1.陕西中医学院陕西咸阳712046；
2.第四军医大学西京医院陕西西安710032；
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5.第四军医大学生理学教研室陕西西安710032；
【摘要】目的：探讨肾脏水通道蛋白1（AQP1）的表达与糖尿病肾病大鼠水液代谢异常和泽黄颗粒及其拆方防治作用的机制。方法：用高糖高脂饲料加低剂量链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型，随机分为模型组、西药对照组、泽黄颗粒组、拆方组，另设正常组。于实验第12周末检测BG、TG、TC、BUN、HbA1c、Scr及UAER指标；运用Western-blot方法检测AQP1在各组大鼠肾脏中蛋白的表达水平。结果：与模型组相比，泽黄颗粒组和西药对照组大鼠BG、TG、HbA1c水平均明显下降（P<0.01）；与西药对照组相比，泽黄颗粒组和拆方组大鼠TC、Scr、BUN、UAER水平明显下降（P<0.05）。与模型组相比，泽黄颗粒组及拆方组大鼠肾脏AQP1蛋白表达明显升高。结论：泽黄颗粒及其拆方对AQP1的表达均有上调作用，这可能是其调节水液代谢的机制，也是其防治糖尿病肾病的基础。
【关键词】糖尿病；糖尿病肾病；水通道蛋白1；泽黄颗粒
【中图分类号】R587.2【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）6-0026-02
糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）严重的微血管并发症，已成为DM患者的主要死因之一。DN的病理特点是早期肾脏高灌注，导致肾小球滤过率增高，肾小球基底膜（GBM）增厚，晚期出现肾小球结节样硬化，同时伴有肾间质和肾小管的病变。水液代谢紊乱将导致糖尿病性微血管病变的发展。中医药疗法在防治DN的过程中具有独特的优势。本研究观察泽黄颗粒及其拆方对高糖高脂饲料加STZ诱导的DM大鼠肾脏AQP1蛋白水平的表达、BG、HbA1c、UAER等指标的变化，旨在探讨AQP1的表达改变与DN水液代谢异常的关系以及泽黄颗粒及其拆方的药理效应，为DN的防治及泽黄颗粒临床应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物SD大鼠，雄性，5周龄，SPF级，共60只，体重为170～210g，第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（军）2002005。
1.1.2药物盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司；泽黄颗粒由黄芪、山药、丹参等药物组成，活血利水组份由丹参、泽兰等药物组成，均为颗粒制剂，由第四军医大学天然药物研究所提供。
1.1.3试剂与仪器链脲佐菌素（STZ）、胆固醇、胆酸钠，美国Sigma公司；兔抗大鼠AQP1，武汉博士德生物工程有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG，康为世纪；DAB显色试剂盒，康为世纪；Image-ProPlus6.0专业图像分析软件，美国MediaCybernetics。
1.2方法
1.2.1造模、分组及用药将大鼠按体重随机分成两组：正常组10只，DM模型组50只。正常组喂食普通饲料；DM模型组喂食高糖高脂饲料，在高糖高脂饲料喂养4周后，以40mg/kg体重一次性空腹腹腔注射STZ（溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液，PH4.4），72h后监测血糖，以连续3次空腹血糖≥16.7mmol/L，尿糖阳性，尿微量白蛋白定性测量阳性者确定为DM模型制备成功。大鼠造模成功39只，随机分为模型组10只、西药对照组10只、泽黄颗粒组10只、拆方组9只。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗以及典型的DN改变等特点[1]。正常组用等量枸橼酸盐缓冲液腹腔注射。
西药对照组以盐酸二甲双胍片0.5g?kg-1?d-1灌胃，泽黄颗粒组以泽黄颗粒4.23g?kg-1?d-1灌胃，拆方组以活血利水组份1.08g?kg-1?d-1灌胃，正常组、模型组大鼠以等量生理盐水灌胃。实验期间，各组大鼠自由饮水。
1.2.2标本采集各组大鼠于实验第12周末置代谢笼内收集24h尿液，检测尿量、尿白蛋白；再将大鼠麻醉后心脏取血,检测BG、Scr、BUN、HbA1c、TG及TC指标。采集肾脏标本放入液氮冻存，以备行Western-blot检测。
1.2.3生化指标检测BG、TG、TC、BUN、HbA1c、Scr采用全自动生化分析仪测定，尿白蛋白采用化学发光法于全自动蛋白分析系统测定，根据尿量计算UAER。
1.2.4AQP1Western-blot检测用裂解液提取组织总蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，10%SDS-PAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭，AQP1多克隆抗体（1:200稀释）4℃孵育过夜，二抗（1:1000稀释）与膜37℃孵育1h。化学发光法发光成像。以β-actin作为内参照，来对目的蛋白表达水平进行半定量分析。
1.2.5统计学处理采用（x±s）表示计量资料，采用One-wayANOVA分析组间差异，组间两两比较用t检验。相关分析采用一元线性相关分析。以SPSS17.0Software进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1生化指标变化实验12周末，西药对照组、泽黄颗粒组和拆方组大鼠Scr、BUN、HbA1c、TG、TC、UAER与模型组相比差异均有统计学意义（P<0.01，P<0.05），但泽黄颗粒组大鼠HbA1c、TG下降水平无西药对照组明显；泽黄颗粒组和西药对照组大鼠BG与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01），但拆方组大鼠与模型组相比差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2肾组织AQP1Western-blotAQP1蛋白表达结果显示，与模型组相比，西药对照组、泽黄颗粒组和拆方组大鼠AQP1蛋白表达均明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。见图、表2。
3讨论
AQP是一个特异性跨膜转运水的蛋白质家族，Agre研究小组于1988年在人类红细胞和肾小管细胞膜首次发现了一个28kDa的疏水性跨膜蛋白，并将其命名为CHIP28[2]，1997年国际基因组将这种蛋白正式命名为水通道蛋白1（aquaporin1,AQP1）。作为第一个被发现的水通道蛋白，AQP1广泛分布于机体组织细胞中，尤其是与水分泌和吸收有关的上皮细胞和内皮细胞。在肾脏，AQP1高表达于肾单位的近曲小管和髓袢降支细段上皮细胞的顶质膜，介导原尿水重吸收和肾脏直小血管水转运[3]。AQP1发现于红细胞膜，对调节血液与红细胞内液水转运有重要意义，AQP1能提高红细胞变形能力，与“血瘀证”发生密切相关。糖尿病肾病多伴血瘀、水肿，本研究中DM大鼠AQP1合成减少，导致AQP1蛋白表达下调，从而红细胞变形能力与水重吸收降低，可见AQP1与血瘀和组织水肿有关。
中医学的“消渴”即现代医学的糖尿病，日久则出现“尿浊”、“水肿”、“胀满”、“关格”等一系列表现，与DN的临床症状十分相似。泽黄颗粒具有化瘀利水[4]功效。黄芪等共为君药，益气养阴、养血益精，“气足、津旺”、“气行、血和”，利于该制剂活血利水效应之发挥，同时也是本研究的益气组份；泽兰等为臣药，活血利水，因“血不利则为水”，活血以化瘀使瘀得除，血气运行通畅，则水肿得消，即是本研究的活血利水组份；佐使药与君药伍用，于补寓清之中，达“提壶揭盖”之意，与臣药伍用，活血利水而不伤阴，兼有育阴通便之功；并引药力入肺脾经。诸药合用，共凑“益气养阴、活血利水”功效。临床观察证实，该制剂能明显改善早期DN患者水肿症状，降低FPG、Bun、UAER、Scr、血液流变学等指标[5]。
本研究结果表明，泽黄颗粒能显著降低DM大鼠BG、HbA1c、BUN、Scr、UAER及TC，改善“三多一少”症状。而单纯用降糖西药（盐酸二甲双胍片）仅能降低BG、HbA1c，对改善DM状态下的肾脏血液循环效果不佳。本研究中泽黄颗粒可显著升高DM大鼠肾组织中的AQP1蛋白含量，因此可推测泽黄颗粒对DM大鼠肾脏的保护作用可能与上调AQP1的表达有关。但AQP1与血糖和UAER之间的关系以及泽黄颗粒的最佳效应组份有待进一步深入研究。
参考文献
[1]郭啸华，刘志红，李恒，等.高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点.中国糖尿病杂志，2002,10(5):290-294.
[2]DenkerBM,SmithBL,KuhajdaFP,etal.Identification,purification,andpartialcharacterizationofanovelMr28,000integralmembraneproteinfromerythrocytesandrenaltubules[J].JBiolChem,1988,263(30):15634-15642.
[3]PalloneTL,EdwardsA,TonghuiMa,etal.Requirementofaquaporin-1forNaCl-drivenwatertransportacrossdescendingvasarecta.JClinInvest,2000,105(2):215-222.
[4]李锋，李晓苗，王汉民，等.化瘀利水法治疗糖尿病肾病中医临床机制分析[J].中国中西医结合肾病杂志，2005,6(11):673.
[5]李锋，王汉民，行利，等.泽黄颗粒治疗糖尿病肾病38例临床观察[J].中国中医药信息杂志，2005,12(10):64-65.
基金项目：
军队中医专项（10ZYZ235）
通讯作者：
李锋，男，1963—，医学博士，陕西，第四军医大学第一附属医院（西京医院），中医药防治肝肾病（瘀水病证）机制与评价及新药研制，教授，主任。029-83215321邮箱：155272859@qq.com