一、A method for mouse oocyte enucleation assisted with zona pellucida dilating（论文文献综述）
陶瑞鑫,贾超,武恩在,李娟[1]（2021）在《手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究》文中进行了进一步梳理手工克隆（handmade cloning, HMC）是在传统克隆技术的基础上发展出的一种体细胞核移植技术,作为纯手工操作技术,每一步骤的操作细节都影响着HMC的效率及重构胚胎发育能力。本试验针对HMC生产克隆猪胚胎的3个关键步骤:透明带消化、手工切割去核与无透明带重构胚的体外培养展开研究。结果显示,猪卵母细胞透明带以3.3 mg/mL链酶蛋白酶适度消化（10～15 s）,在切割去核时卵母细胞死亡率显着低于透明带的过度（高于15 s）消化,死亡率分别为（3.22±1.08）%和（31.45±2.10）%;当透明带消化时间不足（少于10 s）,不能被切割去核的猪卵母细胞显着升高,不可切割率分别为（18.25±4.22）%和（0.57±0.40）%。另外,"铡刀式"操作更适用于手工切割去核,其操作要点对成功获得无核半卵及其胞质含量非常重要。HMC无透明带重构胚体外培养时,孔深约250μm、孔径约300μm的微孔技术（well of wells, WOWs）有利于克隆胚胎发育。本研究优化了HMC操作的关键步骤,为提高生产克隆猪胚胎效率奠定了基础。
康宇[2]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究说明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
王启航[3]（2020）在《不同浓度CB对小鼠纺锤体移植后重构卵的细胞骨架及囊胚发育的影响》文中研究说明目的:线粒体DNA疾病是致病性线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mt DNA）突变引起的线粒体功能障碍性疾病。线粒体替代治疗可以预防致病性mt DNA向子代的传递。虽然临床已有通过核质置换技术出生的婴儿,但是实验过程中获得的大多数人囊胚质量相对较差,可用于移植的人囊胚率极低。因此,目前阶段提升核质置换技术效率和重构人囊胚的质量,成为我们研究的重点和难点。本研究做小鼠卵纺锤体移植时,使用不同浓度的细胞松弛素B（Cytochalasin B,CB）处理,先比较电融合和仙台病毒（HVJ-E）融合的融合效率,再检测重构小鼠卵的细胞骨架和统计重构小鼠胚胎发育情况,筛选出小鼠卵纺锤体移植的最适CB浓度,为提高人类纺锤体移植技术提供可靠的实验数据。背景:本研究是在国家重点研发计划“线粒体遗传疾病治疗的辅助生殖新技术研究”中的课题3“线粒体遗传病的筛查及核质置换技术的临床转化应用研究”的基础上进行,前期赴上海交大和中科院神经所进行了核质置换技术的培训,熟练掌握了该技术的各种操作,在对操作技术的研究中明确了纺锤体移植和应用病毒融合的方法的效率最高,而这种方法的难点是CB浓度的选择,因此,针对此问题进行了更深一步的研究。方法:选择同种品系C57BL/6小鼠卵母细胞做纺锤体移植,先比较电融合和HVJ-E融合的效率,再分别使用3.5μg/m L CB（A组）、7.5μg/m L CB（B组）、10μg/m L CB（C组）、12.5μg/m L CB（D组）四个不同浓度的CB处理纺锤体移植过程,包括去核（在本研究中每6-8枚卵为一组,操作时间控制在30min以内。将准备好的卵放在含有不同浓度CB的工作液中孵育5min。用Holding针固定小鼠卵位置,把纺锤体摆成梭形,放在12-1点钟位置,再用去核针将纺锤体-染色体复合物取出）、注核（将取出的核转移到稀释1/20的仙台病毒工作液中,浸泡10-15s,然后注入到另一个去核的卵中,在将注核和去核的胞质进行挤压,利于融合）1.比较不同浓度仙台病毒的融合效率;2.统计小鼠纺锤体移植效率,包括去核率、注核率、融合率;3.统计正常小鼠卵和重构小鼠卵的受精率、卵裂率、囊胚率、孵化率;4.对各组小鼠囊胚行免疫荧光染色检测,在荧光显微镜下计数细胞总数;5.对各组重构小鼠卵的细胞骨架行免疫荧光染色检测,在激光共聚焦扫描显微镜下观察重构小鼠卵的微丝、微管恢复情况。结果:1.A组、B组的重构小鼠卵做仙台病毒融合,稀释1/20倍比稀释1/10倍的HVJ-E融合效率高;2.A组、B组、D组的重构小鼠卵与C组的重构小鼠卵相比,纺锤体移植效率无差异（P>0.05）;3.A组、B组、C组、D组的融合小鼠卵与对照组的正常小鼠卵相比,受精率、卵裂率,无显着差异（P>0.05）,D组囊胚率、孵化率显着降低（P<0.05）;4.A组、B组、D组的重构小鼠囊胚与对照组的正常小鼠囊胚相比,囊胚细胞总数均显着降低（P<0.05）;C组的重构小鼠囊胚与对照组的正常小鼠囊胚相比,囊胚细胞总数无显着差异（P>0.05）;5.A组、B组、C组、D组重构小鼠卵母细胞融合后,0h、1h、2h的微丝恢复比率基本无差异;6.A组、B组、D组重构小鼠卵的微丝呈现不均匀分布,C组重构小鼠卵的微丝呈现均匀分布。结论:1.小鼠卵纺锤体移植,稀释1/20倍的HVJ-E融合效率好;2.本研究选择的CB浓度不影响重构小鼠卵的纺锤体移植效率、受精率、卵裂率,但影响重构小鼠卵的囊胚率、孵化率及囊胚总细胞数;3.10μg/m L CB浓度为小鼠卵纺锤体移植过程的最适浓度;4.本研究选择的CB浓度不影响重构小鼠卵的微丝恢复比率,但影响重构小鼠卵的微丝恢复状态。
张志鹏[4]（2019）在《马胚胎移植及克隆胚体外构建技术》文中研究表明我国是世界马业大国,但并非马业强国。马存栏量虽大,却在现代马术的国际竞技场上未见身影。现代马术用马的匮乏,成为我国马产业发展的重要制约因素。胚胎移植技术已成熟应用于牛、羊等家畜的繁育生产,但马胚胎移植的各环节技术尚不完全成熟,相关研究与应用与马产业的发展不相适应。因此,本研究针对我国马业发展的技术需求,开展其发情鉴定、人工授精、非手术法胚胎采集和胚胎移植等马胚胎移植关键生物技术的研究。在此基础上,开展了卵巢的运输、卵母细胞采集、卵母细胞体外成熟、体细胞系的建立、细胞融合、体细胞核移植等马克隆胚胎体外构建技术的研究,其研究结果如下:1、母马发情的准确鉴别。摸索了 3种发情方法,发现B超检查法鉴定母马发情的成功率达到100%,显着高于外部观察法（47.3%）和直肠触摸法（85%）,P<0.05。2、母马发情的有效诱导。建立了母马发情和同期发情的有效诱导方法,母马排卵第5 d,肌肉注射0.2 mg PGF2α后的发情率为63.2%,高于肌肉注射1500 IU PMSG和自然发情的比例（47.2%、0）,P<0.05。有效的诱导6个品种马的发情,发情周期显着缩短,分别为 11.7±3.1、12.2±2.8、11.5±1.9、12.8±2.1、11.8±2.5 和 12.7±2.3 d。注射0.2 mg黄体酮和PGF2α方法母马的同期发情率为76.4±2.6%,显着高于单纯注射黄体酮组的62.8±2.1%和对照组的16.7± 1.2%,P<0.05。3、母马排卵的有效调控。建立了母马排卵的有效调控方法,关键在卵泡发育、激素类型和剂量的选择。当卵泡直径≥30 mm,静脉注射1500 IU hCG,48 h内的排卵比例为84.3%,显着高于FSH+LH组（31.6%）和对照组（15.8%）（P<0.05）,6 个品种马分别在 41.2±2.3、43.9±2.7、42.3±1.6、39.7±3.1、40.9±2.9 和 39.8±2.4 h 时排卵。发现左侧卵巢的排卵率比右侧的高,59.5%排卵发生在左侧,高于右侧的40.5%（P<0.05）。4、马精液的保存与授精。建立了马精液的常温、低温和超低温保存的方法,常温（22℃）保存20 min,HN-SD（本实验室制备）和INRA96（IMV商品）组的精子活率分别为65.6±2.3%和68.6±1.2%,显着高于脱脂牛奶组的53.5±3.2%（P<0.05）。低温（0～4℃）保存24 h,HN-SD和INRA96组的精子活率分别是65.5±2.3%和67.7±2.1%,高于脱脂牛奶组的49.5±3.4%（P<0.05）。液氮（-196℃）保存精液1d后,INRA96组的精子活率为44.3±2.2%,HN-SD组为36.2±2.3%,高于脱脂牛奶组的21.3±1.8%（P<0.05）。摸索出了最适的输精部位,发现输精的不同部位对母马受胎率的影响不同,子宫角输精的母马情期受胎率为85.4%,显着高于子宫输精（78.4%）和自然交配（25%）（P<0.05）。保鲜精液的情期受胎率为61.1%,低于鲜精的84%,但高于冷冻精液的40%（P<0.05）。5、马胚胎的非手术法采集。建立了马胚胎的非手术采集方法,选取乳酸钠林格注射液作为冲胚液,在马受孕后5～8 d进行冲胚,采集的时间是关键环节。本研究胚胎采集成功率为72.8%。不同时间采集胚胎的成功率不同,5月份的胚胎采集成功率最高,为88.9%,10月份成功率最低,为42.9%。桑椹胚采集成功率为70.6%。6、马胚胎的非手术法移植。建立了马胚胎的非手术移植方法,选择排卵后4～7 d的受体马,选取IMV胚胎保存液进行子宫体移植。试验组HN-EHM和IMV胚胎保存液的胚胎移植成功率分别为80%和83.3%,高于乳酸钠林格注射液试验组（75%）。胚胎低温保存24 h后,移植成功率为60%。桑椹胚移植成功率为90.9%。7、马卵巢的运输。本试验获得马卵巢体外运输过程中保存液的合适温度,夏季为33～37℃,冬季为30～35℃。8、马卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的采集。抽吸法+切割法的采集成功率最高,为73.3%,高于切割法（64.6%）和抽吸法（54.8%）的成功率（P<0.05）。发现繁殖季节的卵巢中大、中、小卵泡的比例分别是20.9%、51%和28.1%,非繁殖季节的比例分别是3.1%、51.9%和45%。9、马卵母细胞的体外成熟。摸索了马卵母细胞体外培养成熟的条件,5%CO2、37℃、饱和湿度培养,紧凑型（Cp）卵母细胞培养32～36 h,扩展型（Ex）培养24～28 h。结果发现不同类型的COC其成熟率不同,不同繁殖季节,卵母细胞的成熟率也不同。繁殖季节,马扩展型（Ex）的成熟率为58.6%,高于紧凑型（Cp）的成熟率36.5%（P<0.05）,非繁殖季节,成熟率分别为29.1%和49.2%（P<0.05）。添加ActA能提高紧凑型（Cp）卵母细胞的成熟率,在繁殖、非繁殖季节卵母细胞成熟率分别达到 47.3%和 42.2%。10、马卵母细胞的孤雌激活。摸索了马卵母细胞孤雌激活的条件,本试验选取离子霉素进行孤雌激活,结果发现ActA促进马Cp型卵母细胞孤雌激活胚胎的发育,2-细胞（57.9%）、4-细胞（36.8%）的比例分别高于对照组（P<0.05）。不同的卵母细胞类型对卵母细胞孤雌激活后胚胎的发育没有影响。在马的繁殖季节,孤雌激活胚胎发育到2-细胞期、4-细胞、8-细胞和桑椹胚的比例分别是50%（42/80）、35.7%（30/84）、13.1%（11/84）和6%（5/84）,高于非繁殖季节同时期的比例,（P<0.05）。在马的非繁殖季节,孤雌激活的胚胎与颗粒细胞共培养后,发育到2-细胞、4-细胞的比例分别为41.7%和25%,显着高于对照组的比例（P<0.05）,获得1枚桑椹胚（2.8%）。11、马体细胞克隆胚的构建及体外培养。摸索了不同融合电压对重构胚胎融合率的影响,克隆胚胎置于38.5℃、5%C02、饱和湿度培养箱中培养,结果发现采用140 V,20μs,融合2次,重构胚胎融合成功率达到72%。马驹成纤维细胞的融合率、2-细胞,4-8细胞和桑椹胚的比例分别为77.4%、41.5%、33.9%和15.1%,高于成年马体细胞的相应比率（P<0.05）。用非手术法将构建好的8枚桑椹胚移植到受体马的子宫体中,没有获得克隆马。通过上述研究,本研究获得成熟的马胚胎移植技术体系,为实现规范化、商业化、市场化的繁殖现代马术用马提供的技术方案。在此基础上,研究体外诱导成熟的马卵母细胞构建克隆胚胎的技术,为我国突破马克隆技术奠定基础。
李昊[5]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究说明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
李亚娣[6]（2017）在《面向微创核移植显微操作的目标识别与追踪算法研究》文中指出细胞核移植作为动物克隆的核心技术,在制药、医学、濒危动物保护等领域得到了广泛应用。当前依赖实验人员手动操作的方式存在着效率低、操作精度不高及成功率低等缺点。本文以提高核移植操作精度和成功率为主要目的,探索一种面向核移植显微操作的目标识别与追踪算法,以实现高精密、微创化的核移植操作。首先,通过阅读大量文献对显微操作系统、核移植操作及操作中视觉检测与识别技术进行了深入了解,分析了目前应用于核移植操作的先进技术手段及核移植中存在的细胞损伤大、操作精度低等突出问题,进而明确了核移植显微操作所亟待解决的问题。其次,针对核移植中细胞的损伤问题,在对核移植操作过程进行分析的基础上,对本文微损伤破膜的核移植操作系统进行了介绍;根据核移植的操作需求,对操作系统中显微视觉系统的功能进行了分析;进而根据视觉系统所要实现的功能,建立了集偏振光成像系统与倒置显微成像系统于一体的视觉系统。然后,对核移植操作中的显微目标识别方法进行了研究。为辅助卵母细胞的筛选,提出了一种卵母细胞透明带厚度自动测量方法;根据核移植操作对显微目标定位的要求,提出了卵母细胞、核物质、体细胞的精确定位算法,并对多幅图像进行了实验,其中卵母细胞定位成功率可达100%,核物质的定位成功率达到了 96%。接着,针对去核操作中注射针的实时追踪方法进行了研究。在对模板匹配法进行实验分析的基础上,提出了一种基于ORB算法的注射针实时追踪方法,并利用常用注射针（平口针、尖口针）从速度和精度两方面对追踪算法进行了实验验证,结果表明算法处理速度达到22帧/s,检测偏差在1um左右。最后,利用核移植操作系统,对本文提出的目标识别与追踪方法进行了实验研究。对不同位姿下同一卵母细胞及不同卵母细胞进行了透明带厚度测量,获得的透明带厚度值与经验值相近。并从卵母细胞辅助筛选、细胞固定和位姿调整、卵母细胞去核和注核几个方面对提出的透明带厚度测量算法、显微目标定位算法、注射针追踪算法进行了应用和探究。
高萍[7]（2015）在《面向核移植的卵母细胞显隐性结构图像融合技术研究》文中研究表明细胞核移植是实现体细胞克隆的主要手段,具有基因传染率高、后代性状稳定等优点,但胚胎发育率低、早期胚胎死亡率高,获取一例活体核移植后代需要消耗巨大的人力、物力和财力,核移植的多种侵入式辅助技术对卵母细胞致损严重,且卵母细胞的筛选依赖经验,缺乏定量的检测手段,无法保证细胞活性。偏振光显微技术开启了非侵入式细胞核定位的新纪元,但仅借助偏振光系统无法获取研究细胞发育情况所需的完整信息。卵母细胞内的隐性结构仅在偏振光下成像清晰,而显性结构在生物倒置显微镜下成像效果良好。基于细胞隐性结构的双折射特性,采集Abrio偏振光显微镜下卵母细胞“隐性”结构信息,Nikon Ti-E生物倒置显微镜下卵母细胞的“显性”结构信息,以图像融合评价体系为指导,在图像精确配准基础上实现卵母细胞“显隐性”结构信息融合;并提取纺锤体的位置信息,实现细胞核的初步定位;结合显隐性结构特征提取ZP边缘,多点测量计算透明带厚度ZPT,用于检测卵母细胞发育状况。本文提出的面向高精密核移植导航的倒置显微图像与偏振光图像融合算法,实现卵母细胞显隐性结构清晰呈现,但仅将核移植操作从侵入式辅助技术中解放出来,其过程仍需训练有素的人员操控,所以本文研究了基于偏振光成像的细胞核定位算法,旨在实现核移植中细胞核的良好定位;卵母细胞的发育情况与透明带厚度息息相关,卵母细胞的ZPT是其发育状况的检测指标。文章主要研究面向高精密核移植导航的倒置显微图像与偏振光图像融合技术,可分为如下几部分内容:首先,阐述核移植操作辅助技术的研究现状,确定本课题的研究目的和研究内容;然后,介绍细胞组织结构观测平台——倒置光学显微镜和偏振光显微镜的成像原理,以及细胞显隐性结构特征与成像机理;其次,分析卵母细胞成像特征,实现两系统图像配准;接着,以图像融合评价体系为指导,研究适用于小鼠卵母细胞的像素级图像融合方案;再次,介绍Oocyte成像平台:Nikon Ti-E生物倒置显微镜、Abrio偏振光显微镜,阐述卵母细胞显隐性结构融合算法、分析其实验结果;最后介绍细胞核初步定位算法和透明带厚度ZPT测量算法,并进行细胞核定位和ZPT测量实验研究,分析实验结果。通过研究实验结果和相关数据,得出本文提出的面向高精密核移植导航的倒置显微图像与偏振光图像融合算法有效,可清晰呈现核移植操作中卵母细胞结构特征,实现细胞核的初步定位,ZPT测量值可检测Oocyte的发育状况。
贾洪响,马斌斌,魏强,赵晓娥,孟永芳,谷建锋,马保华[8]（2014）在《小鼠卵母细胞去核方法的改进》文中研究指明为摸索一种简单有效的小鼠（Mus musculus）卵母细胞去核方法,本研究对压电脉冲装置（Piezo）辅助显微操作条件下的小鼠中期Ⅱ（metaphaseⅡ,MⅡ）卵母细胞去核方法进行了改进,比较了改进的去核方法和常规去核方法,在无蔗糖或含蔗糖去核操作液中的去核效果及核移植重构胚的后续发育能力;用改进的去核法在无蔗糖的去核操作液中对卵母细胞进行去核,比较卵母细胞去核操作液及核移植操作液中添加不同浓度胎牛血清（FBS）时核移植重构胚的后续发育能力。结果显示,MⅡ期卵母细胞在无蔗糖和含3%蔗糖的去核操作液中通过调整显微镜物镜距离显示MⅡ期纺锤体区域的方法进行显核,显核率分别为98.4%（184/187）和98.7%（153/155）（P>0.05）。在无蔗糖或含蔗糖的去核操作液中,用改进的去核法,即去核针穿过透明带后,紧贴MⅡ期纺锤体区域的质膜,施加负压将MⅡ期纺锤体区域吸住并将其直接拉出卵母细胞,去核率分别为84.6%和88.2%;用常规去核法在这2种去核操作液中去核,去核率分别为83.1%和88.6%,各组之间差异均不显着（P>0.05）;用改进的去核法比常规去核法吸出的胞质少。用改进的去核方法在无蔗糖的去核操作液中去核后,构建的核移植重构胚发育到8-细胞、桑椹胚和囊胚的比率最高,桑椹胚发育率（16.3%）和囊胚发育率（5.8%）显着高于用该法在含蔗糖的去核操作液中去核组（5.1%和0）。用常规去核法在无蔗糖操作液及含蔗糖操作液中去核后,核移植重构胚的桑椹胚发育率分别为3.3%和1.2%（P<0.05）,且均未获得囊胚发育。去核操作液和核移植操作液中添加20%FBS时,重构胚囊胚发育率显着高于添加10%FBS组（10.9%对4.9%）（P<0.05）,表明用改进的去核方法在添加20%胎牛血清（FBS）的操作液中进行去核及核移植操作是可行的,而且对重构胚后续发育的支持能力较好。本研究为进一步提高小鼠体细胞核移植效率做出了有益的探索。
王士勇[9]（2014）在《梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究》文中认为为了探索梅花鹿-牛异种体细胞核移植技术，为梅花鹿胚胎工程研究奠定技术基础，本论文对其供核细胞的培养和冷冻保存、受体卵母细胞的体外成熟、显微操作、重组胚胎外培养等技术环节进行了探索研究，并在水貂、蓝狐和貉等毛皮动物上验证了建立的异种体细胞核移植技术体系。主要内容如下：（1）梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞（Ear Skin Fibriblasts，ESF）经组织块法原代培养，利用酶消化时间差与贴壁时间差法处理3～5次纯化，结果显示细胞生长特点为贴壁生长、呈梭形、具伪足，F5代细胞生长曲线呈“潜伏期-对数生长期-停滞期”的模式。DMSO作为抗冻保护剂时，梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF解冻复苏后复苏率分别为89.64%、92.44、91.24和91.04，显着高于甘油作为抗冻保护剂。结论：梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF具有典型的皮肤成纤维细胞生长特点，通过酶消化时间与贴壁时间差的方法对其纯化可行，冷冻保存时可采用10%DMSO作为抗冻保护剂。（2）牛卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）经22h体外成熟培养之后，LH+FSH和PMSG+HCG组成熟率分别为79.1%和75.2%，差异不显着，但是两组成熟率均显着高于对照组；牛COCs经（Brilliant Cresyl Blue, BCB）染色染色90min后卵母细胞着色率为68.1%，显着高于30、60min组，辨识难度为“中”；牛COCs经39μM的BCB染色后，着色率为64.5%，显着高于13μM组的29.3%；BCB+组和BCB-组的成熟率与对照组比较差异均不显着；在体外成熟培养液中添加50ng/mL表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）后培养牛的COCs，22h后成熟率为77.4%，显着高于0、10、20ng/mL组。结论：在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加国产激素10IU/mL PMSG、15IU/mL HCG和50ng/mL的EGF能显着提高其体外成熟率；BCB法筛选优质卵母细胞在本试验体系下不适用。（3）牛COCs经体外成熟20、21、22h后，0.4μg/mL脱羰秋水仙碱（Demecolcine，DEME）诱导显核率分别为61.0%、65.3%和66.7%，差异不显着；经0.4μg/mL DEME处理60、120min后，显核率分别为70.0%和71.9%，显着高于30min组；经0.5μg/mL DEME处理60min之后，显核率为78.9%，显着高于0.3、0.4μg/mL组；DEME辅助法的去核率为100.0%，显着高于挤压法和盲吸法，三种去核方法的去核时间差异不显着；带下注核与全细胞胞质内注核的成功率分别为100%和94.8%，注核时间分别为31.0s和35.1s，与破膜后胞质内注核比较差异均显着；一步操作和两步操作的相同注核方法处理组之间在激活率、卵裂率和囊胚率方面均无显着差异；0、0.25、0.50和1.00μM白藜芦醇对梅花鹿-牛ISCNT胚胎卵裂率没有显着影响，0.50和1.00μM组囊胚发育率分别为38.0%和36.7%，显着高于0、0.25μM组；梅花鹿-牛ISCNT胚胎用体细胞共培养时，水貂ESF组的卵裂率为55.7%，显着高于对照组，牛卵丘细胞组囊胚发育率为59.4%，显着高于对照组和其他两组。结论：梅花鹿-牛ISCNT研究可采用下面的技术程序：牛卵母细胞经IVM20～22h后，用0.5μg/mL DEME处理60min诱导显核，Pizeo辅助破膜胞质内注核的一步显微操作核移植，激活后的重组胚用牛卵丘细胞共培养。（4）采用Pizeo辅助全细胞胞质内注核的方法构建毛皮动物-牛ISCNT胚胎时，水貂、蓝狐和貉ESF作为供核细胞，在注核成功率、卵裂率和囊胚率之间差异不显着；牛卵丘细胞作为共培养细胞时，水貂、蓝狐、貉-牛ISCNT胚胎的囊胚率分别为43.6%、40.1%和42.1%，均显着高于对照组。结论：梅花鹿-牛ISCNT技术程序同样适用于水貂、蓝狐和貉等三种毛皮动物与牛的ISCNT。
许贻索[10]（2014）在《小鼠卵母细胞的孤雌激活及体细胞核移植方法的研究》文中认为体细胞核移植技术是生物工程技术发展中的一个重要的里程碑,该技术在动物育种,生产转基因动物、建立动物模型、提供人造器官、保护珍稀濒危动物及发育生物学的研究等方面发挥重要作用。小鼠作为一种广泛使用的实验模型动物,具有其他生物不可比拟的优势,因此利用小鼠进行体细胞核移植技术的基础研究具有十分重要的理论及现实意义。但是目前小鼠的体细胞核移植效率依然很低,核移植过程中任何一个环节都对整个实验的成败产生重要影响,因此对小鼠体细胞核移植过程的各环节进行优化,对提高核移植成功率具有非常重要的意义。本实验主要从小鼠卵母细胞的孤雌激活、体细胞核移植方法以及小鼠胚胎的输卵管移植三个环节进行研究,旨在初步建立小鼠体细胞核移植体系,提高小鼠体细胞核移植效率,为本实验室的其他哺乳动物的体细胞核移植奠定一定的技术基础。实验一小鼠卵母细胞孤雌激活方法的研究1.实验选用电刺激联合细胞松弛素B（CytochalasinB, CB）的方法对卵龄为18h的B6D2F1小鼠卵母细胞进行激活,探讨电场强度、脉冲宽度、脉冲次数对卵母细胞激活效果的影响,以卵母细胞激活率、激活后培养的卵裂率、囊胚形成率来判断激活效果。实验发现,以2.0kV/cm的电场强度,801μS的脉冲宽度,3个脉冲次数刺激小鼠卵母细胞能够得到较高的激活率（80.1%）、卵裂率（53.6%）及囊胚形成率（23.2%）。2.在电激活最佳激活参数的基础上,与10mmol/LSrCl2+CB激活卵龄为18h的卵母细胞4h的激活结果进行比较。研究发现Sr2+激活的卵母细胞激活率为82.5%、卵裂率为56.1%、囊胚形成率为27.8%,均高于电激活,且激活后的卵母细胞状态较好,后续发育能力较强,得到的卵裂胚胎及囊胚质量较好。因此10mmol/LSrCl2+CB激活卵龄为18h的卵母细胞4h是理想的卵母细胞的孤雌激活方法。实验二小鼠体细胞核移植方法的研究1.去核方法的比较：选用盲吸去核法、蔗糖辅助去核法、Hoechest33342染色去核法,在Piezo介导下分别对MII期卵母细胞进行去核,实验发现蔗糖辅助去核法对卵母细胞进行去核可以得到较高的去核效率（82.7%）,高于盲吸法（49.0%）和Hoechest33342染色去核法（80.4%）,且该法示核清楚,吸取的细胞质较少,对卵母细胞的损伤较小,操作简便,减少了去核操作时间。因此蔗糖辅助去核法是较好的去核方法。2.细胞松弛素B（CytochalasinB, CB）浓度对去核效果的影响：实验将细胞核清晰可见的卵母细胞放入含有CB浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的去核操作液中去核,以去核率来检测去核效果。研究发现在CB浓度为10μg/ml时,去核效果较好（去核率：82.7%）,显着高于5μg/ml和20μg/ml浓度下的去核率（去核率分别为64.2%、51.3%）。3.重构胚构建方法的比较：本实验以颗粒细胞作为供核细胞,以胞质内注射法、卵周隙注射法两种方法对去核卵母细胞进行注核,比较两种方法的重构胚率、卵裂率。研究发现胞质内注射得到的重构胚率明显高于卵周隙注射（73.6%vs32.3%）,且重构胚后续发育能力优于卵周隙注射,因此卵胞质注射优于卵周隙注射。实验三小鼠胚胎输卵管移植技术的建立1.不同胚龄的胚胎对输卵管移植的影响：实验选用B6D2F1小鼠1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、8-细胞胚胎进行输卵管移植,比较代孕母鼠妊娠率、产仔率,确定最适合输卵管移植的胚胎发育期。实验表明,植入2-细胞胚胎的代孕母鼠的妊娠率为60.0%、产仔率为29.0%,显着高于1-细胞胚胎（妊娠率：33.3%；产仔率：13.6%）和8-细胞胚胎（妊娠率：20.0%；产仔率：7.3%）。2.两种输卵管移植部位的比较：实验用2-细胞胚胎分别进行输卵管伞开口处移植和输卵管壁切口移植,研究发现通过输卵管壁切口移植的代孕母鼠的妊娠率和产仔率高于输卵管伞部移植（60.0%vs53.3%、29.0%vs26.3%）,且前者方法简便,对输卵管损伤较小,是较为理想的胚胎移植方法。综上所述,用2-细胞胚胎对代孕母鼠进行输卵管壁切口移植,是理想的输卵管移植方法。
二、A method for mouse oocyte enucleation assisted with zona pellucida dilating（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、A method for mouse oocyte enucleation assisted with zona pellucida dilating（论文提纲范文）
（1）手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵母细胞的采集及体外成熟 |
| 1.2 供体细胞准备 |
| 1.3 消化透明带 |
| 1.4 卵母细胞切割去核 |
| 1.5 体细胞融合与电激活 |
| 1.6 重构胚胎化学激活与体外培养 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ZP消化时间对切割去核的影响 |
| 2.3 手工克隆刀切割去核 |
| 2.4 WOW的制作及大小 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（3）不同浓度CB对小鼠纺锤体移植后重构卵的细胞骨架及囊胚发育的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 具体操作过程 |
| 3. 检测方法 |
| 4. 统计学方法 |
| 结果 |
| 1.比较不同浓度仙台病毒(HVJ-E)的融合效率 |
| 2.比较使用不同浓度CB重构小鼠卵的纺锤体移植效率 |
| 3.比较正常小鼠卵和不同浓度CB重构小鼠卵体外受精后的胚胎发育情况 |
| 4.不同浓度CB处理的重构小鼠囊胚细胞计数 |
| 5.免疫荧光染色技术比较重构小鼠卵的细胞骨架恢复情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 核质置换技术对细胞骨架影响的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）马胚胎移植及克隆胚体外构建技术（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 国外马业现状 |
| 1.1.2 我国马业现状 |
| 1.1.3 存在的主要问题 |
| 1.2 马的生殖生理特点 |
| 1.2.1 生殖活动 |
| 1.2.2 生殖行为 |
| 1.2.3 生殖激素的调节 |
| 1.3 国内外研究进展 |
| 1.3.1 马胚胎移植技术 |
| 1.3.2 精液冷冻与授精 |
| 1.3.3 胚胎冷冻与移植 |
| 1.3.4 体外受精(IVF) |
| 1.3.5 单精子卵胞浆显微注射技术(ICSI) |
| 1.3.6 卵母细胞成熟 |
| 1.3.7 马的体细胞核移植(SCNT) |
| 1.4 本研究的目的意义及内容 |
| 1.4.1 研究目的意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 试验一: 马胚胎移植技术的研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 动物饲养 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 试验设备 |
| 2.1.5 试剂制备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 种马的选择 |
| 2.2.2 母马发情鉴别 |
| 2.2.3 母马发情调控 |
| 2.2.4 排卵调控 |
| 2.2.5 精液品质检测 |
| 2.2.6 精液的保存 |
| 2.2.7 人工授精 |
| 2.2.8 非手术法冲胚 |
| 2.2.9 胚胎的鉴定与保存 |
| 2.2.10 胚胎移植 |
| 2.2.11 妊娠诊断 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 母马的发情检查结果 |
| 2.3.2 不同激素诱导母马发情的试验结果 |
| 2.3.3 不同激素调控马排卵的比例 |
| 2.3.4 不同精液稀释液对精液品质的影响 |
| 2.3.5 不同输精方式对母马受孕率的影响 |
| 2.3.6 不同冲胚液对胚胎收集效率的对比与应用 |
| 2.3.7 不同胚胎移植方法的成功率 |
| 2.3.8 桑椹胚的收集与移植结果 |
| 2.3.9 不同妊娠诊断方法的比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 种马的选择 |
| 2.4.2 发情与卵泡生长的关系 |
| 2.4.3 超数排卵 |
| 2.4.4 采精与授精 |
| 2.4.5 马的胚胎移植 |
| 2.5 小结 |
| 3 马克隆胚胎体外构建技术的研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验对象 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 设备 |
| 3.1.4 试剂制备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 卵巢的采集 |
| 3.2.2 马卵巢卵母细胞的收集 |
| 3.2.3 卵母细胞体外成熟 |
| 3.2.4 成纤维细胞培养 |
| 3.2.5 孤雌激活 |
| 3.2.6 体细胞核移植 |
| 3.2.7 构建胚胎的移植 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同季节卵巢的最佳运输温度 |
| 3.3.2 马、驴卵巢、COCs形态的对比 |
| 3.3.3 COCs回收率 |
| 3.3.4 卵母细胞体外成熟 |
| 3.3.5 不同年龄马的成纤维细胞系的建立 |
| 3.3.6 孤雌激活胚胎的成功率 |
| 3.3.7 马体细胞核移植的试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 卵巢体外运输 |
| 3.4.2 母体的营养情况对卵母细胞成熟率的影响 |
| 3.4.3 ActA对卵母细胞的作用 |
| 3.4.4 体细胞系的建立 |
| 3.4.5 体细胞核移植 |
| 3.5 小结 |
| 4 全文总结 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 本研究创新点 |
| 4.3 有待进一步研究的内容 |
| 4.3.1 胚胎移植技术的推广 |
| 4.3.2 马卵母细胞体外成熟技术 |
| 4.3.3 克隆胚胎的构建与体外发育 |
| 附录 |
| 1 胚胎移植马的选择标准(LH-201-2018) |
| 2 胚胎移植马选择结果 |
| 3 马人工授精技术规程(LH-202-2018) |
| 4 马胚胎移植技术规程(LH-203-2018) |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）面向微创核移植显微操作的目标识别与追踪算法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题研究的背景及意义 |
| 1.2 课题国内外研究现状 |
| 1.2.1 显微操作系统的研究现状 |
| 1.2.2 核移植操作的研究现状 |
| 1.2.3 核移植操作中视觉检测与识别技术的研究现状 |
| 1.2.4 国内外研究现状分析 |
| 1.3 课题来源及研究内容 |
| 第二章 面向核移植操作的视觉系统的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 核移植操作系统的组成结构 |
| 2.2.1 核移植操作流程 |
| 2.2.2 核移植操作系统的构成 |
| 2.3 显微视觉系统的功能分析 |
| 2.4 视觉系统的建立 |
| 2.4.1 显微成像系统的建立 |
| 2.4.2 图像处理算法的需求 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 透明带厚度测量与目标识别定位 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 透明带厚度的自动测量 |
| 3.2.1 透明带厚度测量方案 |
| 3.2.2 透明带外边界的识别 |
| 3.2.3 透明带内边界的识别 |
| 3.2.4 透明带的厚度测量 |
| 3.3 基于偏振光系统的卵母细胞与核物质的定位 |
| 3.3.1 卵母细胞的定位 |
| 3.3.2 核物质的定位 |
| 3.3.3 卵母细胞及核物质的定位结果与分析 |
| 3.4 核供体细胞的识别与定位 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于ORB算法的注射针实时追踪方法 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 基于模板匹配法的注射针追踪 |
| 4.2.1 注射针模板的自动获取 |
| 4.2.2 注射针追踪结果与分析 |
| 4.3 基于ORB算法的注射针追踪 |
| 4.3.1 ORB算法原理 |
| 4.3.2 注射针追踪方案 |
| 4.3.3 注射针追踪实验结果与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 核移植操作中目标识别与追踪的实验研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 透明带厚度测量实验及应用 |
| 5.2.1 透明带厚度测量实验 |
| 5.2.2 透明带厚度测量方法的应用 |
| 5.3 卵母细胞固定与位姿调整 |
| 5.4 卵母细胞的去核操作 |
| 5.5 卵母细胞注核 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（7）面向核移植的卵母细胞显隐性结构图像融合技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题研究的背景和意义 |
| 1.2 核移植辅助技术研究现状 |
| 1.3 课题主要研究内容 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 卵母细胞隐性结构成像机理 |
| 2.1 卵母细胞隐性结构特征与功能 |
| 2.1.1 细胞骨架结构与功能 |
| 2.1.2 透明带结构与功能 |
| 2.1.3 纺锤体结构与功能 |
| 2.2 卵母细胞隐性结构成像原理 |
| 2.3 卵母细胞“显隐性”结构成像分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 卵母细胞图像融合算法研究 |
| 3.1 卵母细胞源图像信息特征分析 |
| 3.2 卵母细胞图像配准方法研究 |
| 3.2.1 图像配准的目的和方法 |
| 3.2.2 卵母细胞图像配准方法 |
| 3.2.3 倒置显微图像与偏振光图像配准 |
| 3.3 卵母细胞图像融合方法研究 |
| 3.3.1 图像融合的方法和意义 |
| 3.3.2 倒置显微图像与偏振光图像融合方法研究 |
| 3.3.3 倒置显微图像与偏振光图像融合与结果评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 卵母细胞显隐性结构信息融合实验研究 |
| 4.1 实验平台介绍 |
| 4.1.1 Abrio圆形偏振光显微成像系统 |
| 4.1.1.1 偏振光成像原理 |
| 4.1.1.2 Abrio偏振光成像系统 |
| 4.1.2 Nikon Ti-E生物倒置显微系统 |
| 4.1.2.1 倒置显微镜系统成像原理 |
| 4.1.2.2 Nikon Ti-E生物倒置显微镜成像系统 |
| 4.2 卵母细胞倒置显微图像与偏振光图像融合算法 |
| 4.2.1 卵母细胞融合算法流程 |
| 4.2.2 卵母细胞显隐性结构信息融合算法 |
| 4.2.3 细胞显隐性结构信息融合结果及分析 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 卵母细胞细胞核定位与ZPT测量 |
| 5.1 卵母细胞细胞核定位 |
| 5.1.1 卵母细胞细胞核定位算法 |
| 5.1.2 定位结果分析 |
| 5.2 卵母细胞ZPT测量 |
| 5.2.1 卵母细胞透明带厚度ZPT测量算法 |
| 5.2.2 透明带厚度ZPT测量分析 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（8）小鼠卵母细胞去核方法的改进（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 实验操作条件 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 小鼠超数排卵与MⅡ期卵母细胞采集 |
| 1.3.2 卵母细胞显核与去核 |
| 1.3.3 供核细胞的准备 |
| 1.3.4 去核卵母细胞注核 |
| 1.3.5 重构胚的激活和体外培养 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同去核方法对小鼠卵母细胞的去核效果 |
| 2.2 不同去核方法对重构胚后续发育的影响 |
| 2.3 操作液中添加不同浓度FBS对核移植重构胚发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（9）梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 梅花鹿的繁殖特点及繁育生物技术 |
| 1.1.1 梅花鹿的繁殖特点 |
| 1.1.2 梅花鹿的繁育生物技术 |
| 1.2 水貂、蓝狐及貉的经济价值与繁育生物技术 |
| 1.2.1 水貂的经济价值与繁育生物技术 |
| 1.2.2 蓝狐和貉的经济价值与繁育生物技术 |
| 1.3 异种体细胞核移植技术研究进展 |
| 1.3.1 ISCNT 研究历史 |
| 1.3.2 ISCNT 关键技术环节 |
| 1.3.3 ISCNT 的研究意义 |
| 1.3.4 ISCNT 研究存在的问题 |
| 1.4 本研究的内容、目的及意义 |
| 1.4.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞培养及冷冻保存 |
| 1.4.2 牛卵母细胞体外成熟培养条件的优化 |
| 1.4.3 梅花鹿-牛 ISCNT 技术方法的研究 |
| 1.4.4 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备 |
| 第二章 供核细胞培养及冷冻保存 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 试验设计 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的生长特性 |
| 2.2.3 DMSO 和甘油对不同供核细胞的冷冻保护效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的培养 |
| 2.3.2 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的纯化 |
| 2.3.3 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 牛卵母细胞体外成熟体系的优化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 测定指标与评定方法 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同激素组合对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.2 BCB 染色优选牛卵母细胞体外成熟 |
| 3.2.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 激素对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.2 BCB 染色对牛卵母细胞体外成熟的作用 |
| 3.3.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 梅花鹿-牛 ISCNT 技术研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.4 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 DEME 诱导牛卵母细胞显核的研究 |
| 4.2.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作的研究 |
| 4.2.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养的研究 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 DEME 处理对牛卵母细胞显核的影响 |
| 4.3.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作 |
| 4.3.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 试验设计 |
| 5.1.4 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响 |
| 5.2.2 共培养对毛皮动物-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响 |
| 5.3.2 共培养对水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 研究的创新点 |
| 6.3 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）小鼠卵母细胞的孤雌激活及体细胞核移植方法的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 细胞核重编程的相关理论 |
| 2 哺乳动物体细胞核移植的方法 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植技术存在的问题 |
| 4 体细胞克隆技术的意义与应用前景 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 小鼠卵母细胞孤雌激活方法的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 小鼠体细胞核移植方法的蹄选 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 小鼠胚胎的输卵管移植技术的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的主要论文 |
四、A method for mouse oocyte enucleation assisted with zona pellucida dilating（论文参考文献）
- [1]手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究[J]. 陶瑞鑫,贾超,武恩在,李娟. 畜牧与兽医, 2021(07)
- [2]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [3]不同浓度CB对小鼠纺锤体移植后重构卵的细胞骨架及囊胚发育的影响[D]. 王启航. 河北医科大学, 2020(02)
- [4]马胚胎移植及克隆胚体外构建技术[D]. 张志鹏. 内蒙古农业大学, 2019(08)
- [5]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [6]面向微创核移植显微操作的目标识别与追踪算法研究[D]. 李亚娣. 苏州大学, 2017(06)
- [7]面向核移植的卵母细胞显隐性结构图像融合技术研究[D]. 高萍. 苏州大学, 2015(02)
- [8]小鼠卵母细胞去核方法的改进[J]. 贾洪响,马斌斌,魏强,赵晓娥,孟永芳,谷建锋,马保华. 农业生物技术学报, 2014(09)
- [9]梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究[D]. 王士勇. 中国农业科学院, 2014(10)
- [10]小鼠卵母细胞的孤雌激活及体细胞核移植方法的研究[D]. 许贻索. 扬州大学, 2014(01)