丁学知[1]2006年在《苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究》文中研究说明研究和发展现代植物保护生物技术，确保食品安全，保护生态环境和维护人类健康具有重要意义。近年来，利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)取代有残留杀虫化学农药控制植物害虫，实施生态农业计划，已成为国际上发展的新趋势。但在对提高Bt杀虫毒力、挖掘新的cry杀虫功能基因和研究其蛋白质组学上有待深入进行。本文利用微生物技术，分子生物学技术和蛋白质组学方法，选育出Bt4.0718新菌株，系统研究了cry基因，发现了新的杀虫基因，利用烟草几丁质酶基因tchi B与Bt4.0718菌株的cry1Ac基因重组，获得高效杀虫工程菌。首次对Bt的杀虫功能蛋白质组进行了研究。Bt作为微生物杀虫剂在生产上成功推广和应用，很大程度上取决于高毒力菌株的选育。本研究从湖南不同生态区域采集的858份土样中，分离出30份Bt菌株。从中筛选一株具有典型Bt菌落特征和较高杀虫毒力的701~(2c)为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍(NTG+LiCl)的交替复合诱变，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量和芽孢同伴孢晶体的比例与杀虫毒力密切相关。以此特征为依据进行快速初筛和毒力生测复筛，获得一株高毒力突变杀虫新菌株4.0718。该突变株杀虫毒力与出发菌株相比提高了7.5倍，在6h、12h、和24h内供试小菜蛾叁龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株经连续10代培养稳定遗传。这为高毒力杀虫菌株的选育提供了一种简单和快速的方法。在对4.0718进行单因子培养条件试验的基础上，采用正交设计试验和结合杀虫毒力生测，对该菌株进行发酵试验，获得了最佳发酵条件。Bt菌株的杀虫活性与其携带的编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的cry基因密切相关。通过PCR扩增的产物电泳检测，4.0718含有cry1和cry类杀虫基因，显示出4.0718菌株cry基因类型丰富。将4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶基因tchiB(去掉信号肽和去信号肽再加肠激酶位点)重组，经双酶切和亚克隆，将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315中，分别构建重组质粒pHUAccB6和pHUAccB7，转入E.coli，电转入Bt无晶体突变株XBU001中，获得重组菌株HAccB6和HAccB7。通过液体双相孢晶分离提取后，将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析，双价重组基因与对照cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较，获得高效表达的双价融合蛋白。经定量分析：双价融合蛋白分别占总蛋白量的62.5％；Cry1Ac蛋白占蛋白总量的42.0％。经原子力显微镜和电子显微镜观察，表达后的融合蛋白呈菱形和椭圆形晶体，其规格约为1.5×3.0μm。经生测分析，两株工程菌HAccB6和HAccB7的重组基因表达的融合晶体蛋白二者在毒力上比较接近，而与对照工程菌HAc5和野生菌4.0718相比较，速杀时间提前36h。工程菌HAccB6对棉铃虫(Heli coverpa armigera)具有高效杀虫活性，其72h LC_(50)值为9.10μg／mL，为对照菌杀虫毒力的4.529倍。结果显示出tchiB基因与cry1Ac基因重组后的表达产物具有显着的杀虫增效作用。首次对Bt杀虫晶体蛋白质进行了研究。用液体双相法和等电点沉淀法纯化晶体蛋白，结合用2-DE分离的蛋白质进行质谱鉴定，确定了伴孢晶体蛋白总蛋白质的提取方法，获得了更清晰、分辨率更高和聚焦效果更好的2-DE图谱，建立了Bt晶体蛋白的双向电泳方法。对分别属于Bt的3个不同亚种的库斯塔克亚种4.0718、武汉亚种140菌株和以色列亚种H14菌株及相关工程菌株HAccB6和HAccB7的晶体蛋白质进行了系统的研究。工程菌HAccB6和HAccB7菌株分别检测到356±9和400±11个，其中两者129个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为30％。等电点沉淀法双向电泳(2-DE)图谱中检测到90±9和193±11个蛋白质斑点数，其中两者的80个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为40％，说明两者在毒力以及杀虫谱上的相似性和差异性。对2-DE胶上大部份蛋白质点进行了质谱分析，鉴定出各菌株的晶体蛋白成份中的7类功能蛋白质，即杀虫毒蛋白(Cry1Ac、Cry2Aa、CryIG，CryH2，Cry1Ab16，Cry2Ac_2)、晶体形成相关结构蛋白(伴侣蛋白dnak)、蛋白质折迭和组装的重要调节者热休克蛋白H_(SP)60，物质代谢酶类(分支链氨基酸转氨酶、烯醇酶、丙酮酸脱氢酶复合物E3)、蛋白质合成因子(ATP合成酶F1、ATP合成酶β-链、β-内酰胺酶、翻译延长因子Ts、Tu、G)、延长因子EF-Tu和EF-Ts、假想蛋白、转运蛋白(ABC transporter ATP-binding protein)、和蛋白引发因子(Trigger factor)等。从研究的Bt菌株中都鉴定有HSP-60，翻译延长因子Tu这两种蛋白，认为这两种蛋白很可能为晶体形成相关的重要蛋白，且杀虫晶体蛋白在结构与杀虫活性功能上的关系密切。这些表达谱和功能蛋白质组的研究将有助于对杀虫晶体蛋白杀虫机理的理解。特别是在Bt武汉亚种中新发现了Cry2Ac6蛋白。晶体蛋白种类的不同则有助于解释4.0718菌株高效杀虫的生化功能特征。结合利用CPHmodles、Ds ViewerProTrial和Swiss-Pdb Viewer软件，发现新型的Cry2Ac6与Cry2Aa的毒性核心片段空间结构有一定差异。说明与昆虫中肠受体蛋白结合的亲和力不同，引起其在杀虫毒力上的差异。总之，本项研究为苏云金芽孢杆菌高毒力杀虫菌株的选育、发酵条件、cry基因与外源毒素基因重组及亚种间功能蛋白质组学研究提供了一系列的方法和可借鉴的研究思路，鉴定了与杀虫毒力相关的cry基因及其功能蛋白质组，创新性研究了不同原毒素分子结构与杀虫活性之间的内在规律及其与昆虫细胞受体结合机制的信息。
罗朝辉[2]2007年在《苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因与烟草几丁质酶tchiA21基因的重组表达及功能研究》文中研究说明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物，苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋自结构和作用机制是目前国内外研究的一个热点；但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，因此在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上，通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。本研究利用苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchi21基因重组获得高效杀虫工程菌株XBU-HUAccB5。从研究室保存的菌株Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)出发，通过设计引物Ac-F／Ac-R和ter-F／ter-R，以其质粒为模版PCR扩增cry1Ac基因及cry1Ac基因的终止子下游序列，设计引物chi-F／chi-R从含有烟草几丁质酶cDNA的质粒中PCR扩增tchi21基因，用NcoⅠ酶切上述两步的PCR产物，回收两个酶切片段进行连接，以连接产物为模板，用chi-F／ter-R引物对扩增融合chi-ter片段，利用构建含Bt 4.0718菌株的cry1Ac基因质粒pUAc19和融合chi-ter片段用BglⅡ和SmaⅠ酶切、回收、连接，构建中间载体质粒pUAccB19，同时将质粒pUAccB19和穿梭表达载体pHT315用SalⅠ／SmalⅠ酶切，回收其目的片段，构建表达载体质粒pHUAccB5，将表达载体pHUAccB5电转化无晶体突变株XBU001获得重组菌株XBU-HUAccB5。对工程菌株XBU-HUAccB5经SDS-PAGE和Western blotting分析：工程菌株分别表达了130 kDa的Cry1Ac蛋白，同时还表达了30 kDa的几丁质酶蛋白，经Western blotting检测，工程菌株XBU-HUAccB5的Cry1Ac蛋白和几丁质酶的表达得到证实，经原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)观察显示，工程菌株XBU-HUAccB5产生晶体蛋白呈有规则的菱形；在对发酵液的几丁质酶酶活性检测中，无晶体突变株在的酶活发酵过程中一直保持在1.5U／ml，工程菌XBU-HUAccB5的几丁质酶酶活一直呈上升的趋势，在72h时达到最高峰为7.5U／ml，是无晶体突变株的5倍，几丁质酶活变化趋势与工程菌的生长曲线一致。生测结果显示：工程菌HTX-42(cry1Ac单价基因转XBU001)对初孵棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)在48h的LC_(50)是117.7780μg／ml，72h的LC_(50)是89.8691μg／ml；工程菌XBU-HUAccB5(cry1Ac与几丁质酶tchi21双价基因转XBU001)对初孵棉铃虫在48h的LC_(50)是10.4240μg／ml，72h的LC_(50)是4.7904μg／ml。工程菌XBU-HUAccB5比工程菌HTX-42对棉铃虫的生测毒力处理在48h时高11.30倍，在72h高18.76倍。结果表明在72h内随着时间的延长，几丁质酶协同Cry1Ac杀虫的效果越显着。本研究已成功构建cry1Ac基因和tchi21基因融合的Bt工程菌，这对进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株，研制出超效、广谱、安全的杀虫剂，以克服Bt杀虫剂存在的杀虫毒力低、易产生抗性等问题的研究提供了新的技术途径。
张何[3]2003年在《苏云金芽孢杆菌4.0718菌株杀虫晶体蛋白基因的克隆及表达研究》文中研究指明本研究对我室选育的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)4.0718菌株(国家菌种保藏号：CCTCC NO．200016)携带的P1-P4号质粒用cryⅠ通用引物Unl(d)和Unl(r)进行了PCR分析，并对23kb的P1质粒进行了cryⅠ类基因的PCR-RFLP分析。同时采用生物信息学方法分析了GenBank上公布的cry1Ac基因序列。根据cry1Ac基因启动子上游的同源序列以及终止子下游的同源序列设计了一对引物，通过PCR扩增出一个4.2kb的片段，用PCR-RFLP检测证明包含有cry1Ac基因，并将PCR片段克隆到pUCm—T载体，然后亚克隆到E．coli-B．thuringiensis穿梭载体pHT304上，并在E．coli DH5α中表达出了130kD的原毒素，另外还电转化了无晶体突变株。 实验结果如下： 1．质粒的PCR鉴定 对苏云金芽孢杆菌4.0718菌株携带的P1—P4号质粒分别回收，用cryⅠ基因通用引物Unl(d)和Unl(r)对叁种质粒进行了PCR扩增，P1—P3号质粒都产生了277bp的目的片段，说明这叁个质粒上都带有cryⅠ类基因。采用cry基因PCR-RFLP鉴定方法，合成了相应的PCR引物，以23kb质粒为模板，将扩增出的1.6kb产物回收后用PstⅠ+XbaⅠ双酶切，产生了1117bp、801bp、518bp、322bp四种片段，对照模式基因的PCR-RFLP鉴定图谱，证明了23kb的质粒上携带有cry1Aa基因和cry1Ac基因。 2．cry1Ac基因的克隆 由于Cry1Ac蛋白对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的的高毒杀能力，在构建抗虫工程菌以及抗虫植物方面已经受到了广泛的重视，至今在GenBank上已经登记了14种cry1Ac基因，本研究阵列比较了14种cry1Ac基因的核营酸序列，发现这些序列具有很高的同源性，并且在‘厂刀Ac的启动子上游以及终止子下游同样也具有很高的同源性，根据这些数据设计了一对引物PR一OF一1和PR一OF一2，用以扩增包含“y1Ac上游启动子、‘厂刀月c结构基因以及一下游终止子的片段，PCR结果与预测结果一致，产生了4.Zkb的目的片段，PCR一RFLP分析证明包含了‘了二刀月c基因。 PCR扩增的4.Zkb片段在其3’端带有一个A，用T载体pUCm一T与其连接后转化大肠杆菌，.获得了正向连接的pTCg和反向连接的pTCI_1重组子，质粒酶切以及PCR一RFLP证明了克隆的正确性。用BamH工和SaH将pTCg、pTCn质粒酶切后电泳，试剂盒回收4.Zkb的片段，用一BamH工和Sall同样处理E.。。1z’一thurz’n盯ensz’s穿梭载体pHT304，将两个片段连接后转化E.co1z’DH5Q，得到了重组子pHC34.3.重组子pHc34在大肠杆菌中的表达- 根据改进的表达产物纯化方法培养EHC34菌株提取表达的Cry IAC蛋白，与空白E. eolj DH5a(pHT3O4)表达蛋白的SDS一PAGE图谱对照，发现EHC34菌株产生了1 30kD的原毒素，说明克隆片段在宿主菌中得到了表达.
刘汉军[4]2005年在《hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)的cry基因中cry1类基因的启动子是一类芽孢依赖型启动子,从芽孢形成T_2期开始被激活。虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,简称Hwtx-Ⅰ)是虎纹捕鸟蛛分泌产生的一类乙酰胆碱受体阻断剂,作用于神经肌肉的连接处,能阻断神经肌肉的信号传导,其溶液构象为叁对二硫键和叁股反平行β折叠的抑制剂胱氨酸结构模体。同时,其生物学活性表明也是一种N型Ca~(2+)离子通道的阻断剂。本研究根据已知的Hwtx-Ⅰ氨基酸序列,按照苏云金芽孢杆菌偏爱密码,将氨基酸序列转换成核苷酸序列,并将其基因单价体分片段化学合成。将合成片段磷酸化并退火连接。同时设计一段含有核酸内切酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ位点的衔接子linker,利用这两种内切酶酶切后的粘性末端互补这一特性,可将hwtx-Ⅰ基因头尾串联形成四价体。 带有Bt杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的质粒pUA19经内切酶BsaBI和MunI酶切后,去掉了cry1Ac基因的ORF,只剩下cry1Ac基因的上游启动子序列和下游终止子序列。将设计的linker片段插入此位点,得到pUAK质粒,利用内切酶SpeⅠ和Xba Ⅰ双酶切后将已退火连接好的hwtx-Ⅰ基因插入其中,得到质粒pUKH1。将质粒pUKH1分别用SalⅠ/SpeⅠ 和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH2,将此质粒分别用SalⅠ/JpeⅠ和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH4。将pUKH4用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收1.1kb片段,与同样双酶切的大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的穿梭载体pHT304连接得到表达质粒pXH4。将pXH4分别电转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株XBU001和野生型菌株Bt4.0718中,Hwtx-Ⅰ四价体在苏云金芽孢杆菌转化子中得到表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白摇瓶发酵表达量达到14.0mg/L。目的蛋白在XBU001的重组子UH04中占可溶性蛋白总量的11.48%,在Bt4.0718的重组子Bh4-4中占可溶性蛋白总量的4.51%。生测结果显
龙小山[5]2005年在《苏云金杆菌cry1Ac基因与神经毒素基因hwtx-Ⅰ的融合克隆表达及其融合蛋白活性研究》文中认为在苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)应用研究上,主要利用基因工程技术来构建更高毒力的重组蛋白和重组菌株,如定点突变研究,融合基因研究,转基因植物研究等方面的研究。为了构建更高毒力,杀虫谱更广的工程菌株,本研究利用crylAc基因和神经毒素基因hwtx-Ⅰ构建融合基因来提高晶体蛋白的杀虫毒力。 采用生物信息学方法比较crylAc基因序列的同源性,通过设计引物对Ac-F和Ac-R从Bt4.0718菌株质粒上扩增含有上游启动序列的crylAc基因的片段,然后用Bt菌株偏爱密码子优化设计虎纹毒素-Ⅰ基因(hwtx-Ⅰ)和肠激酶位点序列(Enterokinase site简称ErK site),然后进行化学合成。对合成片段进行磷酸化退火连接,设计引物对Ltx-F和Ltx-R扩增完整的hwtx-Ⅰ和ErK site的片段。然后将这两个片段进行连接,用引物对Ac-F和Ltx-R扩增出融合基因片段,经一系列酶切和亚克隆,将带有上游启动序列和下游终止序列的融合基因片段克隆进穿梭载体pHT304中,获得表达载体pXL43。将表达载体pXL43分别电转化进无晶体突变株XBU001获得重组菌株XL002和野生型菌株Bt4.0718中获得重组菌株XL004。 经SDS-PAGE分析:融合基因在无晶体突变株中得到大量表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白占总蛋白量的61.38%。将重组菌株XL002经发酵并纯化重组晶体蛋白,经原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)观察显示:融合晶体蛋白呈有规则的菱型晶体,其大小约为1.0×2.0μm。生测结果显示:融合晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)有高效杀虫活性,生测2d的Lc_(50)值为5.12μg/ml。从融合晶体中提取20kb-DNA,并进行PCR鉴定,进一步证明晶体中20-kbDNA片段部分来自于质粒。还对重组菌株XL004进行了SDS-PAGE和生测分析,并对融合基因在重组菌株中表达进行了探讨。本研究通过成功构建crylAc基因和hwtx-Ⅰ基因的融合基因,为构建Btcry基因和其它外源毒素基因的融合基因以及构建高毒力的工程菌株奠定
付祖姣[6]2004年在《苏云金杆菌晶体中20-kb DNA与质粒及染色体的序列相关性研究》文中研究表明本研究通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)伴孢晶体中20-kb DNA上含有的crylAc基因进行克隆和表达，发现20-kb DNA上存在晶体蛋白基因的全长编码序列。为了进一步分析含有cry基因的20-kbDNA片段的来源，本研究利用PCR和Southern杂交技术对Bt4． 0718菌株的质粒与染色体上cry基因的分布情况进行检测，发现质粒和染色体上的部分DNA序列与伴孢晶体中20-kb DNA的核酸序列具有很大的相关性，它们均含有cry基因，而且所含cry基因的类型也一致，这为证明Bt中的20-kbDNA来源于质粒或染色体提供了直接的序列依据。1． Bt4． 0718菌株伴孢晶体中20kb DNA上crylAc基因的克隆和表达根据GenBank中crylAc基因的核酸序列设计引物，以Bt 4． 0718菌株伴孢晶体中的20-kb DNA为模板，扩增含有上游启动序列和下游终止序列的全长crylAc基因，将其与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组菌株DH5α／pTAc4。对重组质粒pTAc4进行BamHI／SalI双酶切，然后将含有crylAc基因的4． 2kb的酶切片段克隆到Bt-E．coli穿梭载体pHT304中，得到重组质粒pHAc4。再将pHAc4导入Bt无晶体突变株XZM-101，获得XZM-101／pHAc4。利用原子力显微镜对该重组菌株的发酵液进行观察，发现了典型的双金字塔型晶体。SDS-PAGE检测到XZM-101／pHAc4能产生130kD的蛋白质。生测结果表明，该重组菌株对小菜蛾(Plutella xylostella)有毒杀作用。2． Bt4.0718菌株中cry基因的定位提取Bt4． 0718菌株的质粒，同时采用脉冲电泳分离该菌株染色体的酶切片段，并将凝胶中的质粒DNA和染色体酶切片段分别转移至Hybond-N+尼龙膜上。利用地高辛对crylAc基因保守区段的1． 6kb PCR产物进行标记，以此为探针分别与质粒和染色体的酶切片段进行Southem杂交。杂交结果显示在Bt 4.0718的质粒和染色体均存在cry基因。3.Bt 4.0718菌株染色体上cr，基因的鉴定 采用脉冲电泳分离Bt 4.0718菌株的染色体，将染色体DNA带从凝胶上切下，利用透析袋电洗脱法回收染色体DNA，经Sall酶切后作为模板，进行PcR扩增。首先利用cryl、c叫基因的通用引物进行检测，获得预期的277bp和689bp的PcR产物。随后用cryl、cryZ基因的特异引物进行PCR扩增，分别获得1600bp与1200bp左右的PCR产物。对其进行限制片段长度多态性(RFLP)分析表明，Bt 4.0718菌株染色体上含有cryIAa、c尽了A。、cryZAa、cryZAb基因。
刘全兰[7]2002年在《苏云金杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白基因研究与克隆》文中指出苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)4.0718菌株(CCTCC NO．200016)对小菜蛾(Plutella xylostella)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等鳞翅目昆虫具较高毒性，本研究分离并提纯了其杀虫晶体蛋白基因；运用PCR方法分析4.0718菌株的基因型，并进行了克隆。 实验结果如下： 采用改进的Triton X-100温和裂解法进行趴4.0718菌株的质粒DNA的抽取，取得较理想效果。用0.6％TritonX-100和1 mol／L NaCl的混合液处理菌体，90min的裂解时间效果为好。提取的质粒DNA受到的损伤小，并且酶的抑制剂含量也较少。在0.5％琼脂糖凝胶电泳中，质粒DNA分离相当清晰。Bt 4.0718菌株含有4个大小不等的质粒，依据其分子量大小顺序依次编号为P_1、P_2、P_3和P_4。 采用几种不同的方法回收4.0718菌株的质粒DNA，主要有制备档板挖孔的方法、液氮冻融法和低熔点琼脂糖法。实验中对这叁种回收方法进行了不同程度的改进，使它们皆可高质高效的回收Bt 4.0718菌株质粒DNA，基本不受DNA分子长度和量的限制。 目前研究表明，苏云金杆菌cry1、cry2和cry3类基因编码的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs或Cry蛋白)对鳞翅目昆虫有毒性，并且我室的Bt 4.0718菌株对鳞翅目昆虫有较强毒性。对ee;lba:Ik中eryl一、cryZ一和Cry3一型基因的高度保守区进行同源序列比较，设计了3对通用引物cryl〔U;:l(d)/U，飞一(r)]、eryZ[UnZ(d)/UllZ(r)]和ery3〔U，飞3(d)/U;飞3(，·)]。并根据eryl一和cryZ一型基因的高变区设计特异引物:55、!，11/s3t川l(e ryl人a，ery1Ab，ery1Ac，cry1B，ery1Ca，℃ry1Cb)和SsunZ/s3unZ(cryZAa，cryZ人b，cryz人e)。PCR扩增结果表明质粒P4没有杀虫晶体蛋白基因，质粒P、、p，和p3在用eryl[Unl(d)/Unl(r)]和cryZ【UnZ(d)/UnZ(r)」两对引物扩增时分别产生了277bp和689bp的产物，分别对应cryz一和cryZ一型基因;通用引物cry3[U，13(d)/U，13(r)]没有扩增出DNA片段，说明质粒中不存有cry3型基因。为了对4.07 18菌株的亚类基因型进行精细分析、必须进一步的PCR鉴定。质粒P，用特异引物扩增出1641、1623、1219bp和1471bp的DN八片段，分别对应于cryzAc、cry1Cb、cryZAc和新的Cry基因(暂定名为ery4.5基因)。质粒PZ扩增出的PeR产物大小是1 6 35、1 6 23和1 2 1 gbp，分别对应于ery1Aa、ery1Cb和cryZ八c基因。质粒P3扩增出1623、一557和1219bp的产物，分别对应于ery1Cb、erylAb和eryZAe基因。PCR扩增的数据表明，4.0718菌株含有多个与Cfy家族有关的杀虫基因。即含有cry1Aa、cryl^b、cry1Ac、cry1Cb、cryZ入c和新的cry基因 (。ry4.5基因)等基因型。像Bt 4.0718菌株这样基因类型含量丰富的Bt，国内外报道尚少，这证明Bt 4.0718菌株有重要的研究价值和应用价值。 实验中采用山lljll/Pstl双酶切质粒DNA，寻找携带新基因的片段。发现新基因cry4.5在4.skb酶切片段上，另外还有一5.okb片段携带cry基因。分别回收两片段，将它们与双功能载体nllT3叫进行重组，转化感受态细胞丑coj j Dll sa。通过蓝/白斑显色反应和重组质粒酶切鉴定获得重组子pB t4。
宋晟[8]2005年在《苏云金杆菌4.0718新菌株与库斯塔克亚种HD-1菌株杀虫晶体蛋白的蛋白质组研究》文中研究说明本室选育的苏云金杆菌4.0718新菌株与库斯塔克亚种HD-1比较,杀虫谱相似,但毒力更强,在生产应用中表现出高效、快速的杀虫特点。为了比较研究苏云金杆菌4.0718新菌株与库斯塔克亚种HD-1的杀虫晶体蛋白,了解杀虫晶体蛋白与杀虫活性之间的内在联系以及深入研究杀虫晶体蛋白的结构功能关系。根据苏云金杆菌杀虫晶体蛋白疏水性强含二硫键多的特性,设计了五种裂解液,并对上样量、聚焦时间等相关技术进行了比较研究和条件优化,获得了分辨率重复性较好的双向电泳银染图谱。结果显示,蛋白点主要分布在等电点4-7,分子量10-130 kDa的区域。运用PDQUEST软件对扫描后的Bt 4.0718和HD-1的2-DE图谱进行斑点检测,斑点匹配和量化,分别检测到122±9个和126±11个蛋白质斑点数,其中两者有64个蛋白质斑点相互匹配,发现8个蛋白质斑点只在HD-1的2-DE图谱中检测到,6个蛋白质斑点只在Bt 4.0718的2-DE图谱中检测到,有11个蛋白质斑点在含量上有显着变化,初步反映了它们在毒力以及杀虫谱上的相似性和差异性。对部分蛋白质斑点测定胶内酶解后的肽质量指纹图谱,MASCOT软件查询SWISS-PROT数据库,获知苏云金杆菌4.0718菌株与库斯塔克亚种HD-1菌株的杀虫晶体蛋白中均含有对鳞翅目幼虫有高毒力的蛋白Cry1Ac和对鳞翅目和双翅目幼虫都有毒力的蛋白Cry2Aa。其中Bt 4.0718表达的Cry1Ac含量较HD-1高,而HD-1表达的Cry2Aa含量较Bt 4.0718高,这两种杀虫晶体蛋白在量上的差异与菌株杀虫活性密切相关。结合CPHmodles,Ds ViewerProTrial和Swiss-PdbViewer软件分析Cry1Ac毒性核心片段发现Cry1Ac与Cry1Aa的毒性核心片段空间结构基本一致,但在Domain Ⅱ loop2、Domain Ⅲ(~(486)IHFPSTS~(492))处存在显着差异,说明两者与中肠受体蛋白结合的亲和力不同,导致其在杀虫毒力上的差异。
胡宏源[9]2004年在《苏云金杆菌伴孢晶体20-kb DNA中cry1Ac基因的高效表达和生物活性研究》文中研究表明已经证实苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)伴孢晶体中结合有20-kb DNA，但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体，从中抽提出与其结合的20-kb DNA。经Nde Ⅰ酶切消化后亚克隆构建文库，利用PCR-RFLP及测序，筛选出含cry1Ac基因的转化子，然后设计引物通过PCR扩增出cry1Ac基因的ORF，并与pET30a连接，转化Ecoli BL21(DE3)，高效表达了141 KD蛋白，表达蛋白占总蛋白量的50％以上，且90％以上以包涵体形式存在。 利用穿梭载体pHT304构建表达质粒pHTX42，电转化Bt无晶体突变株XBU001，获得重组菌株HTX42，经SDS-PAGE分析，cry1Ac基因得到强表达，蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28％，且其在细胞中累积达细胞干重的64.13％，这种产量比文献报道的25％左右增高了一倍以上。 原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)检测显示，目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小，而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体，大小约为1.2×2.0μm。生测结果显示，包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)叁龄幼虫均有高效杀虫活性，其中包涵体以2d的LC_(50)为20.5 μg/ml，晶体以2d的LC_(50)为6.25 μg/ml。从ETX35菌株的包涵体和HTX42菌株的晶体中分别抽提DNA，并进行PCR鉴定，证明其中的20-kbDNA片段具有序列多态性。 本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20-kbDNA分子的来源、结构和功能奠定了重要的基础。
付祖姣[10]2008年在《苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建》文中认为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)4.0718菌株是新筛选的一株高毒力菌株,现已成功用于商业化生产。该菌株在芽胞形成的同时能够产生菱形和方形两种晶体,对棉铃虫(Helicoverpa armigera)等农业害虫表现出高效杀虫活性。为了全面阐述该菌株高效杀虫的背景,更好地利用该菌株进行生物杀虫剂的开发,本研究系统分析了Bt 4.0718菌株的杀虫基因型及表型,包括质粒带型、杀虫基因类型和晶体蛋白类型的研究。结果显示,Bt 4.0718菌株在质粒带型和蛋白带型上是一个独特的Bt新菌株。PCR检测发现该菌株含有5种cry基因,包括cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa、cry2Ab和cry1Ia基因,同时含有vip3A和几丁质酶基因。采用SDS-PAGE和液质联用质谱仪(LC-MS/MS)分析Bt 4.0718菌株的晶体蛋白,鉴定到该菌株的130 kD蛋白由Cry1Aa和Cry1Ac原毒素组成,而65 kD的蛋白由Cry2Aa原毒素组成。为了更快地筛选具有新的杀虫特性的Bt菌株或杀虫晶体蛋白,本研究创新性地建立了一种对Bt原毒素表达谱进行鉴定的新方法,即通过包埋Bt菌株产生的晶体蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝胶块中,结合LC-MS/MS分析胶内酶解的复合肽段,从而快速鉴定晶体蛋白中原毒素的组成。本研究首先以模式菌株Bt库斯塔克亚种(Bt subsp.kurstaki)HD1菌株为对象,采用该方法检测HD1菌株晶体蛋白的组成。结果显示,采用聚丙烯酰胺凝胶块结合LC-MS/MS技术能准确检测到HD1菌株中表达的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa蛋白。同时,本研究以杀虫基因背景很清楚的Bt以色列亚种(Bt subsp.israelensis)4Q2-72和鲇泽亚种(Bt subsp.aizawa)HD133菌株为研究对象,检测到4Q2-72菌株表达了Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、cyt1Aa和Cyt2Ba等6种晶体蛋白,而HD133也表达了Cry1Ab、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Ba、Cry1Ad和Cry1Ka 6种原毒素,其中后两种原毒素还未在任何文献中见报道。这些实验结果证实了该种原毒素检测方法是一种新型的鉴定Bt原毒素表达谱的方法,具有直接、快速、准确的特点。该方法将有力推动Bt菌株的筛选工作,对于其它生物组织的蛋白质组学分析也具有重要的参考价值。为了获得毒力更高和杀虫谱更广的Bt菌株,扩展Bt杀虫剂在农林害虫防治上的应用,本研究采用分子生物学手段将Bt cry1Ac基因与来源于虎纹捕鸟蛛的具有蛋白酶抑制剂活性的基因hwtx-11融合,构建了系列工程菌,并成功地在大肠杆菌和Bt无晶体突变株中检测到了Hwtx-11和融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11的表达。通过检测工程菌发酵产物对甜菜夜蛾和棉铃虫初孵幼虫的生物活性,发现Hwtx-11对甜菜夜蛾有明显毒力,且明显减慢了甜菜夜蛾的生长速度,融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11对两种靶标昆虫表现出比Cry1Ac蛋白更高的杀虫毒力。本研究为构建具有不同杀虫特性的融合蛋白以及构建高毒力的工程菌株奠定了重要基础。
参考文献：
[1]. 苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究[D]. 丁学知. 湖南农业大学. 2006
[2]. 苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因与烟草几丁质酶tchiA21基因的重组表达及功能研究[D]. 罗朝辉. 湖南师范大学. 2007
[3]. 苏云金芽孢杆菌4.0718菌株杀虫晶体蛋白基因的克隆及表达研究[D]. 张何. 湖南师范大学. 2003
[4]. hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究[D]. 刘汉军. 湖南师范大学. 2005
[5]. 苏云金杆菌cry1Ac基因与神经毒素基因hwtx-Ⅰ的融合克隆表达及其融合蛋白活性研究[D]. 龙小山. 湖南师范大学. 2005
[6]. 苏云金杆菌晶体中20-kb DNA与质粒及染色体的序列相关性研究[D]. 付祖姣. 湖南师范大学. 2004
[7]. 苏云金杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白基因研究与克隆[D]. 刘全兰. 湖南师范大学. 2002
[8]. 苏云金杆菌4.0718新菌株与库斯塔克亚种HD-1菌株杀虫晶体蛋白的蛋白质组研究[D]. 宋晟. 湖南师范大学. 2005
[9]. 苏云金杆菌伴孢晶体20-kb DNA中cry1Ac基因的高效表达和生物活性研究[D]. 胡宏源. 湖南师范大学. 2004
[10]. 苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建[D]. 付祖姣. 湖南师范大学. 2008
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