种休克晚期又多合并肠源性内毒素血症。本研究在我室以往系列研究的基础上，进一步同时观察CCK-8对ES时家兔主动脉、肺动脉反应性变化的调节作用,并对其机制进行探讨，拟从以下几方面进行研究：⑴八肽胆囊收缩素改善家兔内毒素休克时血液动力学紊乱的实验研究；⑵CCK-8对ES家兔离体动脉反应性的调节；⑶ES时主动脉和肺动脉组织及LPS诱导的主动脉平滑肌细胞(ASMC)和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)CCK受体基因表达的变化；⑷CCK-8抑制LPS诱导的ASMC iNOS和HO-1 mRNA的表达及其意义初探。1CCK-8对ES时MAP和PAP变化的调节作用本实验通过静脉注入LPS复制ES模型，同步观察了CCK-8<WP=6>对家兔ES时主动脉压、肺动脉压变化的不同调节作用。雄性家兔40只（2~2.1㎏）随机分为5组（每组8只）：（1）对照组：静脉注入生理盐水（0.8 ml/kg）；（2）LPS组：经静脉导管缓慢（10min内）注射等容量的LPS（8mg· 0.8ml-1·㎏-1）；（3）CCK-8+LPS组：静脉注入CCK-8(15μg·0.8ml-1·㎏-1)后30min再注入LPS；（4）丙谷胺（proglumide，Pro）+LPS组：静脉注入Pro(CCK受体阻断剂，1mg·0.8ml-1·㎏-1)后30min再注入LPS；（5）CCK-8组：注入同剂量的CCK-8。耳缘静脉注射25%乌拉坦（1g/㎏），麻醉动物，手术分离左侧颈总动脉和右侧颈静脉,血液肝素化（1250u/㎏ iv）后，分别插入聚乙烯导管至升主动脉弓处和经右心室至肺动脉入口处，导管经压力传感器与八导生理记录仪相连，用于监测给药后5h平均动脉压（MAP）、肺动脉压（PAP）的动态变化。分别取给药前（0h）及给药后1h、3h和5h的动脉血，测定血浆中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量，一氧化氮合酶（NOS）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。整体给药5h后放血处死家兔，迅速摘取主动脉和肺动脉，用4℃生理盐水冲洗，一部分动脉组织用10%中性福尔马林固定，制备石蜡切片，HE染色后，光镜下观察。另一部分动脉组织经2.5%或4%戊二醛固定后，制备扫描和透射电镜标本，观察血管内皮细胞的超微结构变化。结果：①LPS入血后，MAP呈进行性持续降低，0.5h MAP明显下降，2h接近最低水平，一直维持到5h，均明显低于同时间点的对照组MAP值（均P <0.01）；而LPS却使PAP呈进行性持续升高，0.5h达高峰，然后一直维持在较高水平（P﹤0.05或0.01）。②CCK-8+LPS组MAP在1.5h、2h、3h、4h和5h均显着高于同时间点的LPS组MAP（P<0.05, P<0.01）,而相应时间点的PAP则较LPS组明显降低（P<0.05）。③预注入Pro，导致LPS引起的MAP降低程度更加明显（P<0.01），MAP显着降低提前至0.5h；Pro使LPS引起的PAP进一步升高（P<0.05）。④单纯注入CCK，对正常家兔MAP、PAP无明显影响，与对照组相比无明显差异。⑤NOS和SOD活性，NO、MDA含量各组有较大变化。静脉注入LPS后1h、3h和5h，血液NOS<WP=7>活性、NO和MDA含量均显着增高，SOD活性均显着降低，而此时MAP明显降低，PAP升高；预先静脉注入CCK-8，可明显降低LPS所致家兔血液中NOS活性、NO和MDA含量的升高，提高抗氧化酶SOD的活性，而此时的MAP、PAP变化显着轻于LPS组。⑥动脉组织（主动脉、肺动脉组织）光镜检查，发现LPS组内皮细胞受损，部分内皮细胞脱落；CCK-8+LPS组血管壁各层的形态学改变明显减轻；而Pro+LPS组血管的形态学改变明显重于LPS组。扫描电镜下见LPS组内皮细胞形态不规则，大小不一，有些内皮细胞脱落缺失，内皮细胞下胶原暴露；CCK-8+LPS组内皮形态接近对照组，排列较整齐，细胞间隙稍增宽，未见细胞明显缺失。透射电镜下见正常血管内皮细胞器完整，形态轮廓清晰。LPS组、Pro+LPS组血管内皮细胞器水肿，胞浆空泡较多，线粒体肿胀、嵴减少或消失，部分线粒体膜不完整。CCK-8+LPS组血管内皮病变减轻,胞浆空泡减少，线粒体结构较完整。本实验初步探讨了ES时CCK-8对主动脉压、肺动脉压变化的调节作用，结果表明LPS可诱导家兔ES的发生，表现为MAP降低，PAP增高及主动脉、肺动脉血管内皮细胞的损伤，CCK-8对此具有调节作用，既能改善ES时家兔肺循环、体循环紊乱，又能减轻血管内皮细胞结构损伤，ES时循环紊乱以及CCK-8的保护作用机制可能与NO有关。但在动物整体实验中，影响血压的因素众多，其中血管反应性改变是ES时循环紊乱的主要因?
赵晓云[2]2002年在《八肽胆囊收缩素改善内毒素休克心血管功能及其机制的研究》文中进行了进一步梳理胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)在中枢神经系统和胃肠道作为神经肽，而在胃肠道作为激素广泛参与体内的生理和病理生理过程。已知CCK受体分为两型，即CCK-A受体(CCK-A receptor，CCK-AR)和CCK-B受体(CCK-Breceptor，CCK-BR)。研究发现八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)作为内源性CCK的主要活性功能片段，对麻醉或清醒动物的心血管功能有调节作用，可引起剂量依赖性动脉血压升高和心率的双向改变；为排除神经系统的影响，Gaw等给毁髓鼠静脉注射CCK-8，可引起剂量依赖性动脉血压升高和明显心动过缓，使用选择性CCK-AR拮抗剂loxiglumide和devazepide可减弱CCK-8引起的上述反应，使用CCK-BR拮抗剂L365，260对此变化无影响。CCK对血管的调节作用报道较少，Janssen报道给清醒Long Even鼠静脉注射低剂量CCK-8，可引起肾、肠系膜和后下肢动脉收缩，大剂量则引起动脉舒张；CCK-8对离体大鼠主动脉、颈动脉、股动脉血管无明显作用。 动物试验和临床观察均已证实，内毒素其主要致毒成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可导致内毒素休克(endotoxic shock，ES)。ES是临床常见的全身性危重病症，死亡率极高。心脏功能障碍和顽固性低血压是ES的主要病理变化。实验证实，LPS可诱导心肌组织中诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)表达增加，ES时心肌组织中一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon monoxide，CO)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎性因子水平上升，是造成心功能下降的主要原因。本室系列研究发现内源性及外源性CCK-8有明显的抗ES作用，可逆转ES大鼠平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)的下降及ES早期的肺动脉 中文摘要压升高，减轻各脏器病理损伤，降低死亡率，而使用CCK受体非特异性桔抗剂丙谷胺巾roglumide人 则明显延缓ES大鼠MAP的恢复，并使死亡率明显上升，但CCKS对ES大鼠心功能的影响及其机制尚不清楚。 体循环血管舒张和对血管收缩剂反应性降低是ES时特征性病理变化。研究表明LPS可诱导动脉平滑肌细胞和内皮细胞中iNOS和HO上表达明显增加，使内源性NO和CO合成增多，另外LPS可引起动脉组织氧化损伤，均可导致动脉反应性降低。本室研究发现CCK七部分逆转LPS离体孵育所致肺动脉收缩反应增强及内皮依赖性舒张减弱，并可减轻胸主动脉收缩反应降低和内皮依赖性舒张反应受抑，但其机制尚未完全明了。 本研究在我室系列研究的基础上，进一步探讨CCK｛对ES大鼠心血管功能的影响及其机制，拟从以下方面进行观察：①不同剂量CCKS对正常大鼠心功能的影响。＠ CCK七对 ES大鼠心功能的影响。＠CCKS减轻ES大鼠心肌损伤的作用。④CCK毛抑制ES大鼠心肌组织WOS和 HOl蛋白表达的作用。⑤CCK－R InRNA在ES大鼠心肌组织表达的变化。③CCK毛对ES大鼠主动脉反应性的影响。⑤CCK七逆转ES大鼠主动脉低反应性的机制研究。l 八肽胆囊收缩素改善内毒素休克大鼠心功能的实验研究（1）CCKS对大鼠心功能的影响 探讨不同剂量CCK七对麻醉大鼠心功能的影响。健康雄性SD大鼠24只随机分为 4组（每组 n畸）：＠小剂量 CCK组，静脉注射 0，4ug／kgCCK－8；②中剂量 CCK组，静脉注射 4．OPg／kg CCK－8；③大剂量 CCK组，静脉注射 40屹 ／kg CCKS；④丙谷胺＋CCK组，丙谷胺门mg／kg）J静脉注射 10min后再注入 CCK4N．opghg人将大鼠 25o乌拉坦麻醉门．p．人颈部正中切口，右颈总动脉插管入左心室，监测左心室内收缩压（LVP），左心室收缩与舒张期内压变化的最大速率什LVdp吐m＊和心率（HR人 左股动脉插管，监测平均动脉压（MAP人 尾静脉穿刺以备注射药物。用RM6000型生理多道仪，记录用药前和注射药物后Zh期间HR、MAP、LVP及tLVdp／dtm叫的动态变化。结果如下：①CCKS对大鼠g的影响：应用小剂量CCK8可引起HR加快，应用中剂量 2 中文摘要 CCK七可引起y先谩后快的双向改变，应用大剂量CCK七可引起HR 减慢；以上HR的变化于30巧0 see开始，与用药前相比有显着差异 （P功．OI），于15上 后恢复至基础水平。②CCKS对大鼠心功能 的影响：应用上述H个剂量的 CCK七后，大鼠 MAP、W和iLVdP／dtha 于 3050 see 开始呈剂量依赖性上升，与用药前相比有显着差异 （P＜0m），15nun后恢复至基础水平。＠丙谷胺对 CCK七心血管效应 的影响：预先应用非特异性CCK－R桔抗剂丙谷胺可逆转中剂量CCK8 所致，O率减慢为心率加快（尸＜0刀1人并可抑制中剂量＊＊卜8所致MAP、 LVP和t LVLVdp用m。上升幅度和速度，较用药前仍有差异（P功．05人 以 上变化约在20min后基本恢复至基础水平。以上结果提示：CC
段国辰, 凌亦凌, 谷振勇, 韦鹏, 牛志云[3]2002年在《八肽胆囊收缩素对家兔内毒素休克时主动脉及肺动脉反应性改变的影响》文中认为目的 观察八肽胆囊收缩素 (CCK - 8)对脂多糖 (LPS)引起的家兔内毒素休克 (ES)时肺循环、体循环血压变化以及离体主动脉、肺动脉反应性变化的影响。方法 健康新西兰大耳白色雄性家兔 ,体重 2 0～ 2 1kg,乌拉坦静脉麻醉 (1g/kgbw) ,随机分为 5组 (每组 8只 ) ,生理盐水组 (对照组 ) ;LPS组 :LPS 8mg/kgi.v .复制家兔ES模型 ;LPS +CCK组 :CCK - 81 5μg/kgi.v.,1 5min后注入LPS ;LPS +丙谷胺 (Pro)组 :Pro 1mg/kgi.v .,1 5min后注入LPS ;CCK组 :CCK - 81 5μg/kgi.v.,利用多导生理记录仪持续监测肺动脉压 (PAP)和平均动脉压 (MAP)的变化 ;5h后放血处死 ,制备主动脉环 (TARs)和肺动脉环(PARs) ,应用血管张力测定技术 ,检测离体主动脉、肺动脉反应性。结果 ①CCK - 8在ES时可部分逆转MAP降低 ,完全翻转肺PAP增高 ;而Pro加剧ES的上述效应。②在离体实验中 ,LPS组的PARs对苯肾上腺素 (PE)的收缩反应增强 ,PE(1 0 8～ 1 0 - 5mol/L)剂量反应曲线左移 ;对乙酰胆碱 (ACh)内皮依赖性舒张反应降低 ,ACh(1 0 - 8～ 1 0 - 5mol/L)剂量反应曲线右移 ;CCK - 8逆转了LPS的上述作用。CCK - 8对正常肺动脉舒缩反应无明显影响。在实验条件下 ,各组的TARs对PE的收缩反应无明显差异 ,可能与本实验整体观察时间较短有关
张冬[4]2010年在《八肽胆囊收缩素缓解内毒素血症大鼠肺损伤的实验研究》文中研究说明内毒素是指革兰氏阴性细菌细胞壁的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。当病灶或血流中革兰氏阴性细菌死亡,释放出LPS入血,形成内毒素血症(endotoxemia,ETM)。在此过程中,LPS可诱导炎性细胞产生多种促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白细胞介素-1β(interleukin,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)等,这些细胞因子可再度激活炎症细胞,释放更多的促炎因子,导致全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)。肺脏是内毒素血症时最易受损的靶器官之一,主要表现为急性肺损伤(acute lung injury, ALI),病理变化以肺间质水肿、毛细血管淤血和肺泡间隔增厚为主,成为内毒素血症死亡的主要原因。如果短时间内大量LPS入血或血液中LPS不被及时清除, ETM则会引起微循环障碍,最终形成内毒素休克(endotoxin shock,ES)。体循环和肺循环血流动力学紊乱是形成ES时主要的血流动力学变化。在此过程中,体循环血流动力学紊乱主要表现为平均动脉压(mean artery pressure , MAP)进行性下降,重要器官如肝、肾等血流灌注不足;肺循环血流动力学紊乱主要表现为肺动脉压(pulmonary artery pressure,PAP)早期升高晚期下降,上述血流动力学紊乱可最终形成多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。内毒素血症为临床的危重病症,死亡率极高,目前人类尚未找到有效的治疗的方法,因此探寻抗ETM生物学药物成为该领域亟待解决的问题。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种脑肠肽,广泛分布于体内神经、消化、呼吸、免疫系统等多个系统,参与多种生理和病理过程的调节。CCK在生物体内有多种存在形式,其中硫酸化的羧基端八肽,又称八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8),是具有CCK完全功能的最小活性片段。多年来,我室一直致力于CCK-8抗LPS作用的研究,CCK-8预处理一方面可减轻LPS诱导的肺脏间质水肿及毛细血管淤血等炎性病理损伤;另一方面可改善LPS诱导的血流动力学障碍,延缓MAP下降和PAP升高,提示CCK-8对ETM有预防作用。那么在LPS入血后,给予CCK-8是否仍然能对抗LPS引起上述损伤,即CCK-8对ETM是否具有治疗作用,目前尚未见报道。因此,本实验将采用静脉注射不同剂量LPS复制大鼠内毒素血症模型,在LPS入血之后给予CCK-8,从整体水平探讨CCK-8抗内毒素血症的作用,从而为临床治疗内毒素血症提供新的思路和治疗靶点。1 CCK-8对内毒素血症大鼠肺脏炎症反应的影响目的:观察CCK-8对低剂量LPS诱导内毒素血症大鼠肺组织促炎细胞因子TNF -α、IL-1β、IL-6生成和肺脏组织结构的影响方法:Sprague Dawley (SD)大鼠48只。实验分组:①control组在各时间点依次注入与实验组同体积的生理盐水;②醋酸铅组依次注入醋酸铅2.5mg/100g b.w.、生理盐水(与相应时间点等体积);③LPS组依次注入醋酸铅、LPS 1mg/kg、生理盐水(与相应时间点等体积);④LPS+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8 20μg/kg(LPS后30min);⑤LPS+ CCK-1R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-1R阻滞剂0.5 mg/kg (LPS后20min)、CCK-8(LPS后30min);⑥LPS+ CCK-2R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-2R阻滞剂0.5 mg/kg (LPS后20min)、CCK-8(LPS后30min);⑦LPS+DMSO+PF+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、DMSO+PF 0.1ml/100g b.w. (体积比1:4,LPS后20min)、CCK-8(LPS后30min);⑧CCK-8组依次注入醋酸铅、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8。均于LPS注入30min后开始计时,检测Control组和LPS组血液细菌内毒素含量,确定内毒素血症模型复制成功。检测各组大鼠肺组织中TNF -α、IL-1β、IL-6的含量,并用光镜和透射电镜分别观察各组大鼠肺脏组织结构变化。数据以x±s表示,单因素方差分析进行组间比较,有显着差异者用最小显着差法(least significant difference,LSD)进行两两比较,以P <0.05为有显着差异。实验结果如下:(1)LPS组的细菌内毒素的含量明显高于control组(2.39±0.20)EU·ml-1 vs (0.14±0.02)EU·ml-1(P <0.05),标志内毒素血症已经形成。(2)LPS组2h后肺脏TNF-α含量显著高于control组(1620.87±329.61)pgl·L-1 vs (663.00±155.56)pg·L-1(P<0.05)。给予CCK-8后TNF-α含量(1215.11±260.31)pg·L-1较LPS组显着减少(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后TNF-α含量升高(1678.56±394.87)pg·L-1,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的TNF-α含量与LPS+CCK-8组相比无明显差异(P>0.05)。醋酸铅和CCK-8组细胞因子含量较Control组无显着差异(P>0.05)。(3)LPS组2h后肺脏IL-1β含量显著高于control组(6189.17±791.40)pg·L-1 vs (508.84±85.08)pg·L-1(P<0.05)。给予CCK-8后IL-1β含量(5023.31±855.82)pg·L-1较LPS组显着减少(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后, IL-1β含量升高(5988.78±504.67)pg·L-1,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+ CCK-8组)的IL-1β含量与LPS+CCK-8组相比无明显差异(P>0.05)。醋酸铅和CCK-8组细胞因子含量较Control组无显着差异(P>0.05)。(4)LPS组12h后肺脏IL-6含量显着高于对照组(1641.29±198.21)pg·L-1 v(s124.64±24.30)pg·L-(1P<0.05)。给予CCK-8后IL-6含量(874.03±114.02)pg·L-1较LPS组显着减少(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后,IL-6含量升高(1433.00±180.28)pg·L-1,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+ CCK-8组)的IL-6含量与LPS+CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅和CCK-8组细胞因子含量较Control组无显着差异(P>0.05)。(5)LPS组大鼠12 h后肺小动脉充血,肺泡间隔增宽,毛细血管扩张淤血、PMN增加;肺泡腔萎陷较为明显。在注射LPS 30min后即内毒素血症形成后给予CCK-8可明显改善上述病变。预先给予CCK-2R阻滞剂可明显抑制CCK-8的效应,而预先给予CCK-1R阻滞剂则对CCK-8的效应无明显影响。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)与LPS+CCK-8组相比,无明显变化。Contro组、醋酸铅组和CCK-8组大鼠肺组织结构清晰,无异常改变。(6)LPS组大鼠12 h后肺毛细血管内PMN增加,内皮细胞肿胀,胞质电子密度降低,饮泡增多。肺泡隔细胞板层体排空。Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛减少,线粒体肿胀、空化,板层体减少。预先给予CCK-2R阻滞剂可明显抑制CCK-8的效应,,而预先给予CCK-1R阻滞剂则对CCK-8的效应无明显影响。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)与LPS+CCK-8组相比,无明显变化。Control组、醋酸铅组和CCK-8组大鼠肺组织结构清晰,无异常改变。2 CCK-8对内毒素血症大鼠血流动力学的影响目的:观察CCK-8对高剂量LPS诱导内毒素血症大鼠4小时死亡率、MAP、PAP、心率(heart rate,HR)、潮气量(tidal volume,TV)、肝脏微循环血流和肾脏微循环血流的影响。方法:Sprague Dawley (SD)大鼠48只。实验分组:①control组在各时间点依次注入与实验组同体积的生理盐水;②醋酸铅组依次注入醋酸铅20mg/100g b.w.、生理盐水(与相应时间点等体积);③LPS组依次注入醋酸铅、LPS 30mg/kg、生理盐水(与相应时间点等体积);④LPS+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8 50μg/kg(LPS后30min);⑤LPS+CCK-1R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-1R阻滞剂1mg/kg (LPS后20min)、CCK-8;⑥LPS+ CCK-2R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-2R阻滞剂1mg/kg(LPS后20min)、CCK-8;⑦LPS+DMSO+PF+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、DMSO+PF 0.1ml/100g b.w. (体积比1:4,LPS后20min)、CCK-8;⑧CCK-8组依次注入醋酸铅、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8。左侧颈动脉插管监测MAP、右侧颈静脉插管至肺动脉监测PAP、连接心电导连监测HR、气管插管监测TV、激光多普勒血流仪分别监测肝、肾微循环血流,连接生理记录仪。由于SD大鼠具有个体差异性,在预实验中表现出对LPS和CCK反应的不完全一致性,主要体现在MAP和PAP随时间点变化的不同。因此我们根据上述变化的不同,将动物分为两群,并设计了两组时间点来记录MAP和PAP。于LPS注入30min后开始计时,一组时间点分别于0h、1.5h、3h记录各组大鼠MAP、PAP、HR、TV、肝脏组织血流,其中肾脏组织血流记录时间分别为0h、0.5h、1h、1.5h;另一组时间点分别于0h、2h、3h、4h、6h、8h记录各组大鼠MAP、PAP。数据以x±s表示,单因素方差分析进行组间比较,有显着差异者用最小显着差法(least significant difference,LSD)进行两两比较,以P <0.05为有显着差异。实验结果如下:(1)第一群大鼠4小时死亡率变化第一群大鼠LPS组的死亡率为100%,给予CCK-8后死亡率明显降低至0%,预先应用CCK-2R阻滞剂明显抑制了CCK-8的效应,而预先应用CCK-1R阻滞剂则对CCK-8的效应无明显影响。(2)MAP和PAP变化按照第一组时间点记录第一群大鼠MAP和PAP的变化,结果如下:control组1.5 h和3h,MAP分别为13.79±0.78 kPa,13.76±1.34 kPa; PAP分别为1.85±0.67 kPa,2.40±0.11 kPa。LPS组1.5 h,MAP下降至8.24±2.11 kPa,PAP升高为3.66±0.66 kPa(早期升高),与对照组1.5 h时间点相比有显着差异(P<0.05);注射LPS 3h, MAP进一步下降至4.81±0.81 kPa(P<0.05),而PAP却随着MAP的进行性降低由早期升高转为晚期下降,为2.63±0.48 kPa,与对照组相比无显着差异(P>0.05)。给予CCK-8可明显延缓LPS诱导的上述各时间点MAP的进行性下降,分别为11.09±1.91 kPa、8.47±1.22 kPa(P<0.05);预先应用CCK-2R阻滞剂使上述各时间点MAP分别降至8.36±2.02 kPa、4.00±0.84 kPa,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05);预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。而CCK-8对LPS诱导的PAP的影响不同于对MAP的影响,给予CCK-8不能有效缓解LPS诱导的1.5h时间点PAP的升高(P>0.05),甚至表现为3h时间点PAP进一步升高;预先应用CCK-1R阻滞剂和CCK-2R阻滞剂对CCK-8的效应均无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点MAP、PAP分别与LPS +CCK-8组相比无明显差异(P>0.05);醋酸铅组和CCK-8组的MAP、PAP与control组比较也未见显着差异(P>0.05)。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组MAP、PAP在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对第一群大鼠MAP、PAP的变化无明显影响。按照第二组时间点记录第二群大鼠MAP和PAP的变化,结果如下:control组2h、3h、4h、6h、8h,MAP分别为14.69±0.95 kPa、14.86±0.95 kPa、15.05±0.62 kPa、13.95±0.11 kPa、13.83±0.51 kPa;LPS组MAP呈现进行性下降的趋势,在相应时间点分别为:8.31±0.76 kPa、5.29±1.02 kPa、4.10±0.84 kPa、0.00±0.00 kPa(动物死亡)、0.00±0.00 kPa(P<0.05),与control组各时间点相比有显着差异(P<0.05),且与第一群大鼠相比,LPS诱导的第二群大鼠MAP下降速度更为缓慢。CCK-8对LPS诱导的MAP变化的影响与第一群动物相似,即CCK-8明显延缓了LPS诱导的上述各时间点MAP的进行性下降,于上述各时间点分别为:11.78±1.51kPa、11.73±1.71kPa、11.57±1.93kPa、9.92±0.58kPa、8.12±1.5kPa(P<0.05),且延缓MAP下降的程度较第一群动物更为明显;预先应用CCK-2R阻滞剂也同样明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05),CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。对于PAP ,control组在2h、3h、4h、6h、8h分别为2.39±0.43 kPa、2.20±0.17 kPa、2.32±0.21 kPa、1.97±0.18 kPa、2.26±0.25 kPa。给予LPS后上述各时间点,PAP分别为3.41±0.44 kPa、2.29±0.83 kPa、2.30±0.19 kPa、0.00±0.00 kPa、0.00±0.00 kPa(P<0.05),表现为早期升高晚期下降,变化趋势与第一群大鼠一致。但CCK-8对LPS诱导的PAP变化的影响与第一群动物不同,虽然给予CCK-8后PAP于2h时间点仍然表现为升高(3.72±0.25 kPa),与LPS组相比较无明显差异,P>0.05),但是在6h时PAP下降为2.66±0.51 kPa,而此时MAP为9.92±0.58 kPa,还未到达休克水平,提示CCK-8可在延缓MAP下降且未达休克水平时缓解LPS诱导的肺动脉高压。给予CCK-8后8h,PAP进一步下降至2.62±0.32 kPa,与control组相应时间点相比无显着差异,(P>0.05),而此时MAP为8.12±1.53 kPa,接近休克水平,进一步表明CCK-8缓解LPS诱导的PAH的效应可以维持到邻近休克水平。预先应用CCK-2R阻滞剂在6h、8h时间点可明显抑制CCK-8对LPS诱导的PAH的效应(P<0.05);而CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点MAP、PAP分别与LPS+CCK-8组相比无明显差异;醋酸铅组和CCK-8组的MAP、PAP与control组比较也未见显着差异(P>0.05)。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组MAP、PAP在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对第二群大鼠MAP、PAP的变化无明显影响。(3)HR变化处理前各组HR之间未见显着差异。control组1.5 h和3h HR分别为370±36 bpm、350±60bpm,LPS组相应时间点分别下降到229±34 bpm、196±50bpm,与control组比较有显着差异(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点HR分别升高为259±44 bpm、321±76 kPa,较LPS组显着升高(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂上述各时间点HR降低至265±51 bpm、171±40 bpm(P<0.05),明显抑制了CCK-8的效应。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点HR分别为257±25 bpm、293±30 bpm与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显着差异。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组HR在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对HR的变化无明显影响。(4)TV变化处理前各组TV之间未见显着差异。LPS组1.5 h和3h分别下降到0.42±0.16 ml、0.26±0.14 ml,较control组相应时间点0.87±0.13 ml、0.90±0.17 ml显着降低(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点TV分别为0.73±0.22 ml、0.82±0.28 ml,较LPS组显着升高(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂上述各时间点HR降低至0.30±0.18 ml、0.19±0.10 ml(P<0.05),明显抑制了CCK-8的效应。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响,(P>0.05)。CCK-8受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点TV与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显着差异。仅LPS组和LPS+CCK-2R阻滞剂+CCK-8组的TV在各时间点用药前后发生明显变化(P>0.05),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对TV的变化无明显影响。(5)肝微循环血流变化处理前各组肝微循环血流之间未见显着差异。LPS组1.5 h和3h分别下降到602.18±295.86 BPU、208.90±33.57 BPU,较control组1136.15±105.15 BPU、961.73±285.80 BPU在各时间点显着降低(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点肝微循环血流分别为748.65±289.41 BPU、927.91±225.03 BPU,较LPS组显着升高(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后,上述各时间点肝微循环血流明显降低至812.15±75.39 BPU、244.00±172.17 BPU(P<0.05),明显抑制了CCK-8的效应。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组LPS+DMSO+PF+CCK-8组的上述各时间点肝微循环血流与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显着差异。仅LPS组和LPS+CCK-2R阻滞剂+CCK-8组的肝微循环血流在各时间点用药前后发生明显变化(P>0.05),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对肝微循环血流的变化无明显影响。(6)肾微循环血流变化处理前各组肾微循环血流之间未见显着差异。LPS组0.5h、1h和1.5h分别下降到20.13±1.71 BPU、3.09±0.62 BPU、1.78±0.79 BPU,较control组显着降低(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点肾微循环血流较LPS组显着升高,分别恢复至198.76±13.53 BPU、97.80±13.55 BPU、90.97±12.79 BPU(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂可明显抑制CCK-8的效应,上述各时间点肾微循环血流明显降低,与LPS组无差异(P>0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点肾微循环血流与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显着差异。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组肾脏微循环血流在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对肾微循环血流的变化无明显影响。结论1在内毒素血症形成后,应用CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠肺脏促炎细胞因子生成,显着改善LPS诱导的肺组织结构损伤。2 CCK-8一方面可明显延缓LPS诱导的ETM大鼠MAP进行性下降、改善肝、肾微循环血流,恢复HR;另一方面可有效降低LPS诱导的ETM大鼠PAH,改善TV。
李娜[5]2007年在《CCK-8对LPS诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞MnSOD基因表达的影响》文中研究指明目的:胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是一种重要的神经调节肽。CCK在体内存在多种活性片段如4肽、8肽、33肽、39肽和58肽等,其中八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)是其最主要的活性形式。CCK通过其受体发挥调节作用,CCK受体属于G蛋白藕联受体,根据其亲和力以及生物学功能不同,CCK受体分为A、B两种亚型。近年来研究显示,CCK-8及其受体在哺乳类动物体内分布十分广泛。已有文献报道,CCK-8可缓解失血性休克,在内毒素血症患者的血液中CCK-8含量显着升高。此后本室的系列研究证实,内、外源脑肠肽CCK-8确实具有抗内毒素休克(endotoxin shock,ES)作用,可减轻ES发生早期的肺循环和体循环血流动力学紊乱,其机制与调节氧化应激有关。在ES发病过程中,一方面脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所导致的氧化应激,产生大量的超氧阴离子(O-·2);另一方面诱导包括血管平滑肌细胞(VSMC)在内的机体多种细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达,产生大量的一氧化氮(NO),NO和O-·2形成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。NO、O-·2以及ONOO-参与启动机体氧化应激、介导ES发病过程中肺循环和体循环血管反应性异常改变,因此,O-·2的产生和清除机制研究是十分重要的。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是机体清除O-·2唯一的特异性酶,可使体内的O-·2维持在一定水平。目前,在真核细胞中发现有3种SOD:分布于细胞浆的CuZn SOD,分布于线粒体的MnSOD和分泌到细胞外的EC SOD,其中MnSOD是一种诱生型酶,多种因素如氧化应激、肿瘤坏死因子和LPS等,都可诱导MnSOD表达增加。我们已往的研究结果显示,VSMC存在CCK-8受体,CCK-8对LPS诱导的培养血管内皮细胞SOD活性变化具有一定的调节效应,CCK-8作用的靶点可能是血管SOD和O-·2的生成系统。然而,CCK-8调节血管SOD活性变化的机制尚不清楚。由于MnSOD是诱生型酶且分布在与氧化应激发生密切相关的线粒体,探索CCK-8对LPS诱导MnSOD基因表达的影响及其信号转导机制如受体机制是必要的。本实验拟探讨CCK-8对LPS诱导血管平滑肌细胞MnSOD基因表达的影响,以阐明CCK-8抗ES作用的分子机制。方法:选用雄性、健康Wistar大鼠(120±20g),无菌条件下分离大鼠胸主动脉,用贴块法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞(TASMCs),传代至对数生长期(实验用5~8代),调整细胞密度为每瓶1×107,加入无血清DMEM培养液以及不同处理因素,检测MnSOD mRNA的表达情况。实验程序:1、分别用0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L LPS以及生理盐水孵育TASMCs 4h,用0.1mg/L LPS孵育TASMCs 2h、4h、8h,检测MnSOD mRNA表达变化,以观察LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达的时效与量效关系。2、用0.1mg/L LPS分别和10-6、10-8、10-10mol/L CCK-8共同处理细胞4h,检测MnSOD mRNA表达变化,以观察CCK-8对LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达的影响。3、在前述实验结果的基础上,选择CCK-8、LPS各一个剂量和一个时间点,CCK-8+LPS与丙谷胺(Pro,CCK受体非特异性阻断剂)、CR-1409(CCK-A受体特异性阻断剂)或CR-2945(CCK-B受体特异性阻断剂)处理细胞,另设Pro、CR-1409、CR-2945对照组,检测MnSOD mRNA表达变化,研究CCK-8对LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达影响的受体机制。用RT-PCR方法检测MnSOD基因表达,用江苏捷达凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析,用MnSOD与β-actin的吸光度比值代表MnSOD mRNA相对表达水平。数据用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,组间比较行单因素方差分析(one-way ANOVA),有显着差异者进一步用最小显着差法(LSD)进行两两比较,以P<0.05为有统计学意义。结果:1、在TASMCs存在MnSOD mRNA基础表达;与对照组相比,0.01mg/L、0.1mg/L及1.0mg/L LPS分别孵育细胞4h可剂量依赖性引起MnSOD mRNA表达升高(P<0.05);在LPS诱导TASMCs MnSOD表达的时效关系中,发现2h就可诱导MnSOD mRNA表达升高(P<0.05),4h表达达到高峰(P<0.05),8h持续高表达(P<0.05)。2、10-6、10-8、10-10mol/L CCK-8预先处理TASMCs 30min后加入LPS,MnSOD mRNA表达可不同程度地被抑制,与LPS组相比有显着性差异(P<0.05);CCK-8的抑制效应具有浓度依赖性(P<0.05);CCK-8(10-8 mol/L)单独处理细胞可导致TASMCs MnSOD mRNA表达明显下调,与对照组相比有显着性差异(P<0.05)。3、预先用CR-1409、CR-2945、Pro孵育细胞10min后再给予CCK-8和LPS,CR-1409+CCK-8+LPS和CR-2945+CCK-8+LPS组MnSOD mRNA表达与CCK-8+LPS组相比明显升高(P<0.05),但仍低于LPS组(P<0.05),其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409更为显着(P<0.05);Pro+CCK-8+LPS组则完全翻转了CCK-8的抑制效应。结论:CCK-8对TASMCs MnSOD mRNA的基础表达具有抑制性调节作用;LPS可剂量依赖性诱导TASMCs MnSOD mRNA表达上调,MnSOD mRNA的表达高峰开始于LPS作用后4h左右;CCK-8可浓度依赖性抑制LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达,CCK受体介导CCK-8该抑制作用,其中CCK-BR可能起主要作用。
黄新莉[6]2004年在《HO-1/CO在八肽胆囊收缩素减轻内毒素所致的急性肺损伤中的作用》文中提出革兰氏阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是导致内毒素休克(endotoxic shock,ES)的主要因素，ES是临床常见的危重病症，死亡率极高，肺脏是ES时最易受损的靶器官之一。肺动脉高压是ES发病早期的特征性病理变化，肺动脉压增高的程度及其维持的时间是休克并发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的重要因素。ES时，肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)在维持肺动脉的反应性中发挥重要作用。研究显示促炎症细胞因子、氧自由基和一氧化氮(nitric oxide,NO)等多种致炎物质在ES时肺损伤的发生中起主要作用，针对氧化性损伤，组织可产生多种抗氧化物质，如血红素氧合酶-1(heme oxygenase,HO-1)和胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)等。HO-1是一种新发现的应激蛋白，可被许多能引起氧化损伤的因素诱生。我室周君琳等的研究发现，HO-1及其代谢产物一氧化碳(carbon monoxide,CO)在肢体缺血／再灌注肺损伤中发挥保护作用。CCK是一种脑肠肽，参与了多种生理及病理过程。八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)为内源性CCK的重要功能片段。CCK的作用主要由两种受体介导，即CCK-A受体(CCK-A receptor,CCK-AR)和CCK-B受体(CCK-B receptor,CCK-BR)。以往对CCK的研究多偏重于其在消化系统、神经系统及内分泌系统中的调节作用。CCK-8在肺脏也有分布，然而CCK-8在肺脏特别是在ES时肺脏病理变化中的作用报道较少。我室系列研究发现CCK-8具有显着的抗ES作用，可部分逆转肺动脉压增高并可改善LPS所致的肺损伤。以往研究结果提示HO-1及其产物CO与CCK-8改善ALI之间可能存在着内在联系。 丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是多种细胞外刺激激活各种信号途径的交汇点，具有调节细胞基本生命活动的功能。迄今已证明，在真核细胞中该家族有4个成员，即：①细胞 中文摘要外信号调节激酶(extraeellular一signal:egulated kinase，E双)，②e一Jun氨基末端激酶(e一Jun NHZ一terminal kinase，刃冈K)，③p38MApK，④E既5/B MK，(big mitogen一aetivated protein kinase，BMK:)。引闪K又被称为应激激活蛋白激酶(stress aetivated protein kinase，s妙K)，它可被多种应激原、促炎细胞因子和炎症介质等激活，激活的JNK在氧化应激反应中发挥重要作用。众所周知，LPS可激活MAPK信号转导通路，以往研究证实在胰腺腺泡细胞CCK也可激活MAPK通路。转录因子是MAPK的重要目标，活化蛋冬l(aetivator protein一1，Ap一l)是第一个被发现的转录因子，在机体抵抗炎症反应的过程中发挥重要作用。大量的实验结果表明，HO一l的表达可能受AP一1的调节。AP一1不是一个单一的蛋白质，它是由含有亮氨酸拉链区的多种蛋白质构成的二聚体，在其组成成员中，c一Jun的作用是最强的，只有c一Jun持续表达并同时被磷酸化才足以诱导HO一1表达。已证实JNK是c一Jun磷酸化调节的一个重要因素，是MAPK家族中唯一能够有效磷酸化c一Jun的Ser一63和Ser一73位点的蛋白激酶‘由此我们推测JNKJc一Jun通路参与了LPS诱导的HO一1基因表达。 CCK一8对LPS诱导的大鼠肺组织中HO一1表达有何作用，它是否通过调控HO一l/CO来发挥细胞保护作用，以及刃阿K/c一Jun通路是否参与CCK一8对LPS诱导的HO一l表达的调控均未见报道。本研究在我室以往系列研究的基础上，从整体、细胞及分子水平，观察CCK一8对LPS所致的ALI及PASMC损伤的改善作用，CCK受体(CCK reeeptor，CCK-R)在PASMC中的分布及表达变化，以及CCK一8对LPS诱导的HO-1/CO的影响及JN下了c一Jun通路在此过程中的作用，以探讨内源性CO在CCK一8抗LPS所致的ALI中的作用，为临床防治ES时的ALI提供新的对策。1内源性CO在CCK一8减轻内毒素所致的急性肺损伤中的作用 本实验通过舌静脉注入LPS复制AU模型，观察内源性CO在CCK一8抗LPS所致的ALI中的作用。将84只雄性SD大鼠随机分为7组(每组12只):①对照组:注入等量生理盐水(0 .5 ml瓜g);②LPS组:注入LpS(5 mg/kg，1 0 mg/ml);③LpS+Znpp(HO一l特异性抑制剂)组:注入LPs前一0 min注入znPP(1 0 mg服g，xo mg/ml):④ 中文摘要LPS+Hm(Hemin，CO供体)组:注入LpS前1 0 min注入Hm(1 0 mg/Kg，10m留ml);⑤CCK一8+LpS组:注入LpS前10 min注入CCK-8 (40”眺g，0.05 mg/ml);⑥CCK一8+Lps+znPP组:注入LPs前20min先注入ZnPP，其后1 0 min注入CCK一8;⑦CCK一8组:注入CCK-8。各组给药后Zh，6h，12h进行观察:每组6只动物用于支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)，检测支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中中性粒细胞 (polymo甲honuelear neutrophil，pMN)数目;分离各组另外6只未进行BAL动物的右侧颈静脉插管至右心房，分离左颈动脉插管至主动脉根部，采集血液分别代表入肺血(in一flowing pulmona汀blood，IPB)和出肺血(out一going pulmona仃blood，OpB)，检测血液中碳氧血红蛋白 (earbo材hemoglobin，COHb)水平代表CO
韦鹏[7]2003年在《八肽胆囊收缩素对内毒素休克时脑损伤的影响及其机制初探》文中研究说明目的：内毒素休克(ES)是临床常见的危重病症，持续ES可导致多器官功能障碍甚至多器官功能衰竭，死亡率极高。ES时常可发生脑功能障碍，但其机制尚未完全明了。已知氧化应激是ES时组织损伤的主要机制之一。过量产生的氧自由基、一氧化氮（NO）及其与超氧阴离子自由基（）的反应产物过氧亚硝基阴离子（ONOOˉ）可使脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生氧化、硝基化，引起组织细胞功能代谢改变和结构损伤。NO并介导了脑组织缺血缺氧时兴奋性氨基酸的神经毒作用。已有研究表明，八肽胆囊收缩素（CCK-8）具有抗ES作用，可改善内毒素引起的血管反应性降低，减轻组织损伤，但CCK-8对ES时脑组织损伤是否有影响尚未见报道。本研究通过静脉注射内毒素的主要活性成分脂多糖（LPS）建立ES模型，观察CCK-8对脑组织损伤的影响，并初步探讨其作用机制。方法：实验用日本大耳白兔和Sprague Dawley（SD）大鼠。将家兔经耳缘静脉注射25%乌拉坦（1g/kg）麻醉后，分离左颈总动脉用于监测平均动脉压（MAP）, 分离右颈静脉用于注药。将动物随机分为4组，每组8只：①对照组：注入等量生理盐水；② LPS组：注入LPS（8 mg/kg，8 mg/ml），LPS注入后出现MAP显着下降为ES 模<WP=4>型；③ CCK-8+LPS组：注入LPS前30 min注入CCK-8（15μg/kg,1 mg/ml）；④丙谷胺（Pro）+LPS组：注入LPS前30 min注入Pro（1 mg /kg，1 mg/ml），Pro为非选择性CCK受体拮抗剂。监测并描记注药前和最后一次注药后30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h MAP。于注药前和注药后1h、3h、5h从颈总动脉插管取血液，5h放血处死动物取脑组织（大脑皮层和海马），制备血浆及组织匀浆，检测丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，NO含量和一氧化氮合酶（NOS）活性。光镜、电镜观察脑组织中上述区域的形态学变化。SD大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，经舌下静脉注药。将动物随机分为4组，每组3只：①对照组：注入等量生理盐水；② LPS组：注入LPS（8 mg/kg）；③ CCK-8+LPS组：注入LPS前30 min注入CCK-8（40μg/kg）；④Pro+LPS组：注入LPS前30 min注入Pro（1 mg /kg）。注药后6h断头处死动物取脑组织，免疫组织化学染色检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和神经型一氧化氮合酶（nNOS）在脑组织中的表达和分布。数据用均数±标准差（±s）表示。单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较，有显着差异者用最小显着差法（LSD）进行两两比较，以P <0.05为有显着差异。结果：LPS注入后30min，家兔的MAP （10.79±1.42kPa）明显低于对照组(13.43±2.44kPa), P<0.01; 此后持续下降， 5h降至8.10±1.61kPa，各时间点MAP均明显低于对照组（P<0.01）。CCK-8+LPS组与<WP=5>LPS组相比，30min时其MAP略有升高，但无显着性差异，1.5h后各时间点MAP明显升高（P<0.05，P<0.01）。Pro+LPS组与对照组相比，其 MAP显着下降（P<0.01）；与LPS组相比表现为进一步下降趋势，但无统计学意义。与对照组相比，LPS组1h、3h、5h血浆中 NO含量和NOS活性明显升高（P<0.05，P<0.01），SOD活性减低（P<0.01），3h、5h MDA含量明显升高（P<0.05）。CCK-8+LPS组相应时间点的NO、MDA含量和NOS活性显着低于LPS组（P<0.05, P<0.01）， 3h、5h的SOD活性显着高于LPS组（P<0.05）；与对照组相比无明显差异。Pro+LPS组1h血浆中MDA水平较LPS组显着升高（P<0.05）。5h后检测脑组织中NO、MDA含量和NOS、SOD活性，结果显示：LPS组大脑皮层和海马中NO、MDA含量和NOS活性均较对照组明显升高（P<0.05，P<0.01）；SOD活性则显着下降（P<0.01）。与LPS组相比，CCK-8+LPS组NO、MDA含量和NOS活性显着降低（P<0.05，P<0.01），与对照组水平较为接近；SOD活性明显升高（P<0.05）。Pro+LPS组与LPS组相比，其大脑皮层中MDA含量显着增加（P<0.05），NO含量、NOS活性和SOD活性分别有进一步升高和降低的趋势；海马中NO含量、NOS活性及MDA含量明显升高(P<0.05，P<0.01), SOD活性表现为降低的趋势。光镜和电镜结果表明，LPS组家兔脑组织呈明显水样变性，神经元、神经纤维、血管周围水肿，CCK-8可一定程度上减轻脑组织以上病理性变化，Pro则进一步加重该<WP=6>种形态学改变。免疫组织化学染色结果显示，对照组大脑皮层和海马部位可见神经元胞浆中微弱的黄染nNOS阳性信号，未见明显的iNOS阳性信号；LPS组大脑皮层和海马部位iNOS被诱导表达，黄染信号可见于神经元和胶质细胞的胞浆中，nNOS阳性信号较对照组略为增强；CCK-8+LPS组胞浆iNOS、nNOS黄染信号较LPS组略为减弱；Pro+LPS组胞浆中iNOS和nNOS的阳性信号均较其他组增强。结论：1. 静脉注射LPS引起家兔MAP持续下降，成功复制了ES模型；ES时可发生脑组织损伤，可能与LPS诱导产生过量自由基以及过度表达的iNOS、nNOS催化产生大量NO有关。2. CCK-8可部分逆转LPS引起的血压下降，减轻脑损伤。3. 初步证实CCK-8可一定程度上抑制LPS诱导血液和脑组织中自由基过量生成，抑制LPS引起的血液和脑组织中NOS活性增强和iNOS、nNOS蛋白过度表达，这可能是其抗ES时组织损伤的作用机制之一。
李淑瑾[8]2002年在《CCK-8对LPS诱导大鼠肺间质巨噬细胞活化的抑制作用及其信号转导机制的研究》文中提出炎症失控是感染性疾病并发多器官功能障碍的主要发病机制，单核-巨噬细胞的活化在诱导炎症反应中起关键作用。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或其它致炎因素作用下，巨噬细胞生成并释放大量的促炎细胞因子，包括TNT-α、IL-1β、IL-6等，这些细胞因子的过量释放可引起机体自身组织损伤，导致过度的全身性炎症反应，最终导致多器官功能障碍以至死亡。肺脏是公认的较早发生功能障碍的器官。肺巨噬细胞包括分布在肺泡腔表面及肺泡腔内的肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)，分布在肺泡隔、支气管及血管旁的肺间质巨噬细胞(pulmonary interstitial macrophages，PIMs)和肺血管内的巨噬细胞。近来对PIMs研究的不断深入表明，在内毒素血症时PIMs较AMs更早受到LPS攻击，其吞噬功能、对补体的趋化作用及产生氧自由基的能力明显强于AMs，在肺组织炎症反应中起重要作用。因此，有效控制肺PIMs的过度激活将对减轻肺组织炎症反应起到积极的保护作用。 体内一些神经肽／激素如生长激素、生长抑素、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、降钙素基因相关肽、八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)、神经肽Y、神经加压素等具有一定的抗炎及抗休克作用，构成了神经-内分泌-免疫调节网络的重要物质基础。本室一直致力于研究CCK-8的抗内毒素休克(endotoxin shock，ES)及抗炎作用，用CCK-8预处理ES大鼠可使平均动脉压回升而肺动脉压降低，并明显减轻ES时肺脏、肝脏、脾脏、肾脏间质水肿及白细胞浸润等炎性病理损伤，降低死亡率。CCK-8缓解ES大鼠早期肺动脉高压的作用与其减轻肺脏炎症反应有关。但有关CCK-8的抗炎作用及其机制尚未完全阐明，仍存在许多问题亟待解决。我们的新近研究表明肺巨噬细胞存在CCK受体基因表达，并可被LPS诱导表达 中文摘要增加，提示CCK七可能通过与其受体相互作用而干预LPS激活巨噬细胞的过程，从而调节炎症反应。 LPS介导巨噬细胞活化的信号通路错综复杂，但目前认为LPS一CD14TLR4一IRAKIKKIKB－－am＊x－h了rolnfiammatory cytoklnes是其中一条关键的信号通路，即LPS与巨噬细胞膜表面LPS受体CD14结合后，激活 Toll样受体 4（TOll like receptor 4，TLR4）并与之结合形成受体复合物，募集适配分子 MyD88，MyD88的死亡结构域再募集下游的L－l受体相关激酶（IL－lreceptor－associated kinase，I肌）到受体复合物。IRAK随后发生自磷酸化，从受体复合物解离，募集’－’v－’受体相关因子 6（1’i－ receptor－associated factor 6，T附6），］顺次激活下游激酶，包括 W－h诱导激酶（W－h－inducing kinase NIK）和丝裂素活化蛋白激酶a皿激酶激酶（mitogen－activated Protein klnase亿RKkinase kinase，MEKKI）。激活的MK或MEKKI 都能独自激活I皿复合物，导致Ich磷酸化降解，NF－h移位入核，启动目的基因转录。 因此本实验以体外培养的大鼠PIMS为对象，系统研究CCK8对LPS作用下细胞内 LPS——CD14——TLR4－I－I皿一Ith一h一prolnflammatory cytokines s条信号通路的影响，探讨 CCK七对 LPS诱导PIMS活化的作用及其信号通路，以揭示CCK七抑制LPS致肺组织炎症反应的作用机制。 ICCK－吕对LPS诱导大鼠肺间质巨噬细胞产生促炎因子及基因表达的影响 应用胶原酶消化法结合肺泡耗竭灌洗和肺循环灌洗技术分离纯化SD大鼠PIMS，在加入或不加人CCK七的情况下，用LPS刺激细胞一定时间，用ELISA7L检测细胞培养上清中TNF咀的含量，用RTPCR。”技术分析细胞中 ’vmv咀及 ILl InRNA的表达。数据用王土s表示，用SPSS统计分析软件进行统计学分析，各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA人用最小显着差法 （leastsignifican differenCe，LSD）作两两比较，P＜O刀5为有显着性差异。结果显示：（）NMs自发性产生IN17亿的量非常少，低于我们检测的下限。LPS lm叭孵育 PIMs 12 h时，细胞上清中的 TNF心含量明显增多 门66．61土 124．40 pg／ml，P＜0刀1）；CCK．8（10｛ mol／L－10－‘mol／L）可剂量依赖性地抑制 LPS诱 2 中文摘要 导的 INF叱生成增多，10－‘mol／L CCK七轻微降低 LPS诱生的 INI7咀， 但无统计学意义（497＊ 1士 132．25 pg／ffil， P＞0＊5），而 10－’mol几 CCK－8 抑制LPS诱导的T’i－－Q生成达44％（3 19＊ 士62．ZI pg／ffil，P＜0＊1）， 10“mol几 CCK－8抑镐率达刀％ （16．99士63．49 p吻l，P＜0＊1），但仍 明显高于对照组（P＜0刀5人＊＊卜8单独孵育对TNF心的生成无明显影 响（P＞0刀5）。（2）LPS叭孵育 PIMs 3 h可导致细胞 1’i－’－a mRNA 表达明显增高（P＜O．01人而＊陀与＊＊义8共同孵育的NMs，其TNF咀 ＜ RNRNA表达水平明显低于＊＊S组，并呈剂量依
刘森[9]2004年在《CCK-8对脂多糖诱导血管平滑肌细胞和ECV-304 SOD活性变化的影响》文中提出目的：探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖（LPS）诱导血管平滑肌细胞（VSMC）和人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）超氧化物歧化酶活性变化的调节作用。方法：常规细胞培养，用LPS、CCK-8、CCK-8+LPS或溶剂分别孵育VSMC和ECV-304 2h、6h和16h，检测细胞SOD活性变化。实验分组：实验分成4组，（1）对照组（Control组）（2）LPS 0.5ug/ml组（L组）（3）CCK10-8mol/L组（CCK组）（4）LPS 0.5ug/ml+CCK10-8mol/L组（C+L组）。结果：第一部分（1）LPS对血管平滑肌细胞SOD活性的影响：同一浓度为0.5ug/ml的LPS处理VSMC细胞2h、6h和16h：与Control 6h组相比较，LPS组SOD活性降低（P<0.01）。（2）CCK-8对VSMC SOD活性的影响：同一浓度为10-8mol/L的CCK-8处理细胞2h、6h和16h：与Control 2h组相比较，CCK组SOD活性升高（P<0.05）；与Control 6h组相比较，CCK组SOD活性升高（P<0.01）；与Control 16h组相比较，CCK组SOD活性升高（P<0.05）。（3）CCK＋LPS作用下VSMC SOD活性的影响：CCK-8＋LPS处理细胞2h、6h和16h：CCK＋LPS处理细胞2h，与Control 2h组相比较，C＋L组SOD活性降低（P<0.01）；与LPS0.5ug/ml 2h组相比较，C＋L组SOD活性降低（P<0.01）；与CCK10-8mol/L 2h组相<WP=5>比较，C＋L组SOD活性降低（P<0.01）；CCK＋LPS处理细胞6h，与LPS0.5ug/ml 6h组相比较，C＋L组SOD活性升高（P<0.01）；LPS和CCK处理细胞16h，与LPS 0.5ug/ml 16h组相比较，C＋L组SOD活性降低（P<0.01）；与CCK10-8mol/L 16h组相比较，C＋L组SOD活性降低（P<0.01）。第二部分（1）LPS对ECV-304 T-SOD活性的影响：不同浓度分别为0.01、0.1和1ug/ml的LPS处理ECV-304细胞2h、6h和16h：与Control 2h组相比较，LPS叁组T-SOD活性降低，LPS0.01ug/ml（P<0.01）、LPS 0.1ug/ml（P<0.01）、LPS 1ug/ml（P<0.01）；与Control 6h组相比较，LPS叁组T-SOD活性降低, LPS 0.01ug/ml（P<0.01）、LPS 0.1ug/ml（P<0.01）；与Control 16组相比较，LPS叁组T-SOD活性降低, LPS 0.01ug/ml（P<0.01）、LPS 1ug/ml（P<0.05）。（2）CCK对ECV-304 T-SOD活性的影响：不同浓度分别为10-9mol/L、10-8mol/L的CCK处理ECV-304细胞2h、6h和16h：与Control 2h组相比较，CCK10–8 mol/L T-SOD活性降低（P<0.01）；与Control 6h组相比较，CCK10–9mol/L组T-SOD活性升高（P<0.01）；CCK10–8mol/L T-SOD活性降低（P<0.01）；与Control 16h组相比较，CCK10–8mol/L T-SOD活性升高（P<0.01）。（3）C＋L作用下ECV-304 SOD活性的影响：C＋L处理细胞2h、6h和16h：LPS＋CCK处理细胞2h，与Control组相比较，C＋L组T-SOD活性升高（P<0.05）；与LPS 0.1ug/ml组相比较，C＋L组SOD活性升高（P<0.01）；与CCK10-8mol/L组相比较，C＋L组SOD活性升高（P<0.01）；C＋L处理细胞6h，与Control组相比<WP=6>较，C＋L组T-SOD活性升高（P<0.01）；与LPS 0.1ug/ml组相比较，C＋L组SOD活性升高（P<0.01）；C＋L处理细胞16h，与Control组相比较，C＋L组T-SOD活性升高（P<0.01）；与LPS 0.1ug/ml组相比较，C＋L组T-SOD活性升高（P<0.01）；与CCK 10-8mol/L组相比较，C＋L组SOD活性降低（P<0.01）。（4）LPS对ECV-304 Cu/Zn-SOD活性的影响：不同浓度分别为0.01、0.1和1ug/ml的LPS处理ECV-304细胞2h、6h和16h：与Control 6h组相比较，LPS 0.1ug/ml Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.05）；LPS 1ug/ml Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.01）；与Control 16h组相比较，LPS 叁组Cu/Zn-SOD活性升高，LPS 0.01ug/ml（P<0.01）、LPS0.1 ug/ml（P<0.01）、LPS 1ug/ml Cu/Zn-SOD（P<0.01）。（5）CCK对ECV-304 Cu/Zn-SOD活性的影响：不同浓度分别为10-9mol/L、10-8mol/L的CCK处理ECV-304细胞2h、6h和16h：与Control 6h组相比较，Cu/Zn-SOD活性值升高，CCK10–9mol/L（P<0.01）、CCK10–8mol/L（P<0.01）；与Control 16h组相比较，Cu/Zn-SOD活性升高，CCK10–9mol/L（P<0.05）；CCK10–8mol/L（P<0.01）。（6）C＋L作用下ECV-304 Cu/Zn-SOD活性的影响：C＋L处理细胞2h、6h和16h：CCK＋LPS处理细胞2h，与Control组相比较，C＋L组Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.01）。与LPS 0.1 ug/ml组相比较，C＋L Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.01）；与CCK10-8mol/L组相比较，C＋L组Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.01）；C＋L处理细胞6h，与Control组相比较，C＋L组Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.01）；与LPS 0.1 ug/ml组相比较，C＋L组Cu/Zn -SOD活性升高（P<0.01）；C＋L处理细胞16h，与Control<WP=7>组相比较，C＋L组Cu/Zn-SOD活性升高（P<0.01）。（7）LPS对ECV-304Mn-SOD活性的影响：不同浓度分别为0.01、0.1和1ug/ml的LPS处理ECV-304细胞2h、6h和16h：与Control 2h组相比较，LPS叁组Mn-SOD活性降低(P<0.01)；与Control 6h组相比较，LPS叁组Mn-SOD活性降低(P<0.01)；与Control 16h组相比较，LPS 0.01ug/ml Mn-SOD活性升高（P<0.01）、LPS 0.1ug/ml Mn-SOD活性值降低（P<0.01）、LPS 1ug/ml Mn-SOD活性降低（P<0.01）。（8）CCK对ECV-304 Mn-SOD活性的影响：不同浓度分别为10-9mol/L、10-8mol/L的CCK处理ECV-304细胞2h、6h和16h：与Control 2h组相比?
杨世方[10]2003年在《八肽胆囊收缩素对大鼠局部脑缺血/再灌注损伤的作用及其机制探讨》文中研究指明脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病之一，随着人口老龄化社会的到来，其高发病率、致死率和致残率，已渐居各种疾病之首。脑缺血是脑卒中最为常见的发病类型。因此，对脑缺血的发病机制、预防和救治的研究是当前国内外亟待解决的重大课题。谷氨酸（glutamate,Glu）是中枢神经系统主要的兴奋性递质，但其过度释放又可引起神经元损伤。脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R) 损伤的主要通路就是细胞外谷氨酸水平升高→N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体的过度激活→细胞内钙超载→一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）激活→自由基、一氧化氮(nitric oxide, NO) 及过氧亚硝基阴离子（ONOO-）的大量产生。针对这一通路诸环节损伤机制的基础研究或神经保护剂的开发研究，是当前国际上的研究热点。胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）广泛存在于人和动物的胃肠道和中枢神经系统，是一种典型的脑肠肽,也是脑中含量最丰富的神经肽之一。CCK在脑中以神经递质或调质的形式参与了多种生理及病理过程。CCK以多种分子形式存在，其中硫酸化的羧基端8肽胆囊收缩素（cholecystokinin-octapeptide, CCK-8）是CCK在脑中的主要存在形式，也是具有CCK完全生物学功能的最小活性片段。目前发现，主要有两种不同的CCK受体，即CCK A型受体（CCK-AR）和CCK B型受体（CCK-BR）。CCK-BR在脑中分布广泛，而CCK-AR仅零散分布于某些脑区。近年来研究发现CCK具有多方面的抗损伤作用，如抗胃肠道I/R损伤、抗癫痫 、拮抗Glu的神经毒性，减轻乙酰胆碱能神经元损伤等作用。有关CCK和脑缺血关系的研究很少，究竟是CCK还是其受体拮抗剂具有抗脑缺血的作用，尚存异议。CCK是否可通过影响Glu损伤通路，而减轻动物局部脑缺血 (focal cerebral ischemia, FCI)/再灌注(FCI/reperfusion, FCI/R)损伤，迄今未见报道。FCI或再灌注时，血液、脑组织CCK-8水平及其受体表达的变化规律，也不清楚。<WP=6>本实验采用栓线法大鼠FCI/R模型，通过侧脑室内（intracerebroventricular, icv）注射CCK-8或其受体拮抗剂，从形态、功能及代谢水平研究了CCK-8抗FCI/R损伤的作用及其受体机制；并在整体及离体水平，采用生物化学、免疫组织化学、分子生物学、放射免疫检测等手段，对CCK-8抗FCI/R损伤的机制进行探讨。1 CCK-8减轻大鼠FCI/R损伤1.1 CCK-8 对FCI/R损伤引起的大鼠脑形态学改变的影响观察CCK-8或其非特异性受体拮抗剂－丙谷胺（proglumide, Pro）对大鼠FCI/R所致脑形态学改变及脑梗死体积的影响。健康雄性SD大鼠(250g～290g), 用10%水合氯醛麻醉（350mg/kg, ip）后，采用栓线（直径0.25 mm）法复制FCI/R模型。脑缺血过程中，监测平均动脉血压、心率，并保持直肠温度在36.5℃～37.5℃。icv注射（前囟点后0.8 mm，左旁开1.5 mm，硬膜下3.7 mm）在脑缺血开始前15 min～20 min进行，药物均以人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid, ACSF）作为溶剂，注射总体积为5 μl。实验分为Sham组；I/R组；不同剂量CCK-8（0.3μg、1.0μg、2.0μg、4.0 μg）+I/R 组；Pro（20μg）+I/R组；Pro（20μg） + CCK-8（1.0 μg）+I/R组。各组动物均于脑缺血1 h再灌注24 h,断头取脑，经氯化-2,3,5-叁苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride ,TTC）染色后测脑梗死体积。另外，在Sham、I/R、CCK-8 (1.0μg)+I/R组各取3只大鼠，经升主动脉灌注4% 多聚甲醛固定大脑，进行常规HE染色，光镜观察形态学改变。结果如下：⑴ 脑缺血前、脑缺血20 min或60 min、再灌注20 min各时点的血压和心率变化，组间比较无显着差异 (P>0.05)。icv注射CCK-8后动脉血压仅出现轻微波动，10 min-15 min内恢复至给药前水平。 ⑵ 全脑经TTC染色后，可见非梗死脑组织被染成深红色，缺血梗死的脑组织呈苍白色，梗死区位于缺血半球大脑中动脉（middle cerebral artery, MCA）供血区。从冠状脑片TTC染色可见缺血梗死区主要位于缺血侧纹状体的背外侧及覆盖其上的大脑皮层。I/R组，大脑皮层及纹状体呈大面积的梗死；CCK-8+I/R组，大脑皮层及纹状体的梗死范围均有明显的缩小。⑶冠状脑片经HE染色后光镜下可见，I/R组缺血区大脑皮<WP=7>层呈广泛的液化样坏死，细胞出现空泡样改变，神经细胞大量丢失，残存的细胞胞核固缩深染，核仁模糊或消失，细胞间质染色浅而不均匀。CCK-8（1.0μg）+I/R组脑缺血区存活神经元较多，空泡样改变较轻、发生核固缩的细胞较少，细胞间质染色较均匀。⑷ icv 注射0.3μg～4.0μg 的CCK-8均可缩小FCI/R引起的脑梗死范围，这种作用在CCK-8的剂量为1.0μg (139.30±45.28 mm3)和2.0μg (149.83±42.38 mm3)时最强，与I/R组脑梗死体积(203.93±55.81 mm3)相比分别少31.5%和26.5%( P值均<0.05)。Pro+I/R组梗死体积(255.38±51.78 mm3)显着大于I/R组（P<0.05）；预先注射Pro，可完全阻断CCK-8的神经保护作用。结果表明，中枢给予CCK-8可减轻大鼠FCI/R损伤，这一作用具有剂量相关性，并可被CCK-8的非特异性受体拮抗剂Pro阻断;单纯注射Pro可增加梗死体积。提示内外源性CCK在脑对缺血的耐受性方面起重要作用。然而何
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