新型鸭呼肠孤病毒sigma C蛋白的原核表达与间接ELISA方法的建立

论文摘要

新型鸭呼肠孤病毒病是由新型鸭呼肠孤病毒引起的一种以肝、脾不规则坏死、出血为主要特征的鸭新发传染病,现已确定该病是由新型鸭呼肠孤病毒引起。为摸清新型鸭呼肠孤病毒病的流行情况,本研究以通过原核表达的sigma C蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了基于新型鸭呼肠孤病毒sigma C蛋白的间接ELISA方法,为新型鸭呼肠孤病毒病的血清学调查和疾病诊断提供技术支撑。1、新型鸭呼肠孤病毒sigma C蛋白的原核表达与纯化以新型鸭呼肠孤病毒（NDRV-SY株）基因组为模板,采用RT-PCR技术扩增sigma C基因,将扩增产物克隆到pET-32a（+）载体中,得到pET-32a-sigma C重组质粒载体,再将重组质粒载体pET-32a-sigma C转化到BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,获得分子量大小为55KDa的重组蛋白,获得的重组蛋白经过变性后,用带His标签的层析镍柱纯化蛋白,得到纯度为85%的sigma C蛋白。通过蛋白免疫印迹对sigma C蛋白的抗原特性进行初步分析,实验结果表明新型鸭呼肠孤病毒sigmaC蛋白具有良好的反应原性。2、新型呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立将纯化后的新型鸭呼肠孤病毒sigma C重组蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:sigmaC蛋白包被浓度为4.5ug/ml;血清稀释度为1:12800;酶标二抗稀释度为1:500;底物37℃显色10 min。该方法对鸭疫里默氏杆菌（RA）、H9亚型、鸭病毒性肝炎-1型（DHV-1）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）和鸭瘟病毒（DVE）阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;能检出1:12800稀释的NDRV阳性血清,具有良好的敏感性;批内重复试验与批间重复试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。对江苏等地免疫鸭群的169份血清样品进行检测,阳性样品检出率达到44.97%。综上所述,本研究建立的sigma C-ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性。研究结果为NDRV的抗体检测与流行病学调查提供一种新的血清学检测方法。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李涛

导师: 王桂军,张小飞

关键词: 新型鸭呼肠孤病毒,蛋白,原核表达,间接

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000348

总页数: 53

文件大小: 3153K

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标签：新型鸭呼肠孤病毒论文;  蛋白论文;  原核表达论文;  间接论文;