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Cupriavidus gilardii CR3对铜胁迫的响应机制研究

2020-12-02阅读(883)

Cupriavidus gilardii CR3对铜胁迫的响应机制研究

论文摘要

重金属污染是全球关注的环境问题,往往带来严重的生态后果和健康威胁。铜是生物生长必需元素,但超过一定浓度就会产生毒性。铜毒性导致生物体酶失活、蛋白质氧化以及DNA损伤。为了避免铜的毒性,细菌进化了铜耐受机制来维持适当游离铜的细胞质环境。研究细菌的铜抗性响应机制可以为微生物更好应用于铜污染治理与修复提供理论支持。但目前细菌的铜抗性响应机制是分散的、片段式研究,缺乏系统整体的抗性网络研究。本论文通过对两株铜抗性细菌贪铜菌Cupriavidus gilardii CR3和弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii JPG1的铜抗性能力比选,选取一株抗性能力较好的优势菌株C.gilardii CR3,利用生物化学、全基因组学、高通量转录组学及生物信息学技术,分别研究铜胁迫下该细菌的生理生化响应及累积能力;测定菌株C.gilardii CR3的全基因序列信息并注释分析相关重金属抗性的基因;测序不同铜浓度胁迫下C.gilardii CR3的转录本,寻找显著差异表达基因,深入分析其生物学功能和可能参与的代谢通路,从物理、化学和分子生物学多角度解析C.gilardii CR3对铜抗性的内在响应机制,研究结果为生物修复重金属污染提供重要理论参考。主要结果如下:C.gilardii CR3对Cu最小抑制浓度为3 mM。当铜浓度为0.5 mM时,生长量和生长速率与对照组相似无显著变化（p>0.05）,暗示该浓度下其生长速率完全不受影响。当铜浓度增加到1.0 mM时,C.gilardii CR3的生长受到一定抑制。与之对比,C.freundii JPG1的最小抑制浓度为2 mM,C.freundii JPG1在0.5 mM下生长量和生长速率与对照组相比出现明显抑制。因此C.gilardii CR3比C.freundii JPG1表现出更强的铜抗性能力,后续研究选取C.gilardii CR3作为铜抗性机制研究对象。菌株C.gilardii CR3的全基因组测序分析结果显示C.gilardii CR3基因组包含2条完整没有任何内环洞的环状染色体,但不存在质粒。染色体1（CHR1）的大小为3,539,530 bp,染色体2（CHR2）为2,039,213 bp,通过全基因注释分析发现C.gilardii CR3包含cop和cus两大铜的抗性基因系统,共包含copSRABCD1、copQLFGJIDCBARS ompC copKBA1、copKHFIDCBARS1和cusFAB1四个抗铜基因簇,涉及35个抗铜基因。这些研究结果暗示了C.gilardii CR3包含丰富的抗铜基因,可能参与铜抗性响应。铜胁迫下不同转录本之间存在大量差异表达基因。0.5 mM铜浓度下,显著差异表达基因为310个;1.5 mM铜浓度下,显著差异表达基因达413个;暗示着铜浓度增加,细菌响应表达的基因更多。利用生物信息学分析显著差异表达基因的注释功能、GO功能和KEGG代谢通路富集,结果发现0.5 mM和1.5 mM铜胁迫下GO和KEGG富集结果相似,发现显著差异表达的基因主要富集在抗铜基因、硫代谢系统、Fe-S装配、ABC转运系统、蛋白质分泌系统、氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢多个代谢途径上。细菌对铜产生较高的去除能力,在胞内和胞外都有累积。铜离子在胞内积累达92%,胞内累积占主要作用。微观结构表征和官能团位点分析揭示了细菌表面铜胁迫的响应变化。结果表明,铜直接影响细菌的细胞活性和胞外聚合物分泌,低浓度（0.1 mM）刺激胞外聚合物分泌,但高浓度（1.5 mM）抑制分泌。官能团分析发现铜胁迫后肽键-O-C=O（羧基）基团、肽聚糖中C-O-C和C-O-P和酰胺I和酰胺II的吸收峰发现明显位移,这些官能团是细胞表面蛋白质、氨基酸和多糖的特征谱带,说明这些物质参与铜的响应,可能与铜发生结合。生物膜激光共聚焦观察铜胁迫刺激了,细菌表面蛋白的分泌,这是对细胞分泌系统上调表达的有力证明。值得注意,本研究首次发现Ⅲ型蛋白质分泌系统的显著响应,它可能刺激蛋白质分泌并通过通道蛋白输出到细胞壁表面,这也可以解释铜胁迫细胞表面聚合物的增多想象。综上,研究结果揭示了铜胁迫下细菌的多种抗性响应机制:细胞壁表面分泌大量聚合物,胞外聚合物官能团与铜离子发生静电等作用结合,阻止铜离子进入细胞内;铜离子通过ABC转运蛋白进入到细胞内,细胞内的铜抗性基因响应将过量铜离子外排降低毒性;硫代谢系统高度表达,其半胱氨酸和谷胱甘肽的生物合成产生重金属螯合分子,促进CR3对铜的解毒作用;Fe-S装配系统显著响应,因为Cu（I）可以夺取Fe离子位点与硫结合形成胞内累积可以达到保护细胞的目的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 重金属铜污染及其毒性
  •     1.1.1 重金属铜污染
  •     1.1.2 铜毒性
  •   1.2 细菌对铜的抗性机制研究进展
  •     1.2.1 细胞外隔离
  •     1.2.2 跨膜铜外排
  •     1.2.3 细胞内累积
  •     1.2.4 解毒机制
  •     1.2.5 铜抗性基因的调控机制
  •   1.3 细菌重金属抗性机制的研究方法
  •     1.3.1 重金属胁迫下细菌的微观形貌分析
  •     1.3.2 重金属胁迫细胞表面的结合位点分析
  •     1.3.3 重金属胁迫下细胞表面金属元素的化学分析
  •     1.3.4 基因组学在细菌对重金属抗性的应用
  •     1.3.5 转录组学在细菌对重金属抗性的应用
  •   1.4 典型革兰氏阴性菌的铜抗性分子机制
  •     1.4.1 E. coli对铜的抗性机制
  •     1.4.2 P. syringae对铜的抗性机制
  •     1.4.3 C. metallidurans对铜的抗性机制
  •     1.4.4 其它革兰氏阴性菌对铜的抗性机制
  •   1.5 论文研究内容、技术路线及创新点
  •     1.5.1 主要研究内容
  •     1.5.2 创新点
  •     1.5.3 技术路线
  • 第二章 两种典型重金属抗性细菌对铜毒性的抗性和去除能力
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与仪器
  •     2.2.1 实验材料
  •     2.2.2 实验仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 菌种及培养条件
  •     2.3.2 最小抑菌浓度（MIC）测定
  •     2.3.3 Cu（Ⅱ）浓度对菌株C. gilardii CR3和C. freundii JPG1生长的影响
  •     2.3.4 C. gilardii CR3对重金属Cu（Ⅱ）的去除实验
  •     2.3.5 数据分析
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 C. gilardii CR3和C. freundii JPG1最小抑菌浓度（MIC）
  •     2.4.2 Cu（Ⅱ）浓度对C. gilardii CR3和C. freundii JPG1生长的影响
  •     2.4.3 C. gilardii CR3和C. freundii JPG1对重金属铜的去除能力
  •   2.5 小结
  • 第三章 Cupriavidus gilardii CR3的全基因组测序及序列分析
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与仪器
  •     3.2.1 实验试剂
  •     3.2.2 实验仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 C. gilardii CR3菌株培养与纯化
  •     3.3.2 基因组DNA的提取与鉴定
  •     3.3.3 基因组测序与组装
  •     3.3.4 基因的注释与分析
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 C. gilardii CR3的基因组基本特征
  •     3.4.2 C. gilardii CR3与同属其它Cupriavidus菌株的进化关系分析
  •     3.4.3 C. gilardii CR3基因功能注释分析
  •     3.4.4 C. gilardii CR3基因组中的重金属抗性基因分析
  •   3.5 小结
  • 第四章 铜胁迫下Cupriavidus gilardii CR3的RNA-Seq分析及抗性响应机制
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料与仪器
  •     4.2.1 实验试剂
  •     4.2.2 实验仪器
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 细菌重金属铜胁迫实验
  •     4.3.2 总RNA提取及质量检测
  •     4.3.3 c DNA文库制备及Illumina Hi Seq 4000 测序
  •     4.3.4 转录组测序数据质量评估、质量剪切及统计
  •     4.3.5 转录组数据与参考基因组比对分析及质量评估
  •     4.3.6 表达差异分析
  •     4.3.7 GO功能富集分析
  •     4.3.8 KEGG通路富集分析
  •     4.3.9 实时荧光定量PCR验证
  •   4.4 结果
  •     4.4.1 铜胁迫下C. gilardii CR3的转录组特征
  •     4.4.2 铜胁迫下C. gilardii CR3的基因显著差异表达结果
  •     4.4.3 铜胁迫下C. gilardii CR3转录组样本相关性分析
  •     4.4.4 铜胁迫下C. gilardii CR3的差异基因的GO注释分析
  •     4.4.5 GO功能显著性富集分析
  •     4.4.6 KEGG代谢途径显著性富集分析
  •     4.4.7 差异表达基因的q RT-PCR验证
  •     4.4.8 铜胁迫下C. gilardii CR3响应的抗性基因及代谢途径
  •   4.5 讨论
  •     4.5.1 铜抗性相关基因
  •     4.5.2 硫代谢在抗铜机制中的作用
  •     4.5.3 Fe-S组装系统
  •     4.5.4 细胞分泌系统
  •   4.6 小结
  • 第五章 Cupriavidus gilardii CR3对铜胁迫响应机制的生理功能验证
  •   5.1 引言
  •   5.2 实验材料与仪器
  •     5.2.1 实验材料
  •     5.2.2 实验仪器
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 C. gilardii CR3对重金属Cu（Ⅱ）的吸附和累积实验
  •     5.3.2 菌株形态观察
  •     5.3.3 铜胁迫菌株前后的FTIR分析
  •     5.3.4 生物膜的培养及定量
  •     5.3.5 生物膜的显微镜表征
  •     5.3.6 生物膜的激光共聚焦（CLSM）表征
  •   5.4 结果与讨论
  •     5.4.1 C. gilardii CR3对重金属铜的胞外吸附和胞内累积研究
  •     5.4.2 Cu（Ⅱ）胁迫下C. gilardii CR3表面形态的响应
  •     5.4.3 Cu（Ⅱ）胁迫下C. gilardii CR3细胞壁官能团的响应
  •     5.4.4 Cu（Ⅱ）浓度对C. gilardii CR3生物膜生长的影响
  •     5.4.5 Cu（Ⅱ）胁迫下C. gilardii CR3表面分泌物的响应
  •     5.4.6 C. gilardii CR3在铜胁迫下的抗性响应机制
  •   5.5 小结
  • 第六章 结论与展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 后记
  • 在学期间公开发表论文

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 黄宁

    导师: 霍明昕,王小雨

    关键词: 铜胁迫,抗性响应机制,抗铜基因,差异表达基因

    来源: 东北师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 东北师范大学

    分类号: X172

    总页数: 133

    文件大小: 7056K

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