以PRRSV Nsp2-399重组蛋白为包被抗原建立PRRSV抗体ELISA检测方法

论文摘要

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp2-399重组蛋白,以及利用Nsp2-399蛋白建立PRRSV早期感染的ELISA检测方法,试验克隆、原核表达了PRRSV DY株（GenBank登录号为JN864948）Nsp2-399重组蛋白,同时利用该蛋白建立并优化了ELISA检测方法。结果表明:成功克隆表达了PRRSV Nsp2-399重组蛋白,并建立、优化了Nsp2-399 ELISA检测方法。优化后的Nsp2-399 ELISA的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,血清最佳稀释度为1∶40,最佳封闭液为10%胎牛血清,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4 000,最佳显色条件为37℃、15 min。猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒阳性血清样品用建立的Nsp2-399 ELISA方法进行检测,S/P值均小于0.21,ELISA方法特异性良好。用本试验建立的ELISA方法和IDEXX ELISA检测试剂盒分别检测血清样品125份,总符合率为94.40%。说明成功建立了Nsp2-399 ELISA抗体检测方法,可用于PRRSV的抗体检测。

论文目录

1 材料

1.1 样品来源

1.2 细胞、毒株、菌株及试验动物

1.3 主要试剂

2 方法

2.1 Nsp2-399引物的设计与合成

2.2 Nsp2-399 基因的扩增与原核表达质粒的构建

2.2.1 病毒RNA的提取及反转录

2.2.2 Nsp2-399 基因的扩增

2.2.3 原核表达质粒的构建

2.3 Nsp2-399基因的表达纯化与鉴定

2.4 Nsp2-399基因表达产物的Western-blot检测

2.5 ELISA检测方法的建立

2.5.1 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定

2.5.2 封闭液的选取

2.5.3 酶标二抗稀释倍数与TMB底物作用时间的确定

2.5.4 阴阳性临界值的确定

2.6 以Nsp2-399为包被抗原的 ELISA特异性试验

2.7 临床样品的检测

3 结果与分析

3.1 Nsp2-399 原核表达质粒的鉴定

3.2 Nsp2-399重组蛋白的表达纯化和鉴定

3.3 以Nsp2-399重组蛋白为包被抗原的ELISA检测方法的建立

3.4 Nsp2-399 ELISA的特异性试验

3.5 临床样品的检测

4 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 修晓娜,张松林,沈志强,刘磊,马永彪

关键词: 非结构蛋白,抗体检测,抗体

来源: 黑龙江畜牧兽医 2019年16期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业大学烟台研究院,山东省滨州畜牧兽医研究院,山东绿都生物科技有限公司

基金: 山东省重点研发计划项目(2016GNC110032),山东省自然科学基金项目(ZR201702230155),中国农业大学烟台研究院校内科研基金项目(YT201401)

分类号: S852.4

DOI: 10.13881/j.cnki.hljxmsy.2018.08.0245

页码: 76-80

总页数: 5

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以PRRSV Nsp2-399重组蛋白为包被抗原建立PRRSV抗体ELISA检测方法

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